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专利名称：用于急性冠状动脉疾病的生物标志物的制作方法
技术领域：
本发明涉及ANP信号 肽(ANP-SP)及其在预后、诊断以及监测对象中导致生物标志 物(生物标记物，biomarker)释放到循环中的急性心脏疾�。�包括急性冠状动脉综合征中 的应用。更具体地说，本发明涉及通过测量在疾病发作或临床表现不久(短时间，shortly) 后取得的样品中的ANP-SP水平来预测、诊断或监测对象的急性心脏疾病的方法。
背景技术：
急性心脏疾�。�包括急性冠状动脉综合征(ACS)，涵盖广谱范围的心脏缺血事件 从不稳定型心绞痛至急性心肌梗死(AMI)。在这些事件中，AMI表现为最严重，因而需要快 速和准确的诊断。呈现两种或更多种所描述特征(缺血性胸部不适史、在系列心电图(ECG) 痕迹上的发展变化以及血浆心脏生物标志物的升高和降低)的患者被明确地坚定为正经 历AMI25。然而，相当大一部分呈现可疑的AMI的患者(40% -50% )并不具有在ECG上的 系列变化、或典型的症状，因而更着重关注用于准确诊断的循环生物标志物浓度25’26。心肌梗死的准确早期诊断有利于迅即引入再灌注治疗，包括有效的经皮或溶解血 栓血管再生以及辅助的抗凝血和抗血小板疗法。随着在诊断和管理中延迟的每个小时，这 样的治疗在降低死亡率和发病率方面是逐步更少有效的2_4。鉴于在这种临床情况下需要 加快做出决定，所以对提供急性心脏疾病(尤其是AMI)的早期和具体诊断的循环生物标志 物的鉴定存在相当大的兴趣。确实，目前的临床指南强调生物标志物检测在鉴定心肌梗死和急性冠状动脉综合 征中的重要性25。已提出许多生物标志物用于这个目的，包括肌酸激酶-MB (CK-MB)、肌钙蛋 白T(TnT)、肌钙蛋白I(TnI)以及肌红蛋白，但它们的应用存在局限性。至血浆心脏生物标 志物的可检测或异常升高的时间可以是6小时(肌红蛋白，CK-MB)至12小时(ΤηΤ,ΤηΙ)，其 中峰值水平直到损伤发作以后24-48小时才出现，这对精确的诊断和治疗强加了延迟窗口 H。此外，肌红蛋白和CK-MB均是非特异性的并且可以分泌自心外来源，尤其是在外伤或手 术期间工。可用于这个目的的其它生物标志物是ANP (前ANP原(ANP原前体或ANP前体原， preproANP) (124-151) )、N-ANP (前 ANP 原(26-123))(参见图 1)、BNP (前 BNP 原 103-134) 以及N-BNP (前BNP原(27-134)，其还称作NT-BNP原)。这些肽分泌到循环中6。AMI后早期的ANP和N-ANP血浆浓度的检测具有强大的预后价值2’3’7并且在治疗 方案中结合这些肽的血浆浓度可以改善患有心力衰竭的患者的临床结果8。这对于N-ANP 尤其适用，其中N-ANP具有比ANP更长的大约20倍的半衰期5，并由此提供关于AMI以后长 期心脏功能的另外的重要信息。如同以上心脏生物标志物一样，在损伤发作以后6至12小时，ANP和N-ANP可能 不会达到可检测或异常的水平，其中峰值水平直到发作以后24至48小时才出现。因而ANP 和N-ANP的长期诊断/预测能力缺乏特异性标志物的伴随能力，该特异性标记在临床表现 的最初几小时内提供急性心脏疾病如急性心肌损伤的早期具体诊断。因此对这样的早期标 志物存在需要。
最近，已经提出，ANP-SP和BNP-SP可以用于诊断心脏病(US 2005/0244904、WO 2005/052593)。一般性地指出，在心力衰竭患者中ANP-SP和BNP-SP的水平将高于正常患 者。并没有提供关于何时检测ANP-SP或BNP-SP水平的时间过程信息。据指出，BNP-SP水 平连同N-BNP—起被升高。 本发明的一个目的是以一定方式来满足对急性心脏疾病的早期标志物的需要，和 /或至少向公众提供有用的选择。

发明内容
人心房钠尿信号肽(人心房钠利肽，human atrial natriuretic singnal peptide, ANP-SP)或前 ANP 原(1-25)是一种从前 ANP 原(1-151) SEQ ID NO 1 切割的 25 个氨基酸肽。ANP-SP(1-25)在SEQ ID N0:14中单独示出。本发明的申请人惊讶地发现，在可疑的急性冠状动脉综合征(ACS)发作或临床表 现以后的最初几小时内，ANP-SP的循环浓度为最高。在这些最初的几小时内，峰值大约是 高于正常对照群体的5至15，通常3至7倍。因此，在第一方面，本发明提供了一种用于预测、诊断或监测对象中的急性心脏疾 病(ACD)的方法，该方法包括在ACD发作的4小时内或在ACD表现的4小时内，测量在从 对象获得的生物样品中的ANP-SP水平；以及将所述ANP-SP的水平与来自对照的ANP-SP 水平进行比较，其中测得的高于对照水平的ANP-SP水平为ACD的征兆(指示或指征， indicative) 0本发明还提供了一种用于监测对对象的急性心脏疾病(ACD)的治疗的反应的方 法，该方法包括在ACD发作的4小时内或在ACD表现的4小时内，测量在从对象获得的生 物样品中的ANP-SP水平；以及将所述ANP-SP水平与来自对照的ANP-SP水平进行比较，其 中测得的ANP-SP水平相对于对照水平的变化是对治疗的反应的征兆。在另一个方面，本发明还提供了一种用于预测、诊断或监测对象的心脏移植排 斥反应的方法，该方法包括在心脏移植的4小时内测量在从对象获得的生物样品中的 ANP-SP水平；以及将所述ANP-SP水平与来自对照的ANP-SP水平进行比较，其中测得的高 于对照水平的ANP-SP水平是移植排斥的征兆。本发明还提供了一种区别对象的肺疾病和急性心脏疾病(ACD)的方法，该方法包 括在疾病表现的4小时内测量在从对象获得的生物样品中的ANP-SP水平；以及将所述 ANP-SP水平与来自对照的ANP-SP水平进行比较，其中测得的高于对照水平的ANP-SP水平 是A⑶的征兆。本发明还提供了一种用于预测、诊断或监测对象的急性心脏疾病(ACD)、心脏移 植排斥、或ACD/肺疾病的方法，该方法包括在ACD、心脏移植排斥或ACD/肺疾病发作或 临床表现的最初4小时内，测量在从对象获得的生物样品中的ANP-SP水平，其中将测得的 ANP-SP水平与来自对照的ANP-SP水平进行比较，其中测得的高于对照水平的ANP-SP水平 是ACD或心脏移植排斥的征兆。在一种实施方式中，本发明的方法是体外方法。在一种实施方式中，在发作或临床表现的两小时或1小时内、或30分钟内，实施 ANP-SP水平的测量。
在一种实施方式中，生物样品是血液、唾液、间质液(interstitial fluid)、血浆、 尿、血清或心脏组织。在一种实施方式中，测量步骤包括(a)使ANP-SP与结合剂结合；以及

