专利名称：一种蓝藻的检测分析方法
技术领域：
本发明涉及一种蓝藻的检测分析方法，用于对蓝藻的不同生理期进行分析，有助 于对水域中的蓝藻状况进行提前预警。
背景技术：
湖泊是人类最重要的水资源之一，在湖泊周围也是我国人口和工业聚集区。因为 人类活动的影响，今年湖泊的富营养化日趋严重，大中型湖泊太湖、巢湖、滇池、洞庭湖、洪 泽湖、白洋淀等资源属性受到威胁。富营养化的直接后果就是蓝藻水华的发生，2008年太湖 爆发的蓝藻水华严重影响了周边居民的正常生活。如何在蓝藻水华爆发前进行准确的预警 变得非常重要。对水中蓝藻含量进行连续监测是切实可行的途径。目前对蓝藻的监测都是通过检测蓝藻在特定波长下的吸收强度或者荧光强度来 判断其浓度的，其技术为
1.利用蓝藻中的藻蓝蛋白对特定波长的光的吸收特性进行吸收度测量以确定蓝藻浓 度，定量分析依据为朗伯-比尔定律，我们简称之为吸收法，如图1，包括光源1，样品池2，光 接收器3，照射光束4，透射光束5。2.利用藻蓝蛋白在吸收光照之后受激发射的特定波长的荧光，根据检测到的荧光 量的大小来确定蓝藻浓度，简称为荧光法。藻蓝蛋白的激发波长峰值在621nm，而发射波长 的峰值在646nm，现有技术中大多是用这个波段的光源进行照射。图2给出了荧光法的示 意图，包括光源1，样品池2，，照射光束6，荧光光束7，探测器8，收集透镜9。图3为荧光法 的另外一种实施例，基本原理一样，都是通过荧光强度的大小来判断蓝藻的浓度，包括光源 1，样品池2，照射光束6，荧光光束7，探测器8，滤色片10。上述方法的缺陷在于
1.检测的是一个样本的总体，而非每个蓝藻细胞的个体，光强的变化量(吸收光或者荧 光)不能与蓝藻浓度直接对应，需要通过复杂的定标体系来实现，一般方法为显微镜镜检， 非常费时费力，并且同一个检测仪器对不同的水域都需要重新定标。2.由于不同生理期的蓝藻荧光强度是不同的，会造成浓度定标的不准确。例如 生长期的蓝藻细胞荧光量大于成熟期的蓝藻细胞荧光量，那么低浓度的生长期蓝藻细胞与 高浓度的成熟期蓝藻细胞就可能会得到同样的荧光量，此时定标已经失去意义。3.检测的只是通过蓝藻细胞的浓度，无法对水域的蓝藻的生理期进行判断，预警 功效较差。解决上述问题的最好方法是采用流式细胞仪对待测样本进行测量，但是流式细胞 仪体积庞大、沉重、价格昂贵，且需要在机外进行样本处理，只适合在实验室测试，不能够进 行现场测试以及在线实时监测。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中存在的不足，从而提供一种蓝藻的检测分析方法，该方法适合现场测量的蓝藻分析，可实现对待测样本所含的蓝藻细胞进行逐个测量；不 仅精确得到蓝藻的浓度，而且对蓝藻的不同生理期进行分析，有助于对水域中的蓝藻生长 状况进行提前预警。按照本发明提供的技术方案，一种蓝藻的检测分析方法，包括以下检测分析步 骤
(1)、鞘流形成被测对象由两种液体形成，一种是待测样本液，首先用吸样器采集水 样，滤除水样中粒径大于Imm的泥沙颗粒；然后在吸样器内部经过筛选排除空气和砂粒，余 下的浮游植物作为待测样本液；另一种是鞘液；由吸样与液路控制单元将两种液体送至流 动室中，待测样本液在鞘液的包裹下流过流动室检测区，在流体聚焦的作用下将样本液压 缩至2个蓝藻细胞的宽度，使蓝藻细胞逐个通过流动室检测区；
(2)、光照射部分
