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专利名称：Gpi抗原酶联免疫法体外定量测定诊断试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属生物技术领域，具体涉及GPI(葡萄糖6磷酸异构酶，Glucose-6-phosphateisomerase)抗原酶免疫法体外定量测定诊断试剂盒、制备方法及应用。
背景技术：
类风湿性关节炎(RA)患者、约64％的健康人群和类风湿关节炎未控制的患者在血清中和关节腔积液内存在GPI。主要是体内T细胞系统和B淋巴细胞系统产生分泌大量GPI抗原进入血清和关节腔内，使得血清中和关节腔内GPI浓度升高，这是类风湿关节炎独特的自身免疫生理功能。在RA患者高效价的GPI存在，常伴有严重的关节功能受限。提示预后不良或治疗过程中药物没有起到一定作用。当RA患者用药物治疗好转，血清和关节腔积液中GPI降低，关节肿痛减轻。2001年nature immunology杂志首次发表文章，从鼠自然生成类风湿关节炎的k/Bx NT细胞神经未稍细胞基因中得到GPI，然后从人类类风湿关节炎中也得到相同的GPI，而且在类风湿关节炎所含高浓度抗原都是一致，几乎完全为GPI同一酵素酶。到2002-2003年世界各国都对GPI进行类风湿关节炎、消化道癌症、红斑狼疮很多分子生物学实验研究基因克隆和药物治疗等等。但至今未有能直接应用于临床检测GPI的诊断试剂或试剂盒。

发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种快速、灵敏地定量检测人血清或人关节腔积液GPI的体外诊断试剂盒及制备方法。
本发明所要解决的另一技术问题是公开上述试剂盒在制备临床判断类风湿关节炎(RA)、消化道癌症和红斑狼疮及治疗效果试剂中的应用。
本发明GPI诊断试剂盒是以GPI抗原免疫动物，得到相应的抗人GPI抗血清，采取免疫标记吸咐技术抗原抗体结合反应原理制成的诊断试剂盒。
本发明所述的GPI抗原是指GPI纯蛋白抗原或GPI多肽合成抗原；所述的免疫动物包括各种免疫动物如绵羊、兔子、豚鼠等。
本发明GPI诊断试剂盒中采用的GPI抗体是GPI蛋白抗体、GPI多肽抗体或两种抗体的组合抗体；其中采用GPI蛋白抗体和GPI多肽抗体结合应用可增加测试灵敏度。
本发明公开的GPI诊断试剂盒的制备包括下列步骤1、抗体制备取健康免疫动物，用GPI抗原进行免疫，第一次以抗原加卡介苗和福氏佐剂研匀，注射动物颈淋巴结或皮下肌肉组织，每二周一次，共免疫4-5次，抗原量抗原量根据动物体重增减，免疫最后一次的二周后采血，动物抗人血清用饱和硫酸铵二级沉淀后上离子交换层析柱，得到动物抗人GPI IgG抗体，测定效价，冷冻备用；2、抗体标记取GPI IgG抗体采用常规过碘酸钠法标记辣根过氧化物酶；3、包被抗体聚苯乙烯微孔板制备取标记的GPI IgG抗体，工作浓度于50mM，pH9.5碳酸盐条件下加入聚苯乙烯微孔，每孔100微升，并于2-8℃条件放置约40小时；取出用生理盐水洗涤5次，烘干，用铝箔袋密封包装。
4.其它应用试剂(1)包被液0.05mol pH9.5碳酸盐溶液；(2)洗涤液0.8％氯化钠-0.05％ Tween 20；(3)稀释液0.15mol pH7.2磷酸盐-氯化钠溶液；(4)显色缓冲液0.05mol pH5.0磷酸盐-柠檬酸溶液；(5)显色剂邻苯二铵；(6)终止液2mol硫酸溶液。
