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专利名称：毛囊体外培养用于建立药物筛选和检测系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生化方法，采用毛囊体外培养用于建立药物筛选和检测系统由于毛囊是一个多层次细胞组成的器官，许多生理现象包括细胞生长的控制、间质与上皮间的关系，上皮的分化，激素的作用，毛发生物钟等，都融汇于毛囊这种复杂的结构中，它不仅对美容、而且在皮肤自我更新、伤口愈合及肿瘤发生等过程中，起主导作用。其生物学价值已超出了皮肤的范畴，因此毛囊将是研究药物的药理和生理作用以及用于药物的筛选和检测的理想模型。
本发明目的在于，研制的毛囊体外培养用于建立药物筛选和检测系统，该系统提供了一种理想的体外给药的药物筛选和检测模型，以加速生药的开发和产业化，该系统包括毛囊的制备方法、毛囊的培养方法、毛囊的检测方法，将培养的毛囊用于体外药物的筛选和检测可大大缩短药物开发的周期，并且能很好地印证体内环境下药物的生理和药理作用。
本发明所述的毛囊体外培养用于建立药物筛选和检测系统，该系统包括毛囊制备方法、培养方法、检测方法其中毛囊制备方法是采用皮肤块置于溴化钠、胶源酶、胰岛酶溶液中，然后轻轻分离出带完整毛囊的表皮；培育方法是将制备好的带完整毛囊的表皮冲洗后置于培养基中培养，然后再培养基中添加有效成份，并在显微镜下观察培养状况；检测方法是采用光学显微镜观察识别的照相记录，多巴染色及常规封片组织，细胞化学染色观察和电镜制样。
毛囊的制备方法用哺乳动物或经手术取得的人体皮肤块(包括3-6个月的胎儿、新生儿和引产胎儿)，将皮肤置于36-37℃,2N溴化钠溶液中2-4小时，0.1-0.5％的胶原酶中1-5小时，0.25或0.125％的胰蛋白酶中30分钟，然后轻轻分离出带完整毛囊的表皮。
毛囊的培养方法将制备好的带完整毛囊的表皮冲洗后置于WilliamsE的培养基中培养，其中培养基中添加有500ul,10-12mM的葡萄糖液，加人2mM的l-谷氨酰胺、100n/ml青霉素、100u/ml的链霉素、10ng/ml的氢化可的松及10ng/ml的胰岛素(IGF ),10ng/ml的胰岛素样因子-1(IGF-1)和胰岛素样因子-2(IGF-2)、10ng的表皮生长因子(ECF)等，在36-37℃，2-5％的CO2中孵育，并在显微镜下观察培养状况。
毛囊检测方法，光学显微镜观察和进行照相记录，多巴(DOPA)染色及常规封片，组织、细胞化学染色观察和电镜制样等，其中多巴(DOPA)染色程序首先将带完整毛囊的表皮或培养的毛囊置于0.5-0.1％的多巴，PBS液中，36-37℃卵育2-4小时，蒸馏水中洗后用中性福尔马林固定10-12小时，用乙醇脱水，二用苯透明，将表皮角质，真皮面放置于载片上，常规树脂封片。
实施例1制备方法从哺乳动物取得皮肤块，将皮肤块置于36℃-37℃,2N溴化钠溶液中2小时，0.1％的胶原酶中1小时，0.25％的胰蛋白酶中30分钟，然后轻上分离出节完整毛囊的表皮。
培养方法将制备好的带完整毛囊的表皮冲洗后置于WilliamsE的培养基中培养，其中培养基中添加有500ul,10mN的葡萄糖液，加入2mN的L-谷氨酰胺、100u/ml青霉素、100u/ml的链霉素、10ng/ml的氢化可的松及10ng/ml的胰岛素(IGF),10ng/ml的胰岛素样因子-1和胰岛素样因子-2、10ng的表皮生长因子，在37℃,2％-5％的CO2中孵育，并在显微镜下观察培养状况。
检测方法光学显微镜观察和进行照相记录，多巴染色及常规封片，组织，细胞化学染色观察和电镜制样等，其中多巴染色程序首先将带完整毛囊的表皮或培养的毛囊置于0.1％的多巴，PBS液中，37℃孵育2-4小时，蒸馏水中洗后用中性福尔马林固定10小时，用乙醇脱水，二甲苯透明，将表皮角质向上、真皮面向下放置于载玻片上，常规树脂封片。
实施例2制备方法取胎人皮肤块，将皮肤块置于37℃,2N溴化钠溶液中3小时，0.3％的胶原酶中3小时，0.1％的胰蛋白酶中30分钟，然后轻上分离出节完整毛囊的表皮。
