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专利名称：整合素αVβ₃检测试剂盒及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种子宫内膜容受性指标的检测方法，尤其是提供了一种应用免疫胶 体金技术研制的整合素α νβ 3检测试剂盒，同时还公开了其制备方法，属于疾病检测技术 领域。
背景技术：
体外受精-胚胎移植(IVF-ET)治疗不孕症以来，人类辅助生殖技术(ART)得到飞 速发展，但胚胎着床成功率提高并不明显。子宫内膜容受性是胚胎着床的一个重要因素，在 不孕症患者的治疗过程中，了解子宫内膜的容受状态，对IVF-ET治疗方案的制定有重要 的指导意义。判断子宫内膜容受性的金标准是子宫内膜活检，但由于这是一项侵入性检查 而限制了其在IVF-ET周期中的应用。超声参数与激素水平对子宫内膜容受性的评价还不 十分准确。因此目前需要一个合理的评价标准预测子宫内膜容受性，为IVF-ET提供治疗指 导。整合素α Vi3 JintegrinaVii3)是评价子宫内膜容受性的一个可靠的分子指标，整合 素α νβ3检测试剂盒的研制及临床实验的开展，将推动整合素0￥03在1￥ 41~中广泛应 用，从而提高IVF-ET的成功率，具有广阔的市场前景。目前检测整合素α νβ 3的方法包括免疫组化、ELISA、Western blot等，可用于科 学研究，但用于临床则存在很多弊端，如操作程序复杂，时间较长等。

发明内容
本发明公开一种整合素α νβ 3检测试剂盒，用于评价子宫内膜容受性。本发明还提供了整合素α νβ 3检测试剂盒的制备方法，适用于工业化生产。本发明提供的整合素α V β 3检测试剂盒，在硝酸纤维素膜的两端分别设有金标垫 和吸收垫，金标垫上端为样品垫，金标垫包被有纯化的整合素α V β 3抗体胶体金偶联标记 物，检测线包被有纯化的整合素α νβ3抗体，质控线包被有正�？剐∈驣gG抗体，质控线侧 贴有吸收垫。本发明整合素α νβ3检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤
本发明根据抗原抗体能特异结合的免疫学基本原理，将纯化的整合素α Υβ 3抗体用胶 体金标记，喷点于玻璃纤维膜上制备成金标垫，将纯化的整合素α νβ 3抗体和正�？剐∈� IgG抗体分别包被在硝酸纤维素膜(NC膜)上的检测线处和质控线处，当被检样品中含有整 合素α ￥日3抗原时，则于金标垫与胶体金标记的整合素α νβ3抗体结合，并在吸收垫的作 用下，向前渗透泳动，与检测线上的整合素α V β 3抗体再次结合，出现肉眼可见的色带。本发明试剂盒的使用方法如下取宫腔冲洗液标本约Iml超声粉碎处理后加入小 试管中，然后插入试纸条，待1-2分钟反应带清晰后观察结果(见图2)。出现1条红色(对 照)沉淀线，诊断为阴性；出现2条红色(样品和对照)沉淀线，诊断为阳性，未出现沉淀线 则为无效。本发明的积极效果在于首次应用免疫胶体金技术制备整合素α Υβ 3检测试剂盒，并拟应用于临床，以推动整合素α νβ3在临床的广泛应用，提高对子宫内膜容受性判 断的准确性，可以快速，灵敏检测特定蛋白，避免了复杂的操作，无需特殊检测仪器，结果 易于观察判断，可以适应多种检测环境，以及多种检测需要。并且检测结果可以长期保存， 便于对照分析。可用于肉眼水平的免疫检测，样本用量极�。�对操作者无毒性，对环境无污 染等。因此应用胶体金技术研制整合素α 检测试剂盒具有重大的社会意义和广阔的 市场前景。