(b)测量结合的ANP-SP的水平。在一种实施方式中，结合剂是抗体或抗体片段。最常见地，抗体是单克隆抗体、多 克隆抗体、嵌合抗体或人源化抗体。在一种实施方式中，抗体是单克隆抗体。在一种可替换的实施方式中，利用质谱法来测量ANP-SP的水平。由抗体结合的ANP-SP是全长人ANP-SP分子(SEQ ID NO 14)或者其变体或片段。 在一种实施方式中，结合是选择性的。在一种实施方式中，片段的长度为至少4个连续氨基 酸。期望地，抗体结合ANP-SP的N端或C端。结合剂结合或选择性地结合的特异性抗原肽包括人ANP-SP (16-25) (SEQ ID NO 12)、人ANP-SP(I-IO) (SEQ ID NO 16)、或它们的抗原_结合片段或变体。在一种实施方式中，利用被固定在固相上的抗体或抗体片段来测量ANP-SP的结
I=I O可以借助于选自RIA、ELISA、荧光免疫测定法、免疫荧光测定法、质谱法以及免疫 放射测定中的测定来有用地测量ANP-SP的水平。因此，本发明还提供一种用于在A⑶、心脏移植排斥、或AOT/肺疾病发作的4小时 内或临床表现的4小时内，在从对象获得的生物样品中的ANP-SP的测定方法(assay)，该测 定方法包括利用任何已知方法来检测和测量样品中的ANP-SP水平。本发明还提供一种用于ANP-SP的测定方法，包括(a)结合来自生物样品的一种或多种ANP-SP多肽，其中该ANP-SP多肽选自由 ANP-SP 1-10 (SEQ ID NO :16)、以及 ANP-SP16-25 (SEQ ID NO 12)、或它们的变体或片段组 成的组；以及(b)测量结合的ANP-SP多肽的水平。在一种实施方式中，测定是体外测定。本发明的方法可以进一步包括测量所述ACD、或心脏移植排斥、或ACD/肺疾病的 一个或多个非ANP-SP标志物的水平，以及将所述水平与来自对照的标志物水平进行比较， 其中测得的非ANP-SP标志物的水平与对照水平的偏差、连同测得的高于ANP-SP的对照水 平的ANP-SP水平，是ACD的预测或诊断，或可以用来监测所述ACD、心脏移植排斥或ACD/肺 疾病。用于急性冠状动脉综合征情形的标志物包括肌钙蛋白T、肌钙蛋白I、肌酸激酶 MB、肌红蛋白、BNP、BNP-SP、NT-BNP、LDH、天冬氨酸转氨酶、以及心脏特异性脂肪酸结合蛋白 (H-FABP)。在另一个方面，本发明还提供了一种ANP-SP结合剂，其结合或选择性地结合 ANP-SP (SEQ ID NO 14)或其抗原-结合片段或变体，用于预测、诊断或监测对象的急性心 脏疾病(ACD)、心脏移植排斥或ACD/肺疾�。�其中ACD、心脏移植排斥或ACD/肺疾病的特征 在于，在ACD、心脏移植排斥或ACD/肺疾病发作的4小时内或临床表现的4小时内，在从对 象获得的生物样品中出现ANP-SP。
在一种实施方式中，结合剂是抗体或其抗原_结合片段。本发明还提供了一种抗体或其抗原_结合片段，其结合(a) ANP-SP 氨基酸序列 16-25 (SEQ ID NO 12)或 1-10 (SEQ ID NO 16)；(b)由选自SEQ ID NO 13或SEQ ID NO 17的核苷酸序列编码的氨基酸序列；或(c) (a)或(b)的变体或片段。抗体可以是单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体或人源化抗体。本发明还涉及ANP-SP结合剂在制备用于评估对象的急性心脏疾病(ACT)、心脏移 植排斥或ACD/肺疾病的预后、诊断或监测工具中的应用，其中在ACD、心脏移植排斥或ACD/ 肺疾病发作的4小时内或临床表现的4小时内进行评估。本发明还涉及本发明的抗体或抗原结合片段在制备用于评估对象的急性心脏疾 病(ACD)、心脏移植排斥或ACD/肺疾病的预后、诊断或监测工具中的应用。本发明还涉及本发明的应用，其中对预后、诊断或监测工具进行校准以测量在0. 1 至 500pmol/L、或 1 至 300pmol/L、或 2 至 100pmol/L、或 5 至 150pmol/L 范围内的 ANP-SP 水平。在另一个方面，本发明提供了一种用于预测、诊断或监测急性心脏疾病(ACT)、心 脏移植排斥或ACD/肺疾病的试剂盒，包括ANP-SP结合剂，其中试剂盒与在ACD、心脏移植 排斥或ACD/肺疾病发作或临床表现的4小时内从对象获得的生物样品一起使用。本发明还提供了一种用于预测、诊断或监测急性心脏疾病(ACT)、心脏移植排斥或 ACD/肺疾病的试剂盒，包括本发明的抗体或抗原_结合片段。本发明还提供了一种用于预测、诊断或监测急性心脏疾病(ACT)的试剂盒，包括 本发明的结合剂或抗体或抗原-结合片段。在一种实施方式中，对试剂盒进行校准以测量 在 0. 1 至 500pmol/L、或 1 至 300pmol/L、或 2 至 100pmol/L、或 5 至 150pmol/L 范围内的 ANP-SP 水平。在一种实施方式中，试剂盒还包括说明书，用于在发作或临床表现的4小时内预 测、诊断或监测对象的ACD、心脏移植排斥、或ACD/肺疾�。�其中根据在发作或临床表现的4 小时内在获得的生物样品中测得的ANP-SP水平，并将测得的水平与对照水平进行比较。测 得的高于对照水平的ANP-SP水平是ACD或移植排斥的征兆。在另一个方面，本发明涉及编码ANP-SP (16-25) (SEQ IDNO 12)或 ANP-SP (1_10) (SEQ ID N0 16)的核酸分子，其中所述核酸是(a) SEQ ID NO 13或SEQ ID NO 17或它们的变体或片段；(b)与 SEQ ID N0:13 或 SEQ ID NO :17 具有 70%、75%、80%、90%、95%或 99% 序列同一性的序列；(c)在严格条件下与SEQ ID NO 13或SEQ ID NO 17或它们的片段或变体杂交的 序列；(d)长度为至少10个核苷酸、能够在严格条件下与(a)至(C)中任一个的序列杂 交的序列；(e) (a)至(d)中任一个的补体；前提条件是该序列不是SEQ ID NO :15。本发明还提供一种包含本发明的核酸分子的基因构建体、包含该基因构建体的载体、包含该基因构建体或载体的宿主细胞、由本发明的核酸分子编码的多肽、选择性地结合 本发明的多肽的抗体、以及用于重组产生本发明的多肽的方法。因此，在另一个方面，本发明提供一种ANP-SP多肽或其变体或片段，选自(a) ANP-SP (16-25) (SEQ ID NO 12)或其变体或片段；(b) ANP-SP (1-10) (SEQ ID NO 16)或其变体或片段；或(c)与 SEQ ID N0:12 或 SEQ ID NO :16 的多肽具有至少 70%、75%、80%、85%、 90%、95%或99%氨基酸同一性的氨基酸序列。