光源经过第一聚焦透镜或透镜组，形成一个椭圆形光斑，椭圆形光斑照射到流动室检 测区中流过的待测样本液上；鞘液在流动室整流区中形成层流，在流动室加速区中将样本 液逐渐聚焦，直至在流动室检测区中将待测样本液压缩成直径为小于2个蓝藻细胞尺度的 样本流，这样待测样本液中的蓝藻细胞就只能一个一个的通过检测区照射光的照射，在每 次检测事件中只能检测一个细胞；
(3)、光接收探测部分蓝藻细胞逐个地受到检测区照射光的照射而产生光学信号，所 述光学信号通过第二聚焦透镜收集，再通过长通滤色片进入光电探测器；光学信号被光电 探测器接收，经过光电转换后形成电脉冲信号，送至信号处理与数据分析单元，一个细胞流 过检测区时就形成一个电脉冲信号，这样就实现了样本中单个细胞的逐个测量；
(4)信号处理与数据分析部分信号处理与数据分析单元对光电探测器的电信号进行 滤波处理，并对样本的统计数据进行分析，根据分析方法在至少一维的蓝藻统计数据中划 分至少2个区域，分别表示蓝藻的不同生理期，对区域中的蓝藻细胞分别计数和分析，得 到样本液的蓝藻总浓度、不同生理期的蓝藻浓度、不同生理期蓝藻所占百分比；所述蓝藻总 浓度为一次测量过程中所有脉冲的总数目除以被测体积。所述流动室包含一个液体流过的导孔，该导孔分为三个区域整流区、加速区、检 测区；所述检测区是光照射区域为一个边长为200um 400um的方孔或者矩形孔，由光学透 明材料制成；所述方孔或矩形孔的入口渐扩的部分形成加速区，鞘液通道与样本液通道相 嵌套的部分为整流区。所述样本液通道出口为直径0. 3mm的圆孔。所述光源采用发光二极管；所述光电探测器采用光电二极管。所述发光二极管的波长620 士 5nm，透光波长为640歷 850nm。所述流动室内部流动的液流要满足层流条件，即雷诺数<2300 ；鞘流对样本流进 行流体聚焦，将样本流压缩至小于2个蓝藻细胞直径的宽度。所述椭圆形光斑短轴的长度为20士5um、长轴的长度为200士20um ；椭圆形光斑
短轴的方向与细胞流动方向一致，椭圆形光斑长轴方向垂直于细胞流动方向和光束传播方 向。所述椭圆形光斑在流动室中心处的大小要求为在样本流动方向上小于2个蓝藻 直径，在同时垂直于光束传播和样本流动的方向上不小于流动室内孔宽度；在垂直于光束传播的方向上用一个大数值孔径的第二聚焦透镜将光信号收集到光电探测器上。所述蓝藻细胞受到照射后产生的光学信号包括前向散射光、侧向散射光和荧 光，所述前向散射光指的是沿着光路传播方向1飞度范围内的散射光，反映了细胞的体 积大�。徊嘞蛏⑸涔庵傅氖谴怪庇诠獯シ较虻纳⑸涔猓嵌确段�75度 115度，反映 了细胞的内部复杂程度；荧光的角度范围和侧向散射光角度一致，其荧光的波长范围为 640nnT850nm。本发明的优点是
1.解决传统仪器的定标问题。对特定体积的待测样本中所含的蓝藻细胞数目进行逐个 计数，得到准确的蓝藻浓度，而无须通过复杂的定标系统来得到蓝藻浓度，测量结果更加精 确。2.在测量出浓度的同时，可以对样本中蓝藻的不同生理期进行分析，对水域的蓝 藻生长状况进行提前预警。3.用LED照明，大大降低了仪器成本和尺寸，有利于野外现场操作。
图1是现有透射法原理图。图2是现有荧光法原理图。图3是应用光纤的蓝藻荧光检测传感器原理图。图4是采用本发明进行检测的系统原理图。图5是本发明光电传感器的结构图。图6(a)是流动室剖面图。图6 (b)是图6 (a)的A-A剖面图。图7是流动室中检测区的检测示意图。图8是滤色片的光谱曲线图。图9是蓝藻细胞统计直方图。