图1.整合素α νβ3检测装置示意图；(Α:纵切图；B 平面图)
1.样品垫；2.金标垫；3.硝酸纤维素膜；4.吸收垫；5.检测线；6.质控线； 图2.整合素α νβ 3试剂盒检测结果判定。
具体实施例方式通过以下实施例进一步举例描述本发明，并不以任何方式限制本发明，在不背离 本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改 动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。实施例1
根据图1所示，整合素α νβ3检测试剂盒由经过处理的样品垫1、金标垫2、硝酸纤维 素膜3、检测线5、质控线6和吸收垫4组成，其中，金标垫2包被有纯化的整合素α νβ 3抗 体胶体金偶联标记物，检测线5包被有纯化的整合素α νβ 3抗体，质控线6包被有正�？� 小鼠IgG抗体，质控线6侧贴有吸收垫4。实施例2
1、胶体金颗粒的制备取1%氯金酸溶液1ml加99 ml超纯水成终浓度0. 01%的氯金 酸溶液，加热沸腾后，取1%柠檬酸三钠1. 6 ml 一次性迅速加入煮沸的氯金酸溶液中，继续 加热至溶液由淡黄色转为蓝黑色最终变为亮红色，颜色稳定后继续加热5 min，室温冷却， 补充失水至原体积。在透射电镜下观察，可见金颗粒大小基本一致，分布均勻。测量100个 胶体金颗粒直径，计算平均直径约20nm。
2、免疫胶体金复合物的制备目测法确定胶体金与整合素^乂^抗体用量比例。用 0. 1 mol/L的碳酸钾溶液调节胶体金溶液的pH至8. 2，取11支洁净试管，每管分装胶体金 溶液(1 ml/管)。将整合素^￥03抗体逐级稀释后(由0.5yg 5g另设对照管)，顺序 加入一系列装有1 ml胶体金的试管中混勻；5min后，在2 11管内分别加入10%氯化钠 溶液0. 1ml，混勻，室温静置2 h以上观察结果；1号管既不加抗体也不加氯化钠溶液，为对 照管；未加抗体的11号管也为对照(见表1);未加抗体及加入量不足以稳定胶体金的试管， 即呈现由红变蓝的聚沉现象，而加入量达到或超过最低稳定量的试管则保持胶体金的红色 不变。以此使胶体金红色不变而抗体含量最低试管的蛋白量，即为稳定1 ml胶体金的必需 蛋白量，也即最低稳定量。在胶体金标记整合素α νβ3抗体最低稳定量的基础上再加上10 %即为稳定胶体金所需整合素α νβ3抗体的实际所需用量，根据用以标记的胶体金的总量 计算出所需要的整合素ανβ3抗体的总量。在电磁搅拌下，将标准整合素0\^3抗体溶液加入胶体金溶液中，加入整合素α νβ3抗体时应逐滴加入，Img的整合素0\^3抗体大约 5min加完；在磁性搅拌下加入终浓度为1 %的牛血清白蛋白(BSA)。
表1确定胶体金与整合素α νβ 3抗体用量比例
1号管2-10号管11号管胶体金溶液Iml+++整合素α Vg3抗体++-5min10%氯化钠溶液0. Iml-++2h
3、免疫胶体金的纯化采用低温超速离心法纯化金标整合素α νβ 3抗体，以除去溶液 中未标记的整合素α νβ 3抗体和未充分标记的胶体金以及在标记过程中可能形成的各种 聚合物。先将金标整合素ανβ3抗体在4°C下，3000r/min低速离心40min，小心吸取上清 液，弃去沉淀；上清再以10000r/min 4°C离心40min，弃去上清。用0. Olmol/L、pH7. 4的 PBS (内含1 % BSA, 0. 02 %叠氮钠)溶解沉淀至原体积，充分稳定后过夜。再以4°C IOOOOr/ min离心40min，弃上清液。用0. 01mol/L、pH7. 4的PBS (内含1 % BSA, 0. 