现在将参照附图中的图示来描述本发明，其中图1是概述导致产生游离信号、N-ANP以及ANP肽的人前ANP原的处理的示意图；图2A是在6个物种中的前ANP原信号肽序列的Clustal W版本1. 83 JALVIEff多 序列对比。在该对比中使用了默认Clustal W参数，如下DNA间隙空白罚分=15. 0 ；DNA 间隙延展罚分=6. 66 ;DNA基质=同一性；蛋白质间隙空白罚分=10. 0 ；蛋白质间隙延展 罚分=0. 2 ；蛋白基质=Gonnet ；蛋白质 /DNA ENDGAP = -1 ；蛋白质 /DNAGAPDIST = 4。以 Pearson (fasta)格式提交氨基酸9。图2B是6个物种中的前ANP原序列的单字母标记格式。信号肽区为黑体；图3示出了放射免疫测定的结果，其中人血浆提取物(空心方块)与ANP-SP标准 曲线(实心圆点)平行稀释；图4A示出放射免疫测定结果，上图在自入院表明的时间在获自AMI患者(η = 3) 的血浆中的ANP-SP浓度。在入院后1-2小时观测到ANP-SP的最高水平，其比在正常健康 个体中测得的水平平均高大约6至7倍(下部实心圆点，η = 8，示出百分范围)。下图在 上图相同的患者中，CK-MB、肌红蛋白以及TnT的匹配的时间过程浓度分布；图4Β示出放射免疫测定结果，上图在自入院表明的时间在获自AMI患者(η = 23)的血浆中的ANP-SP浓度。在入院后1-2小时观测到ANP-SP的最高水平，其比在正常 健康个体中测得的水平平均高大约5至7倍(下部实心圆点，η = 66，示出百分范围)。下 图在上图相同的患者中，CK-MB、肌红蛋白以及TnT的匹配的时间过程浓度分布。图5示出了 ANP-SP抗血清的交叉反应性数据表；以及图6是示出了患者中的循环ANP-SP浓度来源于心脏源的条形图。定义急性心脏疾病(AOT)包括但不限于急性冠状动脉综合征在呈现ECG时具有ST 段抬高的(AMI)，不稳定型心绞痛，以及急性非ST段抬高型心肌梗死；心肌缺血；急性心肌 损伤；由急性药物毒性造成的急性心肌损伤，急性心肌�。�以及心脏移植排斥。这些疾病的 充分描述性定义可在参考文献1找到。AOT/肺疾病是指具有未确诊的、或可疑的A⑶或肺疾病的对象。 急性冠状动脉综合征(ACS)包括各种不同的心肌缺血事件，包括不稳定型心绞 痛，在呈现的心电图(ECG)上具有ST段抬高的急性心肌梗死，以及在ECG上没有ST段抬高 的急性心肌梗死。术语"抗体"是指具有特定结构的免疫球蛋白分子，其特异性地与用于合成该抗体的包含抗原的分子、或与它密切相关的抗原相互作用(结合)。如在本文中所使用的，术语"抗体"宽泛地包括全长抗体并且还可以包括它们的某些抗体片段。还包括单克隆和多 克隆抗体、多价和单价抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、嵌合抗体、人抗体、人源 化抗体以及已亲和力成熟的抗体。如果抗体优先结合于ANP-SP，例如与非ANP-SP多肽具有 小于25%、或小于10%、或小于或小于0. 的交叉反应度，则该抗体选择性地或特异 性地结合于本发明的ANP-SP多肽。通常，抗体对于抗原或表位具有不大于10_6、或10_7M、或 小于约10_8M、或10_9M、或10,、或10_"或10_12M的结合亲和力(解离常数(Kd)值)。可以 利用表面等离子体共振来评估结合亲和力。如在本文中所使用的，“抗原-结合片段"或"抗体片段"是指完整抗体的一部 分，其优选保留抗体片段的大部分或全部、或最低限度至少一种正常功能。抗体片段，例如， 可以包含Fc区，其保留在完整抗体中相应Fc区的全部或大部分或部分功能。抗体片段的 实例包括Fab、Fab'、F(ab' )2以及片段、线性抗体、双体分子、单链抗体(ScFV)以及多特 异性抗体。如在本文中所使用的，“单克隆抗体"是指这样的抗体，其相对于单靶抗原是高 度特异性抗体。单克隆抗体可以获自同源或基本上同源抗体的群体，其中，除了可能少量发 生的自然突变，每个单克隆抗体是相同的和/或结合相同表位。“分离的抗体"是已鉴定的抗体，其已分离或回收(或两者)自它的自然环境的 成分。例如，分离自蛋白质的分离的抗体包括酶和激素。在一种实施方式中，将抗体纯化至 按重量计至少95%、或96%或97%或98%或99%的抗体。可以通过例如劳氏法(Lowry method)来确定纯度。通常，通过至少一个纯化步骤来制备抗体。如在本文中所使用的，术语"结合剂"是指任何固体或非固体材料，其能够结 合ANP-SP或其片段或变体。在一种实施方式中，该术语是指结合至ANP-SP或其片段或 变体的任何天然或非天然分子。结合剂的实例包括蛋白质、肽、核酸、碳水化合物(糖类， carbohydrates)、脂质、以及小分子化合物。一种选择性或特异性结合剂是抗体或其抗原结 合片段。如在本文中所使用的，生物样品是指来源于待筛查对象的任何样品。样品可以是 本领域已知的可以检测ANP-SP的任何样品。包括任何体液如血浆、血液、唾液、间质液、血 清、尿、滑液、脑脊液、淋巴液、精液、羊膜液、心包液和腹水，以及组织如心脏组织，但不局限 于此。术语"表位"包括任何能够特异结合于免疫球蛋白和/或T细胞受体的蛋白质决 定簇。即，在抗原上的B和/或T细胞对其响应的位点。抗原决定簇通常包括分子的化学活 性表面基团如氨基酸或糖侧链，并且通常具有特定的三维结构特征、以及特定的电荷特性。 表位通常包括3、5或通常8-10个氨基酸。这些氨基酸可以是连续的、或通过三级折叠并置 的非连续氨基酸。术语“在发作或临床表现的4小时内”包括在医疗设施处从A⑶、心脏移植排斥或 未确诊的或可疑的ACD/肺疾病的发作或表现的1分钟直到并包括240分钟。优选地，可以 在发作或表现的2小时(从1分钟直到并包括120分钟)内或在1小时(从1分钟直到并 包括60分钟)内、在发作或表现的5至45分钟、15至40分钟、20至35分钟内、或在25至 30分钟内，进行测量。
在一种实施方式中，比对照"更高"或"更低"的水平，或相对于对照的变化或 偏差是统计上显著的。如果和对照水平相比，与对照水平的水平差异为5%或更大、10%或 更大、20%或更大、或50%或更大，则可以认为存在更高的水平、更低的水平、相对于对照水 平或平均对照水平的偏差或变化。统计上显著的可以可替换地被计算为P <0.05。在另 外的一种可替换方式中，可以通过借助于测定参考限度或参考区间来确定更高的水平、更 低的水平、偏差、以及变化。这些可以计算自直观评估或非参数方法。一般来说，这些方法 计算0. 025以及0. 975分位数作为0. 025* (n+1)以及0. 975 (n+1)。这样的方法在本领域 中是众所周知的22’23。存在在对照中不存在的标志物也被设想为更高的水平、偏差或变化。 不存在在对照中存在的标志物也被设想为更低的水平、偏差或变化。包括来自任何对象的样品如来自没有A⑶的临床病史的正常健康对象以及患有 各种A⑶的对象，其中上述A⑶包括但不限于在呈现的ECG上具有ST段抬高的急性冠状动 脉综合征(AMI)，不稳定型心绞痛，以及急性非ST段抬高型M I ；心肌缺血；急性心肌损伤； 急性药物毒性造成的急性心肌损伤、急性心肌病、以及心脏移植排斥。