具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。如图4、图5所示，本发明检测分析系统包括光电传感器100、信号处理与数据分析 单元200、吸样与液路控制单元300 ；所述光电传感器100包括光照射单元11、流动室12及 光接收探测单元13。所述光电传感器100的光接收探测单元13输出端与信号处理与数据 分析单元200输入端连接，所述吸样与液路控
制单元300与光电传感器100的流动室12连接。本发明所述光电传感器100，能够对水域样本的蓝藻浓度进行测量，包括以下部 分光照射单元11、流动室12及光接收探测单元13。如图6(a)、图6(b)所示，所述流动室12放置在流动室座中，内含一个让鞘液和样 本液流过的导孔，该导孔分为三个区域整流区121、加速区122、检测区123。其中检测区 123，也就是光照射区域为一个边长为200um 400um的方孔或者矩形孔，检测区的外形为 一个立方体或长方体，由光学透明材料制成。所述方孔的入口渐扩为鞘液通道，鞘液通道内平行插入样本液通道，样本液通道出口在所述方孔入口渐扩区域，与方孔入口正对，所述样 本液通道出口为直径0. 3mm的圆孔。方孔的入口渐扩的部分形成加速区122，鞘液通道与样 本液通道相嵌套的部分为整流区121。所述光照射单元11包括光源1及第一聚焦透镜或者透镜组16，置于光源组件的内 孔中；光源发出的光束通过透镜16形成一个聚焦光斑照射到流动室中流过的样本流上；所 述光照射单元11至少包含一个红色LED作为光源，其波长在620nm士5nm ；
3)光接收探测单元13包括第二聚焦透镜7、长通滤色片10及光电探测器8，所述第 二聚焦透镜7放在透镜座内；所述长通滤色片10以及光电探测器8放置在探测组件内，将 样本流中的粒子受到照射后产生的光信号收集到探测器上，并进行光电转换。本发明一种蓝藻的检测分析方法包括以下步骤
1、鞘流形成被测对象由两种液体形成。一是待测样本液，首先用吸样器采集水样，滤 除水样中粒径大于Imm的泥沙颗粒；然后在吸样器内部经过筛选排除空气和砂粒，余下的 浮游植物作为待测样本液；另一种是鞘液，由吸样与液路控制单元300将两种液体送至流 动室12中，两种液体在流动室12中流过，待测样本液在鞘液的包裹下流过流动室检测区 123。所述流动室12内部流动的流体要满足层流条件，即雷诺数<2300。鞘流对样本流 进行流体聚焦，将样本流压缩至小于2个蓝藻细胞的宽度，以使蓝藻细胞一个一个的通过。本发明中涉及的鞘液为生理盐水。样本液即被过滤后、含有被测蓝藻细胞的湖水。所述吸样和液路控制单元300包括压力源，气、液管路，阀，控制电路，样品过滤 装置。压力源为气泵或者注射器。2、光照射光源1采用发光二极管，经过第一聚焦透镜或透镜组16，形成一个 椭圆形光斑14，椭圆形光斑照射到流动室检测区123中流过的待测样本液上，当经过上述 流体聚焦的蓝藻细胞逐个通过时，它们就会逐个地被照射；
3、光接收探测部分蓝藻细胞15通过检测区123照射光的照射，经过照射后会产生光 学信号，所述光学信号通过光接收探测单元13，即通过第二聚焦透镜7，再通过长通滤色片 10进入光电探测器8 ；光学信号被光电探测器8接收，经过光电转换后形成电脉冲信号，送 至信号处理与数据分析单元200，每个细胞在通过的时候就会产生与此细胞特征一一对应 的一个或多个电脉冲信号，这样就实现了样本中单个细胞的测量；