GPI诊断试剂盒具体操作方法为每次实验每块包被抗体聚苯乙烯微孔板设GPI参考标准品(0、0.16、0.33、1.0、2.0微克/毫升)5孔及空白孔1孔，其余各孔加待检人血清样品，每孔加样100微升。置37℃，保持1小时，取出用洗涤液洗涤5次，拍干。除空白孔外，其余各孔加酶标记抗体100微升。置37℃，保持1小时，取出用洗涤液洗涤5次，拍干。各孔加底物显色液100微升。置37℃，保持15分钟，各孔加终止液50微升。
结果判断(1)采用酶标检测仪，主波长492nm副波长630nm，以GPI参考标准品0微克/毫升校零，测定各孔吸光度值。
(2)以GPI参考标准品标示值为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。
(3)以待检各孔的吸光度值查标准曲线得出相应的检测结果。
本发明试剂盒操作简便，测试灵敏，重现性好。经大量试验检测获得类风湿关节炎的测定参考范围为(以每毫升GPI微克计)0.16微克/ml以下为阴性，0.16微克/ml-0.33微克/ml为可疑，0.33微克/ml为阳性。
下面结合实施例对本发明作进一步描述。


图1、实施例7测定范围曲线图2、GPI标准曲线图
具体实施例方式实施例1、抗体制备取健康雄性的50kg重成年绵羊，用GPI纯化蛋白抗原进行免疫。第一次以抗原加卡介苗和福氏佐剂研匀，注射绵羊颈淋巴结和皮下肌肉组织，每二周一次，共免疫4-5次，抗原量5mg/次。免疫最后一次的二周后采血，羊抗人血清用饱和硫酸铵二级沉淀后上离子交换层析柱，得到羊抗人GPI蛋白IgG抗体，测定效价，冷冻备用。
取健康雄性的50kg重成年绵羊，用GPI多肽抗原进行免疫。第一次以抗原加卡介苗和福氏佐剂研匀，注射绵羊颈淋巴结和皮下肌肉组织，每二周一次，共免疫4-5次，抗原量5mg/次。免疫最后一次的二周后采血。羊抗人血清用饱和硫酸铵二级沉淀后上离子交换层析柱，得到羊抗人GPI IgG多肽抗体，测定效价，冷冻备用。
实施例2、取健康雄性的成年兔子(5kg)，用GPI纯化蛋白抗原进行免疫。第一次以抗原加卡介苗和福氏佐剂研匀，注射兔子皮下肌肉组织，每二周一次，共免疫4次，抗原量0.5mg/次。免疫最后一次的二周后采血。羊抗人血清用饱和硫酸铵二级沉淀后上离子交换层析柱，得到兔抗人GPI蛋白IgG抗体，测定效价，冷冻备用。
取健康雄性的成年兔子(5kg)，用GPI多肽抗原进行免疫。第一次以抗原加卡介苗和福氏佐剂研匀，注射兔子皮下肌肉组织，每二周一次，共免疫4次，抗原量0.5mg/次。免疫最后一次的二周后采血。羊抗人血清用饱和硫酸铵二级沉淀后上离子交换层析柱，得到兔抗人GPI IgG多肽抗体，测定效价，冷冻备用。
实施例3、取健康雄性的成年豚鼠，用GPI纯化蛋白抗原进行免疫。第一次以抗原加卡介苗和福氏佐剂研匀，注射豚鼠皮下肌肉组织，每二周一次，共免疫4次，抗原量0.1mg/次。免疫最后一次的二周后采血。羊抗人血清用饱和硫酸铵二级沉淀后上离子交换层析柱，得到鼠抗人GPI蛋白IgG抗体，测定效价，冷冻备用。
取健康雄性的成年豚鼠，用GPI多肽抗原进行免疫。第一次以抗原加卡介苗和福氏佐剂研匀，注射豚鼠皮下肌肉组织，每二周一次，共免疫4次，抗原量0.1mg/次。免疫最后一次的二周后采血。羊抗人血清用饱和硫酸铵二级沉淀后上离子交换层析柱，得到鼠抗人GPIIgG肽抗体，测定效价，冷冻备用。
实施例4、抗体标记取实施例1-3中任一方法获得的GPI IgG多肽抗体和GPI IgG蛋白抗体各50％采用常规过碘酸钠法标记辣根过氧化物酶，(1)GPI抗体(2mg/ml)0.9ml，加0.1mol pH9.5 NaAc；(2)辣根过氧化物酶10mg溶解于1.0ml 1.0mmol pH4.0 NaAc。