术语ANP-SP是指用于人前ANP原序列(SEQ ID NO 1)的完全25个氨基酸ANP信号 肽。ANP-SP(1-25)在SEQ ID NO :14中单独示出，并且在图2B中被加下划线。术语ANP-SP 还包括ANP-SP的变体或片段。在一种实施方式中，ANP-SP作为信号多肽，或作为抗体可以 结合的抗原多肽。ANP-SP的变体和片段包括保留这些功能的任何一种或两种的变体和片 段。如在本文中所使用的，术语〃心肌病〃是指心肌的疾�。�其中心肌被弱化。这可以 导致心脏的减少的抽吸。心肌病的常见原因是心肌梗死、病毒感染、高血压、酒精中毒、以及 自身免疫病。如在本说明书和权利要求中所使用的，术语"包括"是指“至少部分由...构成”； 也就是说，当解释包括术语"包括"的本说明书和权利要求中的陈述时，在每个陈述中以 该术语开始的特征都需要存在，但也可以存在其它的特征。以类似方式来解释相关术语 如"包含〃和〃含有〃。如在本文中所使用的，术语"多核苷酸"是指任何长度的单或双链脱氧核糖核苷 酸或核糖核苷酸聚合物，并且作为非限制性实例包括基因的编码和非编码序列、有义和反 义序列、外显子、内含子、基因组DNA、cDNA、mRNA前体、mRNA、rRNA、siRNA、miRNA, tRNA、核 酶、重组多核苷酸、分离和纯化的天然存在的DNA或RNA序列、合成RNA和DNA序列、核酸探 针、引物、片段、基因构建体、载体以及修饰的多核苷酸。可以类似地理解核酸分子。本文提供的多核苷酸序列的"片段"是连续核苷酸的子序列，该子序列能够特异 性地杂交于感兴趣的靶，例如，长度为至少10个核苷酸的序列。本发明的片段包含SEQ ID NO 15 的多核苷酸的 10、15、16、17、18、19、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、 34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、 59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、或 74 个连续核苷酸。多核苷酸序列的 片段可以用作引物、探针、包括在微阵列中、或用于本文的基于多核苷酸的选择方法中。应 当类似地理解本发明的其它多核苷酸的片段(如SEQ ID N0:13或SEQ ID NO 17)或本文 描述的多核苷酸。术语〃引物〃是指短多核苷酸，通常具有游离的3' OH基团，其杂交于模板并用于引发互补于靶的多核苷酸的聚合作用。术语"探针"是指短多核苷酸，在基于杂交的测定中，该短多核苷酸用来检测互补于探针的多核苷酸序列。探针可以包括如本文所定义的多核苷酸的"片段"。如在本文中所使用的，术语"多肽"涵盖任何长度的氨基酸链，但通常是全长 ANP-SP蛋白(SEQ ID NO 14)的至少4个氨基酸、至少5个氨基酸、或至少6个、至少7个、 至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、 至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23 个、至少24个、或所有25个氨基酸，其中氨基酸残基通过共价肽键连接。可用于本发明的 多肽可以是纯化的天然产物，或可以部分或全部地利用重组或合成技术来生产。该术语可 以指多肽、多肽的聚集体如二聚体或其它多聚体、融合多肽、多肽片段、多肽变体、或它们的 衍生物。应当类似地理解本发明的其它多肽(如SEQ ID N0:12或SEQ ID N0:16)、或本文 描述的其它多肽。多肽的"片段"是多肽的子序列，其实施生物活性或结合所需要的功能和/或提 供多肽的三维结构。该术语可以指多肽、多肽的聚集体如二聚体或其它多聚体、融合多肽、 多肽片段、多肽变体、或它们的衍生物。在一种实施方式中，片段能够实施上述信号肽活性， 或保留ANP-SP (1-25)、ANP-SP(I-IO)、或ANP-SP (16-25)、或本发明的其它多肽或本文描述 的多肽的抗原结合特性。如应用于本文披露的多核苷酸或多肽序列，术语"分离的"用来指从它们的天然 细胞环境中分离出来的序列。可以通过任何方法或方法的组合来获得分离的分子，包括生 化、重组、以及合成技术。可以通过至少一个纯化步骤来制备多核苷酸或多肽序列。如在本文中所使用的，术语"纯化的"并不需要绝对纯度。在一种实施方式中，纯 化的是指在样品中多核苷酸、多肽抗体、或宿主细胞至少90%、或95%、或98%、或99%的 同源性。相对于本文描述的其它分子和构建体，应类似地理解该术语。如用于细胞或宿主细胞，术语"分离的"描述这样的细胞或宿主细胞，其已自生 物体或它的自然环境获得或分离，并且随后被保持在如本领域中已知的实验室环境中。该 术语并不限于单细胞本身，而是指包含在细胞培养中的细胞或宿主细胞，并且可以包括单 细胞或单宿主细胞。术语"重组"是指这样的多核苷酸序列，其从在其自然环境下围绕它的序列移出 和/或与在其自然环境下不存在的序列重组。通过从〃重组〃多核苷酸序列翻译而产生〃重组〃多肽序列。如在本文中所使用的，术语"变体"是指不同于具体鉴定序列的多核苷酸或多肽 序列，其中一个或多个核苷酸或氨基酸残基被缺失、取代、或插入。变体可以是天然存在的 等位基因变体、或非天然存在的变体。变体可以来自相同或来自其它物种并且可以包括同 系物、共生同源物以及直向同源物。在某些实施方式中，可用于本发明的多肽的变体具有包 括信号肽活性或抗原结合性能的生物活性，其与亲代多肽或多核苷酸的生物活性相同或类 似。相对于多核苷酸和多肽，术语"变体"包括如本文所定义的所有形式的多核苷酸和多 肽。相对于本发明的序列，变体多核苷酸序列呈现至少50%、至少60%、至少70%、至 少71%、至少72%、至少73%、至少74%、至少75%、至少76%、至少77%、至少78%、至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至 少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少 95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %、或至少99 %的同一性。在至少10个核苷酸位置、至 少15个核苷酸位置、至少20个核苷酸位置、至少27个核苷酸位置、至少40个核苷酸位置、 至少50个核苷酸位置、至少60、或至少70个核苷酸位置的比较窗上，或在SEQ ID N0:13、 SEQ ID N0:15、SEQ ID NO :17或本文披露的其它多核苷酸的全长多核苷酸上找到同一性。