所述蓝藻细胞15受到照射后产生光学信号，光学信号包括前向散射光、侧向散射光 和荧光。前向散射光FSC，指的是沿着光路传播方向广5度(士 0.3)范围内的散射光，反映 了细胞的体积大小。侧向散射光SSC，指的是垂直于光传播方向的散射光，角度范围为75度 115度(士5度)，反映了细胞的内部复杂程度。荧光的角度范围和侧向散射光角度一致，其 荧光的波长范围为640nnT850nm。为了降低成本和减小尺寸，使系统能够适用于现场检测，本发明采用LED作为光 源1。藻蓝蛋白的荧光激发谱在620nm附近。所述椭圆形光斑14短轴的长度为20士5um、长轴的长度为200士20um ；椭圆形光斑
短轴的方向与细胞流动方向一致，椭圆形光斑长轴方向垂直于细胞流动方向和光束传播方 向。如图7中所示。椭圆形光斑14在流动室中心处的大小要求为在样本流动方向上小于 2个蓝藻直径，在同时垂直于光束传播和样本流动的方向上不小于流动室内孔宽度。在垂
7直于光束传播的方向上用一个大数值孔径的第二聚焦透镜7将光信号收集到光电探测器8 上，
所述光电探测器8采用光电二级管。为了消除背景光，得到良好的信噪比，在光电探测 器8前增加一个长通滤色片10，将背景光(主要是照射光)最大限度的抑制，同时让荧光通 过。针对藻蓝蛋白的激发光谱和发射光谱特性，长通滤色片10的光谱曲线如图8所示小 于620nm的波长通过率小于0. 01%，640nnt850nm波长的通过率大于80%。4、信号处理与数据分析部分信号处理与数据分析单元200对光电探测器的电信 号进行滤波处理，并对样本的统计数据进行分析数据分析方法在至少一维的蓝藻统计数 据中划分至少2个区域，分别表示蓝藻的不同生理期，对区域中的蓝藻细胞分别计数和分 析，得到样本液的蓝藻总浓度、不同生理期的蓝藻浓度、不同生理期蓝藻所占百分比；所述 蓝藻总浓度为被测样本液中所有单个蓝藻细胞测量个数的集合。这样就实现了样本中单个 细胞的检测。检测上万个蓝藻细胞，形成统计特性就是这个样本的总体特征。在本发明中，不仅可以对水域内蓝藻的浓度进行定量测量，更进一步，可以对蓝藻 的不同生理期进行分析判断。数据分析模块将单个蓝藻细胞的荧光量统计在一起，形成直 方图，如图9所示，在直方图上划分三个区域——生长期、茂盛期、成熟期。图9给出了只用一维荧光信号进行分析的实施例。对于藻细胞来说，藻蓝蛋白的含量生长期 > 茂盛期 > 成熟期，因此在荧光量上成熟 期 < 茂盛期 < 生长期。藻蓝蛋白的激发波长峰值620nm，发射波长峰值640nm。图9的横轴为粒子的荧光量fl，纵轴为荧光量为fl的粒子的数目η。当一个蓝藻 细胞随着样本流进入光照区时产生的荧光被光电探测器8所接收，在信号处理与数据分析 单元200中形成的最终信号为fly则在图9所示的直方图中，荧光量为hiw地方的纵轴高 度iii增加1。以此类推，每个蓝藻细胞通过检测区的时候都会在其相应的横轴(荧光量)处 的纵轴高度(数目)增加1，当所有被测样本的蓝藻细胞都检测完毕的时候就形成了图9所 示的直方图。信号处理和数据分析单元200在直方图中的荧光量方向设置不同的阈值thbk， thma，thgr,当蓝藻细胞的荧光量处于某阈值内就反映了该细胞的生理状态，如某个粒子的 荧光量处于thbk，和thma之间则认为它处于成熟期m,如果细胞的荧光量位于thma和之 间则认为它处于成熟期b，如果细胞的荧光量大于thg,则认为它处于生长期g。m, b, g只 是表示蓝藻的不同生理周期——成熟期，茂盛期和生长期。信号处理和数据分析单元200将单个蓝藻细胞的光学量统计在一起，形成多维数 据空间，在数据空间上用特定的边界划分几个区域——成熟期m、茂盛期b、生长期g。落在 三个区域内的蓝藻细胞数目分别为 ，nb, ne，假设被测样本的体积为v则此被测样本的总 蓝藻浓度为