培养方法将制备好的带完整毛囊的表皮冲洗后置于WilliamsE的培养基中培养，其中培养基中添加有500ul,10mM的葡萄糖液，加入2mM的L-谷氨酰胺、100u/ml青霉素、100u/ml的链霉素、10ng/ml的氢化可的松及10ng/ml的胰岛素(IGF),10ng/ml的胰岛素样因子-1和胰岛素样因子-2、10ng的表皮生长因子，在37℃,4％的CO2中孵育，并在显微镜下观察培养状况。
检测方法光学显微镜观察识别照相记录，多巴染色及常规封片，组织，细胞化学染色观察和电镜制样等，其中多巴染色程序首先将带完整毛囊的表皮或培养的毛囊置于0.3％的多巴，PBS液中，37℃孵育3小时，蒸馏水中洗后用中性福尔马林固定11小时，用乙醇脱水，二甲苯透明，将表皮角质、真皮面放置于载玻片上，常规树脂封片。
实施例3制备方法取成人皮肤块，将皮肤块置于37℃,-2N溴化钠溶液中4小时，0.4％的胶原酶中4小时，0.125％的胰蛋白酶中30分钟，然后轻上分离出节完整毛囊的表皮。
培养方法将制备好的带完整毛囊的表皮冲洗后置于WilliamsE的培养基中培养，其中培养基中添加有500ul,10mM的葡萄糖液，加入2mM的L-容氨酰胺、100u/ml青霉素、100u/ml的链霉素、10ng/ml的氢化可的松及10ng/ml的胰岛素(IGF),10ng/ml的胰岛素样因子-1和胰岛素样因子-2、10ng的表皮生长因子，在37℃,5％的CO2中孵育，并在显微镜下观察培养状况。
检测方法光学显微镜观察识别的照相记录，多巴染色及常规封片组织，细胞化学染色观察和电镜制样等，其中多巴染色程序首先将带完整毛囊的表皮或培养的毛囊置于0.5％的多巴，PBS液中，37℃卵育4小时，蒸馏水中洗后用中性福尔马林固定12小时，用乙醇脱水，二甲苯透明，将表皮角质、真皮面放置于载玻片上，常规树脂封片。
权利要求
1.一种毛囊体外培养用于建立药物筛选和检测系统，其特征在于，该系统包括毛囊制备方法、培养方法、检测方法，其中毛囊制备方法是采用皮肤块置于溴化钠、胶源酶、胰岛酶溶液中，然后轻轻分离出带完整毛囊的表皮；培育方法是将制备好的带完整毛囊的表皮冲洗后置于培养基中培养，然后再培养基中添加有效成份，并在显微镜下观察培养状况；检测方法是采用光学显微镜观察识别的照相记录，多巴染色及常规封片组织，细胞化学染色观察和电镜制样。
2.根据权利要求1所述的毛囊体外培养用于建立药物筛选和检测系统，其特征在于，在毛囊的制备方法中用哺乳动物或经手术取得的人体皮肤块(包括3-6个月的胎儿、新生儿和引产胎儿)，将皮肤块置于36-37℃，2M溴化钠溶液中2-4小时，0.1-0.5％的胶原酶中1-5小时，0.25-0.125％的胰蛋白酶中30分钟，然后轻轻分离出带完整毛囊的表皮。
3.根据权利要求1所述的毛囊体外培养用于建立药物筛选和检测系统，其特征在于，毛囊的培养方法将制备好的带完整毛囊的表皮冲洗后置于WilliamsE的培养基中培养，其中培养基中添加有500ul,10-12mM的葡萄糖液，加入2mM的l-谷氨酰胺、100u/ml青霉素、100u/ml的链霉素、10ng/ml的氢化可的松及10ng/ml的胰岛素(IGF),10ng/ml的胰岛素样因子-1(IGF-1)和胰岛素样因子-2(IGF-2)、10ng的表皮生长因子(ECF)等，在36-37℃,2-5％的CO2中孵育，并在显微镜下观察培养状况。
4.根据权利要求1所述的毛囊体外培养用于建立药物筛选和检测系统，其特征在于，在毛囊检测方法中，其中多巴(DOPA)染色程序首先将带完整毛囊的表皮或培养的毛囊置于0.5-0.1％的多巴，PBS液中，36-37℃孵育2-4小时，蒸馏水冲洗后用中性福尔马林固定10-12小时，用乙醇脱水，二用苯透明，将表皮角质，真皮面放置于载片上，常规树脂封片。
全文摘要
本发明涉及一种毛囊体外培养用于建立药物筛选和检测系统,该系统包括毛囊制备方法、培养方法、检测方法。其目的在于提供一个理想的体外给药的药物筛选和检测模型,将培养的毛囊用于体外药物的筛选和检测可大大缩短药物开发的周期,并且能很好地印证体内环境下药物的生理和药理作用。
文档编号G01N33/15GK1219677SQ97120999
公开日1999年6月16日 申请日期1997年12月9日 优先权日1997年12月9日
发明者马春江, 王亮, 李维琪 申请人:中国科学院新疆化学研究所