可以利用全局序列比对程序(例如Needleman，S. B. and Wunsch, C. D. (1970) J. MoI. Biol. 48,443-453)基于候选与主题多核苷酸序列之间的重叠序列的全长来计 算多核苷酸序列同一性。Needleman-Wunsch全面比对算法的全面实施在EMBOSS程 序包中的针程序中找至Ij (Rice, P. Longden, I. and Bleasby, A. EMBOSS :The European Molecular Biology Open Software Suite, Trends in Genetics June 2000, vol 16, No 6. pp. 276-277)，其可以获自 http: //www, hgmp. mrc. ac. uk/Software/EMBOSS/。欧洲生物 信息研究所服务器还提供设施以在两个序列之间在线进行EMBOSS-针全面比对(在http / www. ebi. ac. uk/emboss/align/) 0可替换地，可以使用GAP程序，其计算两个序列的最佳全局比对而没有处罚末端间 隙。在以下论文中描述了 GAP :Huang，X. (1994) On Global Sequence Alignment (Computer Applications in the Biosciences 10,227-235)。多核苷酸变体还涵盖这样的变体，这些变体呈现与一个或多个具体鉴定的序列的 相似性，其很可能保存那些序列的功能对等并且将不能合理地预计通过随机机会发生。该 程序发现在序列之间相似性的区域并且对于每个这样的区域报道"E值"，该E值是在包 含随机序列的固定参考大小的数据库中可以预计偶然看到这样的配对的次数的预计数。这 种数据库的大小是由bl2seq程序中的默认值来设置的。对于较小的E值(远小于1)，E值 大约是这样的随机配对的概率。当与任何一种具体鉴定的序列比较时，变体多核苷酸序列优选呈现小于1X10_5、 小于 1Χ1(Γ6、小于 1Χ1(Γ9、小于 1Χ1(Γ12、小于 1Χ1(Γ15、小于 IXlO"18 或小于 1Χ1(Γ21 的 E值。还可以以下列方式来确定多核苷酸序列的同一性和相似性。利用序列比对算法和 序列相似性搜索工具如在Genbank (基因库)、EMBL、SwiSS-PR0T以及其它数据库中，比较了 主题多核苷酸序列和候选多核苷酸序列。Nucleic Acids Res 29 =I-IOand 11_16，2001提 供了在线资源的实例。BLASTN的使用优选用于确定根据本发明的多核苷酸变体的序列同一性。BLASTN(来自 BLAST成套程序，版本2. 2.，2008年 4 月 18 日，在bl2seq 中(Tatiana A. et al，FEMS Microbiol Lett. 174 :247_250 (1999)、Altschul et al. ,Nuc. Acis Res 25: 3389-3402，(1997))可公开获自 NCBI (ftp //fto. ncbi. nih. Rov/blast/)或获自 NCBl at Bethesda, Maryland, USA。除了应关闭低复杂性部分的过滤，采用bl2seq的默认参数。可以使用以下UNIX命令行参数来检查多核苷酸序列的同一性bl2seq-i nucleotideseql -j nucleotideseq2_F F_p blastn参数-F F关闭低复杂性部分的过滤。参数-P选择用于序列对的适当的算法。在 行〃 Identities="中，bl2seq程序将序列同一性报道为相同核苷酸的数量和百分比。
可替换地，变体多核苷酸是这样的多核苷酸，该多核苷酸在严格条件下杂交于指 定的多核苷酸序列、或其补体。术语"在严格条件下杂交"、及其语法上的等同表述，是指在规定的温度和盐浓 度条件下，多核苷酸分子杂交于靶多核苷酸分子(如固定在DNA或RNA印迹上的靶多核苷 酸分子，如Southern印迹或Northern印迹)的能力。可以通过在较低严格条件下进行最 初杂交，然后将严格性增加至所期望的严格性来确定在严格杂交条件下杂交的能力。关于长度大于约100个碱基的多核苷酸分子，典型的严格杂交条件是低于天然双 链体的解链温度(Tm)的不大于25至30°C (例如，10°C )(通常参见，Sambrook et al.，Eds， 1987, Molecular Cloning, A Laboratory Manual,2nd Ed. Cold Spring Harbor Press ； Ausubel et al. , 1987, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing, 将其以引用方式结合于本文)。可以通过公式Tm = 81. 5+0. 41% (G+C-log(Na+)来计算大 于约 100 个碱基的多核苷酸分子的 Tm(Sambrook et al.，Eds, 1987, Molecular Cloning, A Laboratory Manual,2nd Ed. Cold Spring Harbor Press ；Bolton and McCarthy,1962, PNAS 84 1390)。用于长度大于100个碱基的多核苷酸的典型的严格条件将是杂交条件如 在6X SSC、0. 2%505的溶液中预洗涤；在651、6乂 SSC、0. 2% SDS下杂交过夜；接着两次30 分钟的洗涤，每次在IX SSC、0. 1% SDS中和65°C下，以及两次30分钟的洗涤，每次在0. 2X SSC,0. 1% SDS 中和 65°C下。在一种实施方式中，严格条件使用在42°C下的50%甲酰胺、5 X SSC、50mM磷酸钠 (pH 6.8)、0. 焦磷酸钠、5X登哈特溶液、经超声处理的鲑鱼精子DNA(50 μ g/ml)、0. 1% SDS,以及10%硫酸葡聚糖盐，在42°C下在0. 2 X SSC中洗涤以及在55°C下在50%甲酰胺中 洗涤，接着在55 °C下用包含EDTA的0. IXSSC洗涤。对于长度小于100个碱基的多核苷酸分子，典型的严格杂交条件是低于Tm 5至 10°C。平均来说，长度小于IOObp的多核苷酸分子的Tm被降低大约(500/寡核苷酸长 度)°C。对于DNA 模拟物，称作肽核酸(PNA) (Nielsen et al.，Science. 1991 Dec 6 ； 254(5037) =1497-500), Tm值高于DNA-DNA或DNA-RNA杂交体的Tm值，并且可以利用在 Giesen et al. ,Nucleic Acids Res. 1998 Nov 1 ；26 (21) :5004_6 中描述的公式来计算。对 于长度小于100个碱基的DNA-PNA杂交体，示例性的严格杂交条件是低于Tm 5至10°C。