c=(nm+nb+ng)/v
不同生理期的蓝藻浓度分别为
cm=nm"
cb=nb"
cg=ng/v
不同生理期的蓝藻占本水域蓝藻总量的百分比为%M=NM/(NM+NB+NG) %B=NB/(NM+NB+NG) %G=Ng/(Nm+Nb+Ng)0在图9中，直方图全部面积代表本样本中所有蓝藻细胞个数，除以样本体积即可 得到待测样本的蓝藻总浓度。用不同的阈值标识蓝藻的不同生理期，各个区域下的面积就 是本生理期内的蓝藻细胞总数。用C，CM, Cb, Cg, %M, %B, %G来表征这片水域的蓝藻状 况。利用以上参数可以对本水域蓝藻的浓度以及各个生理期浓度进行判断。当成熟期 蓝藻细胞浓度过高时，Cm很大，预示着蓝藻水华即将爆发，当茂盛期和生长期的蓝藻浓度过 高时就意味着本区域的蓝藻含量有增加的趋势，应采取措施进行抑制，一般的抑制方法为 限制氮、磷等营养盐的进入。因此通过本发明的分析系统不但可以对蓝藻浓度进行测量，而 且可以对本水域内蓝藻的生长状况进行分析。另外一种分析方法是在数据空间上划分两个区域——成熟期M和生长期G，计算 方法同上。通过数据显示以及在数据上划分区域，在不同区域内进行计数、统计，实现对样 本蓝藻生理期的分析，能够获得比只对蓝藻总数计数更多的信息，有助于全面掌握水域的 蓝藻动态。使用本发明在一次完整的测量过程中，每个“事件”只检测一个细胞，通过多个事 件的统计特性得到整个样本的性质，使测量更加准确，无须定标。而且不但得到样本中蓝藻 总浓度，还可以对不同生理期的蓝藻浓度和比例进行分析，掌握更多的样本信息，有利于对 本水域的蓝藻的生长情况进行早期预警。
权利要求
1.一种蓝藻的检测分析方法，其特征是包括以下检测分析步骤(1)、鞘流形成被测对象由两种液体形成，一种是待测样本液，首先用吸样器采集水 样，滤除水样中粒径大于Irnm的泥沙颗粒；然后在吸样器内部经过筛选排除空气和砂粒，余 下的浮游植物作为待测样本液；另一种是鞘液；由吸样与液路控制单元将两种液体送至流 动室中，待测样本液在鞘液的包裹下流过流动室检测区，在流体聚焦的作用下将样本液压 缩至2个蓝藻细胞的宽度，使蓝藻细胞逐个通过流动室检测区；(2)、光照射部分光源经过第一聚焦透镜或透镜组，形成一个椭圆形光斑，椭圆形光斑照射到流动室检 测区中流过的待测样本液上；鞘液在流动室整流区中形成层流，在流动室加速区中将样本 液逐渐聚焦，直至在流动室检测区中将待测样本液压缩成直径为小于2个蓝藻细胞尺度的 样本流，这样待测样本液中的蓝藻细胞就只能一个一个的通过检测区照射光的照射，在每 次检测事件中只能检测一个细胞；(3)、光接收探测部分蓝藻细胞逐个地受到检测区照射光的照射而产生光学信号，所 述光学信号通过第二聚焦透镜收集，再通过长通滤色片进入光电探测器；光学信号被光电 探测器接收，经过光电转换后形成电脉冲信号，送至信号处理与数据分析单元，一个细胞流 过检测区时就形成一个电脉冲信号，这样就实现了样本中单个细胞的逐个测量；(4)信号处理与数据分析部分信号处理与数据分析单元对光电探测器的电信号进行 滤波处理，并对样本的统计数据进行分析，根据分析方法在至少一维的蓝藻统计数据中划 分至少2个区域，分别表示蓝藻的不同生理期，对区域中的蓝藻细胞分别计数和分析，得 到样本液的蓝藻总浓度、不同生理期的蓝藻浓度、不同生理期蓝藻所占百分比；所述蓝藻总 浓度为一次测量过程中所有脉冲的总数目除以被测体积。