(3)加0.1mol过碘酸钠0.1ml，1.6mmol乙二醇0.1ml于上述辣根过氧化物酶溶液。
(4)将上述辣根过氧化物酶溶液与抗体混合搅拌1-2小时。
(5)加0.1mol四氢硼化钠0.1ml于4℃静止30分钟。
(6)用50％饱和硫酸铵沉淀分离标记物。
(7)标记物用50％丙三醇——PBS溶解，并于冷冻储藏。
实施例5、包被抗体聚苯乙烯微孔板制备取实施例4获得的标记的GPI IgG抗体，工作浓度于50mM，pH9.5碳酸盐条件下加入聚苯乙烯微孔，每孔100微升，并于2-8℃条件放置约40小时。取出用生理盐水洗涤5次，烘干，用铝箔袋密封包装。
实施例6、GPI试剂盒标准1试剂包被抗体聚苯乙烯微孔板固相抗GPI抗体。
酶标记抗体酶标记抗GPI抗体、0.15mol pH7.2磷酸盐-氯化钠溶液。
洗涤液(10×)8％氯化钠-0.5％ Tween 20。
显色缓冲液0.05mol pH5.0磷酸盐-柠檬酸溶液。
显色剂邻苯二铵。
终止液2mol硫酸溶液。
2仪器酶标检测仪(吸光度测定精度0.0——2.0A±0.001A)。
3分析方法双抗体夹心法原理定量测定(ELISA法)。
4样品要求人血清或人关节腔积液。
5技术要求
采用酶标检测仪，主波长492nm副波长630nm。
6.计算方法以GPI参考标准品标示值为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。
以待检各孔的吸光度值查标准曲线得出相应的检测结果。
7.性能要求7.1物理性状外观各液体组份应清晰透明，包装无渗漏，密封袋无漏气。
7.2试剂空白吸光度在主波长492nm副波长630nm处，室温，15分钟，试剂空白吸光度应≤0.15A。
7.3分析灵敏度取GPI标准每毫升0.16微克检测，检测结果±20％。
7.4准确度取GPI标准每毫升0.33微克、检测结果±15％。
7.5精密度1.0微克 CV≤15％。
7.6测定范围2.0微克范围内呈线性，线性误差应≤15％，测定吸光度值与标示值的相关系数r≥0.99。
8.实验方法8.1物理性状目测试剂盒各组份外观，结果应符合本标准7.1条款要求。
8.2试剂空白吸光度以含10％小牛血清生理盐水为空白样品进行检测，按规定操作，以显色底物空白校零，记录吸光度，重复三次取平均值，结果应符合本标准7.2条款要求。
8.3分析灵敏度检测GPI标准每毫升0.08微克，重复三次取平均值，结果应符合本标准7.3条款要求。
8.4准确度检测标准品，GPI标准每毫升0.33微克、，重复三次，取平均值，结果应符合本标准7.4条款要求。
8.5精密度(重复性)取GPI含量约每毫升1.0微克的血清检测进行20次测定(N＝20)，求出20次吸光度变化均值x和标准差S，按下式计算变异系数(CV)，结果应符合本标准7.5条款要求。
CV%=Sx‾×100%]]>8.6测定范围取GPI标准每毫升0.08微克、0.16微克、0.33微克、1.0微克、2.0微克，每一浓度重复检测三次，取平均值，结果应符合本标准7.6条款要求。
实施例7、测试实例基本参数采用酶标检测仪，主波长492nm副波长630nm，以GPI参考标准品0微克/毫升校零，测定各孔吸光度值。
使用方法(1)每次实验每块包被抗体聚苯乙烯微孔板设GPI参考标准品(0、0.16、0.33、1.0、2.0微克/毫升)5孔及空白孔1孔，其余各孔加待检血清样品，每孔加样100微升。置37℃，保持1小时，取出用洗涤液洗涤5次，拍干。
(2)除空白孔外，其余各孔加酶标记抗体100微升。置37℃，保持1小时，取出用洗涤液洗涤5次，拍干。