变体多核苷酸还包括这样的多核苷酸，其不同于本发明的序列，但是由于遗传密 码的简并性，其编码与由本发明的多核苷酸编码的多肽具有类似活性的多肽。并不改变多 肽的氨基酸序列的序列改变是"沉默变化"。除了 ATG(蛋氨酸)和TGG(色氨酸)，通过本 领域公认的技术可以改变用于相同氨基酸的其它密码子，例如，以在特定宿主生物体中优 化密码子表达。在编码的多肽序列中导致一个或多个氨基酸的保守取代而没有显著改变其生物 活性的多核苷酸序列改变也包括在本发明中。本领域技术人员将明了用于进行表型沉默氨 基酸取代的方法(参见，例如，Bowie et al.，1990，Science 247，13069)。利用bl2seq程序并借助于tblastx算法(如上所述)，可以确定由于编码的多肽 序列中的沉默变化和保守取代而产生的变体多核苷酸。相对于多肽，术语"变体"还包括天然存在的、重组和合成产生的多肽。变体多肽序列优选呈现与本发明序列的至少50%、至少60%、至少70%、至少71%、至少72%、至 少73%、至少74%、至少75%、至少76%、至少77%、至少78%、至少79%、至少80%、至 少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至 少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少 97%、至少98%、或至少99%的同一性。在至少5、至少7、至少10、至少15、至少20、或至少 24个氨基酸位置的对比窗，或在SEQ ID NO 12, SEQID N0:14或SEQ ID NO :18的多肽、或 在本发明中披露或使用的其它多肽的全长上来寻找同一性。多肽变体还包括那些变体，这些变体呈现与一个或多个具体鉴定序列的相似性， 其很可能保存那些序列的功能对等并且将不能合理地预计通过随机机会已发生的那些。如 上面所讨论的，在ANP-SP变体的情况下，功能可以是作为信号多肽、或抗原多肽、或两者。可以以下列方式来确定多肽序列同一性和相似性。利用BLASTP(来自bl2seq中 的BLAST成套程序，版本2. 2. 18 [2008年4月])，其可公开获自NCBI (ftp://ftp.ncbi.nih. gov/blast/)来比较主题多肽序列和候选多肽序列。除了应关闭低复杂性区域的过滤，采用 了 bl2seq的默认参数。可以使用以下UNIX命令行参数来检查多肽序列的相似性bl2seq-i peptideseql-j peptideseq2_F F_p blastp参数-F F关闭低复杂性部分的过滤。参数-P选择用于序列对的适当的算法。该 程序发现在序列之间相似性的区域并且对于每个这样的区域报道“E值”，该E值是在包含 随机序列的固定参考大小的数据库中可以预计偶然看到这样的配对的次数的预计数。对于 较小的E值(远小于1)，E值大约是这样的随机配对的概率。当与任何一种具体鉴定的序列比较时，变体多肽序列通常呈现小于1X10_5、小于 1 X 10-6、小于 IX 10-9、小于 IX 1(Γ12、小于 IX 1(Γ15、小于 IX IO-18 或小于 1Χ1(Γ21 的 E 值。对于在候选和主题多肽序列之间重叠序列的全长，也可以利用全面序列比对程序 来计算多肽序列同一'性。EMBOSS 针(可获自 http:/www. ebi. ac. uk/emboss/align/)和 GAP(Huang, Χ. (1994)On Global Sequence Alignment. Computer Applications in the Biosciences 10，227-235.)，如上面所讨论的，也是合适的用来计算多肽序列同一性的全 面序列比对程序。如上所述的BLASTP的应用优选用于确定根据本发明的多肽变体。在一种实施方式中，变体包括这样的肽，其序列与本文中的人ANP-SP(1_25)SEQ ID NO 14、ANP-SP (16-25) SEQ ID NO 12 或 ANP-SP (1-10) SEQ ID N0:16 相差一个或多个 保守性氨基酸取代、缺失或添加或插入，其并不影响肽的生物活性。保守取代通常包括一种 氨基酸取代另一种具有类似特性的氨基酸，例如，在以下组内的取代缬氨酸、甘氨酸；甘 氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸；天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、 苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；以及苯丙氨酸、酪氨酸。保守取代的实例还可以参见图2A和图2B 中的ANP-SP的序列，由此示出与人序列相比在不同哺乳动物物种中的取代。保守和半保 守取代的实例可以获自下面的表1。
表权利要求
1.一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段结合(a)ANP-SP 氨基酸序列 16-25 (SEQ ID NO 12)或 1-10 (SEQ ID NO 16)；(b)由选自SEQID NO 13或SEQ ID NO 17的核苷酸序列编码的氨基酸序列；或(c)(a)或(b)的变体或片段。
2.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其选择性地结合ANP(16-25)或 ANP(I-IO)。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的抗体或抗原结合片段，其是单克隆、多克隆、嵌 合或人源化抗体或片段。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其被标记有可检测标志物。
5.一种用于预测、诊断或监测对象中的急性心脏疾病(ACD)的方法，所述方法包括 在所述ACD发作的4小时内、或所述ACD表现的4小时内测量在从所述对象获得的生物样品中的ANP-SP水平；以及将所述ANP-SP水平与来自对照的ANP-SP水平进行比较，其 中，测得的高于所述对照水平的ANP-SP水平是ACD的征兆。
6.一种用于监测对象中对急性心脏疾病(ACD)的治疗的反应的方法，所述方法包括 在所述ACD发作的4小时内、或所述ACD表现的4小时内测量在从所述对象获得的生物样品 中的ANP-SP水平；以及将所述ANP-SP水平与来自对照的ANP-SP水平，其中，测得的ANP-SP 水平相对于所述对照水平的变化是对所述治疗的反应的征兆。
7.一种用于在对象中预测、诊断或监测心脏移植排斥反应的方法，所述方法包括在 心脏移植的4小时内测量在从对象获得的生物样品中的ANP-SP水平，以及将所述ANP-SP 水平与来自对照的ANP-SP水平进行比较，其中，测得的高于所述对照水平的ANP-SP水平是 移植排斥的征兆。