2.如权利要求1所述的一种蓝藻的检测分析方法，其特征是所述流动室包含一个液 体流过的导孔，该导孔分为三个区域整流区、加速区、检测区；所述检测区是光照射区域 为一个边长为200um 400um的方孔或者矩形孔，由光学透明材料制成；所述方孔或矩形孔 的入口渐扩的部分形成加速区，鞘液通道与样本液通道相嵌套的部分为整流区。
3.如权利要求2所述的一种蓝藻的检测分析方法，其特征是所述样本液通道出口为 直径0. 3mm的圆孔。
4.如权利要求1所述的一种蓝藻的检测分析方法，其特征是所述光源采用发光二极 管；所述光电探测器采用光电二极管。
5.如权利要求4所述的一种蓝藻的检测分析方法，其特征是所述发光二极管的波长 620 士 5nm，透光波长为 640nm 850nm。
6.如权利要求1所述的一种蓝藻的检测分析方法，其特征是所述流动室内部流动的 液流要满足层流条件，即雷诺数<2300 ；鞘流对样本流进行流体聚焦，将样本流压缩至小于 2个蓝藻细胞直径的宽度。
7.如权利要求1所述的一种蓝藻的检测分析方法，其特征是所述椭圆形光斑短轴的 长度为20士5um、长轴的长度为200士20um ；椭圆形光斑短轴的方向与细胞流动方向一致， 椭圆形光斑长轴方向垂直于细胞流动方向和光束传播方向。
8.如权利要求1所述的一种蓝藻的检测分析方法，其特征是所述椭圆形光斑在流动 室中心处的大小要求为在样本流动方向上小于2个蓝藻直径，在同时垂直于光束传播和样本流动的方向上不小于流动室内孔宽度；在垂直于光束传播的方向上用一个大数值孔径 的第二聚焦透镜将光信号收集到光电探测器上。
9.如权利要求1所述的一种蓝藻的检测分析方法，其特征是所述蓝藻细胞受到照射 后产生的光学信号包括前向散射光、侧向散射光和荧光，所述前向散射光指的是沿着光路 传播方向广5度范围内的散射光，反映了细胞的体积大�。徊嘞蛏⑸涔庵傅氖谴怪庇诠獯� 播方向的散射光，角度范围为75度 115度，反映了细胞的内部复杂程度；荧光的角度范围 和侧向散射光角度一致，其荧光的波长范围为640ηπΓ850ηπι。
全文摘要
本发明涉及一种蓝藻的检测分析方法，其包括以下检测分析步骤由吸样与液路控制单元将两种液体送至流动室中，待测样本液在鞘液的包裹下流过流动室检测区；光源照射到流动室检测区中流过的待测样本液上；待测样本液中的蓝藻细胞通过检测区照射光的照射，经过照射后会产生光学信号被光电探测器接收，经过光电转换后形成电信号，送至信号处理与数据分析单元；信号处理与数据分析单元对光电探测器的电信号进行滤波处理，并对样本的统计数据进行分析。本发明可实现对待测样本所含的蓝藻细胞进行逐个测量；其不仅精确得到蓝藻的浓度，而且对蓝藻的不同生理期进行分析，有助于对水域中的蓝藻生长状况进行提前预警。
文档编号G01N21/64GK102095686SQ20101059825
公开日2011年6月15日 申请日期2010年12月21日 优先权日2010年12月21日
发明者孔巢城, 楚建军, 赵丙强, 陈力 申请人:无锡荣兴科技有限公司
专业数控铣床产品供应商
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