(3)各孔加底物显色液100微升。置室温避光，保持15分钟，加终止液50微升，吸光度(OD)0.80查表样品GPI含量0.52微克/ml。
结果判断(1)采用酶标检测仪，主波长492nm副波长630nm，以GPI参考标准品0微克/毫升校零，测定各孔吸光度值。
(2)以GPI参考标准品标示值为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线(图2)。
(3)样品OD(吸光度)0.80，查标准曲线图，样品GPI值0.52微克/ml，此患者血清中GPI含量0.52微克/ml，类风湿关节炎阳性。(见图1)实施例8、健康9人参考值1、测定范围曲线见图22、精密度1.0微克/ml重复20次。

3、参考值测定健康人300例，其参考范围0.16微克/ml以下为阴性，0.16微克/ml-0.33微克/ml为可疑，0.33微克/ml为阳性。
权利要求
1.GPI抗原酶免疫法体外定量测定诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒是以GPI抗原免疫动物，得到相应的抗人GPI抗血清，采取免疫标记吸咐技术制成的诊断试剂盒。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于其中所述的GPI抗原是GPI纯蛋白抗原或GPI多肽合成抗原。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于其中所述的免疫动物为各种免疫动物包括绵羊、兔子或豚鼠。
4.根据权利要求1所述试剂盒的制备方法，其特征在于该试剂盒的制备包括下列步骤1)抗体制备取健康免疫动物，用GPI抗原进行免疫，第一次以抗原加卡介苗和福氏佐剂研匀，注射动物颈淋巴结或皮下肌肉组织，每二周一次，共免疫4-5次，免疫最后一次的二周后采血，动物抗人血清用饱和硫酸铵二级沉淀后上离子交换层析柱，得到动物抗人GPI IgG抗体，测定效价，冷冻备用；2)抗体标记取GPI IgG抗体采用常规过碘酸钠法标记辣根过氧化物酶；3)包被抗体聚苯乙烯微孔板制备取标记的GPI IgG抗体，工作浓度于50mM，pH9.5碳酸盐条件下加入聚苯乙烯微孔，每孔100微升，并于2-8℃条件放置约40小时；取出用生理盐水洗涤5次，烘干，用铝箔袋密封包装；4)其它应用试剂(1)包被液0.05mol pH9.5碳酸盐溶液；(2)洗涤液0.8％氯化钠-0.05％Tween 20；(3)稀释液0.15mol pH7.2磷酸盐—氯化钠溶液；(4)显色缓冲液0.05mol pH5.0磷酸盐—柠檬酸溶液；(5)显色剂邻苯二铵；(6)终止液2mol硫酸溶液。
5.根据权利要求4所述试剂盒的制备方法，其特征在于用于包被的标记的GPI IgG抗体是GPI蛋白抗体、GPI多肽抗体或两种抗体的组合抗体。
6.根据权利要求1所述试剂盒在制备临床判断类风湿关节炎及治疗效果中的应用。
全文摘要
本发明涉及GPI(葡萄糖6磷酸异构酶，Glucose－6－phosphateisomerase)抗原酶联免疫法体外定量测定诊断试剂盒、制备方法及应用。GPI诊断试剂盒是以GPI抗原免疫动物，得到相应的抗人GPI抗血清，采取免疫标记吸咐技术抗原抗体结合反应原理制成的诊断试剂盒。该试剂盒可用于临床判断类风湿关节炎(RA)及治疗效果。
文档编号G01N33/547GK1558239SQ200410016140
公开日2004年12月29日 申请日期2004年2月5日 优先权日2004年2月5日
发明者刘中令, 陆梅生, 刘颖冰 申请人:上海北加生化试剂有限公司, 刘中令, 陆梅生, 刘颖冰