8.一种用于区别对象中的肺疾病和急性心脏疾病(ACD)的方法，所述方法包括在 所述疾病表现的4小时内测量在从对象获得的生物样品中的ANP-SP水平；以及将所述 ANP-SP水平与来自对照的ANP-SP水平进行比较，其中，测得的高于所述对照水平的ANP-SP 水平是ACD的征兆。
9.一种用于预测、诊断或监测对象中的急性心脏疾病(ACD)、心脏移植排斥、或ACD/肺 疾病的方法，所述方法包括在ACD、心脏移植排斥或ACD/肺疾病发作或临床表现的最初4小 时内测量在从所述对象获得的生物样品中的ANP-SP水平，其中将测得的ANP-SP水平与来 自对照的ANP-SP水平进行比较，其中，测得的高于所述对照水平的ANP-SP水平是ACD或移 植排斥的征兆。
10.根据权利要求5至9中任一项所述的方法，其中，在ACD发作、或ACD、心脏移植排 斥、或ACD/肺疾病临床表现的最初2小时、1小时、或30分钟内测量ANP-SP的水平。
11.根据权利要求5至10中任一项所述的方法，其中，在发作或临床表现的4至6小时 内、或在初始测量的2至3小时内进行重复测量。
12.根据权利要求5至11中任一项所述的方法，其中，在所述样品中，在40至300pmol/ L、或 42 至 200pmol/L、或 45 至 200pmol/L 或 45 至 150pmol/L 范围内的 ANP-SP 水平是 ACD、 或心脏移植排斥的征兆，或用于区分ACD与肺疾病。
13.根据权利要求5至11中任一项所述的方法，其中，在所述样品中，比所述对照水平高3至8倍的ANP-SP水平是A⑶、或心脏移植排斥的征兆，或用于区分A⑶与肺疾病。
14.根据权利要求5至13中任一项所述的方法，其中，所述ACD选自由急性冠状动脉综 合征在呈现ECG上具有ST段抬高型的AMI、不稳定型心绞痛、以及非ST-段抬高的MI ；心 肌缺血、急性心肌损伤、急性药物毒性造成的急性心肌损伤、急性心肌病、以及心脏移植排 斥组成的组。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述ACD是非ST段抬高的Ml。
16.根据权利要求14所述的方法，其中，所述ACD是急性心肌缺血。
17.根据权利要求5至16中任一项所述的方法，其中，所述生物样品是血液、血浆、血 清、唾液、间质液、尿或心脏组织样品。
18.根据权利要求5至17中任一项所述的方法，其中，所述测量步骤包括(a)使ANP-SP与结合剂结合；以及(b)测量结合的ANP-SP的水平。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中，所述结合剂是抗体或其抗原-结 合片段。
20.根据权利要求19所述的方法，其中，所述抗体结合或选择性结合的ANP-SP是 ANP-SP(SEQ ID NO 14)或其抗原片段或变体。
21.根据权利要求19或权利要求20所述的方法，其中，所述抗体结合于ANP-SP的N端 或C端。
22.根据权利要求19至21中任一项所述的方法，其中，所述抗体或抗原-结合片段是 根据权利要求1至4中任一项所述的抗体或片段。
23.根据权利要求18至22中任一项所述的方法，其中，利用被固定在固相上的抗体或 抗原-结合片段来测量ANP-SP的结合。
24.根据权利要求5至23中任一项所述的方法，其中，利用选自RIA、ELISA、质谱、荧光 免疫测定、免疫荧光测定、以及免疫放射测定的测定来测量ANP-SP的水平。
25.根据权利要求5至23中任一项所述的方法，其中，利用质谱法来测量ANP-SP的水平。
26.根据权利要求25所述的方法，其中，所述质谱法是SELDI、ESI、MALDI或FTICR。
27.根据权利要求5至沈中任一项所述的方法，其进一步包括测量所述A⑶、或心脏 移植排斥、或ACD/肺疾病的一种或多种非ANP-SP标志物的水平，以及将所述水平与来自对 照的标志物水平进行比较，其中，所述测得的水平与所述对照水平的偏差，连同测得的高于 ANP-SP的对照水平的ANP-SP水平，是所述ACD的预测或诊断，或能够用来监测所述ACD、心 脏移植排斥或ACD/肺疾病。
28.根据权利要求27所述的方法，其中，所述非ANP-SP标志物选自由肌钙蛋白T、肌钙 蛋白I、肌酸激酶-MB、肌红蛋白、BNP、NT-BNP、BNP-SP、LDH、天冬氨酸转氨酶以及H-FABP组 成的组。
29.根据权利要求27或权利要求观所述的方法，其中，测得的水平相对于所述对照水 平的偏差包括更高的测得的所述非ANP-SP标志物水平。
30.根据权利要求5至四中任一项所述的方法，其中，所述监测是监测对再灌注治疗的反应。
31.一种用于在A⑶、心脏移植排斥、或A⑶/肺疾病发作的4小时内或A⑶、心脏移植排 斥、或ACD/肺疾病临床表现的4小时内，测定在从对象获得的生物样品中的ANP-SP的测定 方法，所述测定方法包括利用任何已知的方法来检测和测量所述样品中的ANP-SP的水平。
32.根据权利要求31所述的测定方法，其中，通过将ANP-SP结合于结合剂来检测所述 样品中的ANP-SP的水平，其中所述结合剂结合或选择性地结合ANP-SP。
33.一种用于ANP-SP的测定方法，包括(a)结合来自生物样品的一种或多种ANP-SP多肽，其中所述ANP-SP多肽选自由 ANP-SP(I-IO) (SEQ ID NO :16)、和 ANP-SP 16-25 (SEQ ID NO :12)、或它们的变体或片段组 成的组；以及(b)测量结合的ANP-SP多肽的水平。
34.根据权利要求33所述的测定方法，其中，利用ANP-SP结合剂、或根据权利要求1至 4中任一项所述的抗体或其抗原-结合片段来结合所述ANP-SP多肽。
35.根据权利要求31至34中任一项所述的测定方法，其中，利用质谱法来测量ANP-SP 的水平。
36.根据权利要求35所述的测定方法，其中，所述质谱法是SELDI、ESI、MALDI或 FTICR0
37.根据权利要求36所述的测定方法，其中，所述测量包括提供SELDI探针，所述 SELDI探针包含附着于底物的ANP-SP抗体或抗原_结合片段；使所述抗体或片段与所述生 物样品接触以使所述抗体捕获来自所述样品的一种或多种ANP-SP多肽；以及利用SELDI来 测量结合的ANP-SP的水平。
38.根据权利要求37所述的测定方法，其中，利用具有层析表面的SELDI生物芯片来实 施所述SELDI。
39.根据权利要求31至34中任一项所述的测定方法，其中，利用选自RIA、ELISA、免疫 荧光测定和免疫放射测定的测定来测量ANP-SP的水平。