02 %叠氮钠)溶 解沉淀至原体积的1/10，4°C贮存备用。4、金标垫(结合释放垫)的制备将胶体金标记整合素α νβ 3抗体作1 :5，1 :10，1 50，1 :100,1 :500,1 :1000稀释后，均勻等量浸于同样大小的玻璃纤维素膜制成金标垫。达 到试纸条敏感度要求的最适胶体金复合物的稀释度，为工作浓度。保存液稀释胶体金标记 整合素α Υβ 3抗体原液至工作浓度，均勻浸于玻璃纤维素膜，冷冻真空干燥后密封保存。5、固相硝酸纤维素膜的制备硝酸纤维素膜的实验反应区，定义为检测带，将整合 素ανβ3抗体以直线形包被于检测带，距离检测带5 mm远的质控带(C)以直线形包被正 �？剐∈驣gG抗体。37°C干燥2 h，4°C密封保存。6、样品垫的处理1%的BSA作为封闭蛋白质均勻浸于玻璃纤维素膜，室温干燥备用。7、吸收垫用硬质吸水滤纸制备。8、材料组装在塑料底板上分别将吸液用玻璃纤维、冻干金标记抗整合素α νβ 3 玻璃纤维、已固定有抗整合素α νβ3抗体和抗小鼠IgG抗体的硝酸纤维素膜及硬质吸水滤 纸按图1装配，配件与塑料底板的结合可用双面胶或其它粘性材料粘接。装配好的纸板按 纵向剪切，裁成宽度为4mm的条状即可。实施例3 试纸使用方法 (1)样品制备
宫腔冲洗液超声粉碎处理。(2)操作取超声粉碎处理后的宫腔冲洗液标本约Iml加入小试管中，然后将样品 垫1端插入试纸条，注意不要超过样品垫1，待1分钟左右取出平放，5分钟读取结果。(3)检测结果参见图2，
出现1条红色(对照)沉淀线(质控线6)，诊断为阴性；
出现2条红色(样品和对照)沉淀线(检测线5，质控线6)，诊断为阳性，未出现沉淀线 则为无效。
权利要求
1.一种整合素α ￥33检测试剂盒，在硝酸纤维素膜的两端分别设有金标垫和吸收垫， 金标垫上端为样品垫，其特征在于金标垫包被有纯化的整合素α νβ 3抗体胶体金偶联标 记物，检测线包被有纯化的整合素α νβ3抗体，质控线包被有正�？剐∈驣gG抗体，质控线 侧贴有吸收垫。
2.权利要求1所述整合素α￥卩3检测试剂盒制备方法，包括下述步骤将纯化的整合 素α νβ3抗体用胶体金标记，喷点于玻璃纤维膜上制备成金标垫，将纯化的整合素ανβ3 抗体和正�？剐∈驣gG抗体分别包被在硝酸纤维素膜上的检测线处和质控线处，当被检样 品中含有整合素α \^3抗原时，则于金标垫与胶体金标记的整合素0￥03抗体结合，并在 吸收垫的作用下，向前渗透泳动，与检测线上的整合素α V β 3抗体再次结合，出现肉眼可见 的色带。
全文摘要
本发明提供一种整合素αVβ3检测试剂盒及其制备方法，将纯化的整合素αVβ3抗体用胶体金标记，喷点于玻璃纤维膜上制备成金标垫，将纯化的整合素αVβ3抗体和正常抗小鼠IgG抗体分别包被在硝酸纤维素膜上的检测线处和质控线处，当被检样品中含有整合素αVβ3抗原时，则于金标垫与胶体金标记的整合素αVβ3抗体结合，并在吸收垫的作用下，向前渗透泳动，与检测线上的整合素αVβ3抗体再次结合，出现肉眼可见的色带。本发明应用免疫胶体金技术制备整合素αVβ3检测试剂盒,并拟应用于临床,以推动整合素αVβ3在临床的广泛应用,提高对子宫内膜容受性判断的准确性,可以快速，灵敏检测特定蛋白，避免了复杂的操作，无需特殊检测仪器，结果易于观察判断，可以适应多种检测环境，以及多种检测需要。
文档编号G01N33/558GK102147410SQ20101060375
公开日2011年8月10日 申请日期2010年12月24日 优先权日2010年12月24日
发明者于晓艳, 徐影, 徐耀宏, 李相军, 石艳, 邹颖刚, 郑连文, 高海成, 黄冰玉 申请人:吉林大学