40.一种结合ANP-SP (SEQ ID NO 14)或其片段或变体的ANP-SP结合剂，用于预测、诊 断或监测对象中的急性心脏疾病(ACD)、心脏移植排斥或ACD/肺疾�。�其中，所述ACD、心脏 移植排斥或ACD/肺疾病的特征在于，在ACD、心脏移植排斥或ACD/肺疾病发作的4小时内、 或临床表现的4小时内在获自所述对象的生物样品中出现ANP-SP。
41.根据权利要求40所述的ANP-SP结合剂，其中，ANP-SP以40至300pmol/L、或42至 200pmol/L、或45至200pmol/L或45至150pmol/L的范围存在于所述样品中。
42.根据权利要求40所述的ANP-SP结合剂，其中，ANP-SP以高于ANP-SP平均对照的 3至7倍的水平存在于所述样品中。
43.根据权利要求40至42中任一项所述的ANP-SP结合剂，其是根据权利要求1至4 中任一项所述的抗体或抗原-结合片段。
44.ANP-SP结合剂在制备用于评估对象中的急性心脏疾病(ACD)、心脏移植排斥或 ACD/肺疾病的预后、诊断或监测工具中的应用，其中，所述评估在ACD、心脏移植排斥或 ACD/肺疾病发作的4小时内、或临床表现的4小时内实施。
45.根据权利要求44所述的应用，其中，所述预后、诊断或监测工具被校准以测量在 0. 1 至 500pmol/L、或 1 至 300pmol/L 或 2 至 100pmol/L、或 5 至 150pmol/L 范围内的 ANP-SP水平。
46.根据权利要求44所述的应用，其中，所述预后、诊断或监测工具被校准以测量在高 于ANP-SP对照水平的3至7倍范围内的ANP-SP水平。
47.ANP-SP结合剂在用于预测、诊断或监测对象中的急性心脏疾病(ACD)、心脏移植排 斥或ACD/肺疾病中的应用，其中，所述预后、诊断或监测在ACD、心脏移植排斥或ACD/肺疾 病发作的4小时内、或临床表现的4小时内实施。
48.根据权利要求47所述的应用，其中，所述预测、诊断或监测利用根据权利要求5至 30中任一项所述的方法或根据权利要求31至39中任一项所述的测定方法来实现。
49.根据权利要求44至48中任一项所述的应用，其中，所述结合剂是结合或选择性地 结合ANP-SP (SEQ ID NO 14)或其片段或变体的结合剂。
50.根据权利要求49所述的应用，其中，所述结合剂是抗体或其抗原-结合片段。
51.根据权利要求50所述的应用，其中，所述抗体或抗原-结合片段是根据权利要求1 至4中任一项所述的抗体或抗原-结合片段。
52.根据权利要求1至4中任一项所述的ANP-SP抗体或其抗原-结合片段在制备用于 评估对象中的急性心脏疾病(ACD)、心脏移植排斥或ACD/肺疾病的预后、诊断或监测工具 中的应用。
53.根据权利要求1至4中任一项所述的ANP-SP抗体或其抗原-结合片段在用于预 测、诊断或监测对象中的急性心脏疾病(ACD)、心脏移植排斥或ACD/肺疾病中的应用。
54.一种用于预测、诊断或监测急性心脏疾病(ACD)、心脏移植排斥或ACD/肺疾病的试 剂盒，所述试剂盒包含根据权利要求40至43中任一项所述的ANP-SP结合剂，其中，所述试 剂盒在ACD、心脏移植排斥或ACD/肺疾病发作的4小时内、或临床表现的4小时内与从对象 获得的生物样品一起使用。
55.一种用于预测、诊断或监测急性心脏疾病(ACD)、心脏移植排斥或ACD/肺疾病的试 剂盒，所述试剂盒包含根据权利要求40至43中任一项所述的结合剂，其中，所述试剂盒被 校准以测量在0. 1至500pmol/L、优选1至300pmol/L、并且优选2至100pmol/L范围内的 ANP-SP 水平。
56.一种用于预测、诊断或监测急性心脏疾病(ACD)、心脏移植排斥或ACD/肺疾病的试 剂盒，所述试剂盒包含根据权利要求1至4中任一项所述的ANP-SP抗体或其抗原-结合片 段。
57.根据权利要求M至56中任一项所述的试剂盒，所述试剂盒进一步包括其上固定有 所述结合剂或抗体的固体相。
58.根据权利要求M至57中任一项所述的试剂盒，其进一步包括说明书，根据在发作 或临床表现的4小时内获得的生物样品中测得的ANP-SP水平，用于在发作的4小时内、或 临床表现的4小时内预测、诊断或监测对象中的ACD、心脏移植排斥、或ACD/肺疾病。
59.一种编码 ANP-SP (16-25) (SEQ ID NO 12)或 ANP-SP (1-10) (SEQ ID NO 16)或它 们的片段或变体的核酸分子，其中，所述核酸是(a)SEQ ID NO :13或SEQ ID NO 17或它们的变体或片段;(b)与SEQ ID N0:13 或 SEQ ID NO :17 具有 70%、75%、80%、90%、95%或 99%序列 同一性的序列；(c)在严格条件下与SEQID N0:13或SEQ ID NO :17或它们的片段或变体杂交的序列；(d)长度为至少10个核苷酸，能够在严格条件下与(a)至(c)中任一个的序列杂交的 序列；(e)(a)至(d)中任一个的补体；前提条件是所述序列不是SEQ ID N0:15。
60.一种基因构建体，其包含根据权利要求59所述的核酸分子。
61.根据权利要求60所述的基因构建体，其是一种表达构建体。
62.一种载体，其包含根据权利要求60或权利要求61所述的基因构建体。
63.一种宿主细胞，妻包含根据权利要求60至62中任一项所述的基因构建体或载体。
64.一种由权利要求59所述的核酸分子编码的ANP-SP多肽、或其变体或片段。
65.一种ANP-SP多肽或其变体或片段，选自(a)ANP-SP (16-25) (SEQ ID NO. 12)或其变体或片段；(b)ANP-SP (1-10) (SEQ ID NO 16)或其变体或片段；或(c)与SEQ ID N0:12 或 SEQ ID NO :16 的多肽具有至少 70%、75%、80%、85%、90%、 95%或99%氨基酸同一性的氨基酸序列。
66.一种用于重组生产根据权利要求64或权利要求65所述的多肽的方法，所述方法包 括以下步骤(a)培养宿主细胞，所述宿主细胞包含能够表达权利要求64或65所述的多肽的权利要 求60或61所述的基因构建体；以及(b)选择表达本发明的多肽的细胞；(c)从所述细胞分离已表达的多肽；以及可选地(d)纯化所述已表达的多肽。
67.根据权利要求66所述的方法，其中，所述方法包括用所述构建体转染所述宿主细 胞的预先步骤。
全文摘要
本发明提供了用于预测、诊断或监测急性心脏疾病、心脏移植排斥、或区别急性心脏疾病与肺疾病的方法，其中通过在疾病或移植排斥发作或表现不久后测量在从对象获得的样品中的ANP信号肽水平。还提供了在本发明方法中有用的抗体。
文档编号G01N33/68GK102084251SQ200980113514
公开日2011年6月1日 申请日期2009年2月20日 优先权日2008年2月22日
发明者克里斯托弗·约瑟夫·彭伯顿, 蒂莫西·格兰特·扬德尔, 迈克尔·加里·尼科尔斯, 阿瑟·马克·理查兹 申请人:奥塔哥创新有限公司