专利名称：植物大发表的药用活性成份及制备方法、质量标准控制方法
技术领域：
本发明涉及一种植物大发表的有效组份、制备方法，以及该有效组分的质量标准控制方法。
背景技术：
大发表为豆科植物三棱枝杭子梢，拉丁名Campylo-tropis trigonoclada[Franch]A.K.schindl.俗名亦称为“松漏争”。大发表在自然界中至少分布在中国云南省、贵州省、四川省，为多年生小灌木。为保护资源，一般以地上部份入药。在中国专利(申请号96121261.6)中公开了大发表用于治疗前列腺增生和前列腺炎症及其提取方法，但没有公布有效成份。用所述的提取方法所提取的大发表提取物中，其主要成分含有75％以上的多糖，还含有其他成分。由于前述的提取方法不清楚鞣质是主要的有效成份，因此采用热回流提�。斐捎行С煞蓣分蚀罅科苹�(提取物中已基本检测不出儿茶素成份)。原工艺制剂服用剂量大，以生药50克计，每日需服用最大号胶囊0号胶囊12粒，共计6克提取物，是一种粗笨的制剂，患者不易接受。并且制剂中含大量糖份，极易吸湿，一般半年胶囊内容物就开始吸湿板结，严重影响销售。
发明内容
本发明的目的在于提供植物大发表的有效组份——即植物大发表的药用活性成份。
本发明的另一目的在于提供这种药用活性成份的制备方法。
本发明的再一目的在于提供这种药用活性成份的质量标准控制方法。
本发明所述的植物大发表的药用活性成份为含邻酚羟基成份。
上述的含邻酚羟基成份为鞣质和黄酮；所述的鞣质的基本缩合单位为儿茶素，包含(+)-儿茶素、(-)-儿茶素、(+)-表儿茶素、(-)-表儿茶素、(+)-棓儿茶素(2R，3S)和(-)-表棓儿茶素(2R，3R)；所述的黄酮主要为异荭草苷(Isoorientin)、荭草苷(Orientin)和芦丁(Rutin)。结构式如下
Rutin Orientin Isoorientin芦丁 荭草苷 异荭草苷 (+)-catechin (-)-epicatechin(+)-儿茶素(2R，3S)(-)-表儿茶素(2R，3R) (-)-catechin (+)-epicatechin(-)-儿茶素(2S，3R) (+)-表儿茶素(2S，3S) (+)-gallocatechin (-)-epigallocatechin(+)-棓儿茶素(2R，3S) (-)-表棓儿茶素(2R，3R)本发明所述的植物大发表的药用活性成份的制备方法由以下步骤组成一、药材大发表粉碎后，用任意比例的乙醇-水溶液55℃以下浸泡提取，提取液减压浓缩得粗提物；
二、上述粗提物与0.7-2倍重量的大孔吸附树脂，拌匀上柱，2-5倍柱体积的洁净水洗脱至无色，洗脱液弃之；三、继续用70％-100％乙醇冲洗至流出液变为无色，收集洗脱液，减压干燥，得到药用活性成份。
上述步骤一中的提取温度高于55℃鞣质会大量分解，温度低于10℃浸取时必须延长。因此从生产实际出发，以15-45℃为最佳提取温度。浸泡提取时间为5-72小时，优化的为12-48小时；步骤二中所述的大孔吸附树脂可为药用级的聚苯乙烯型树脂，如AmberliteTMXAD16(美国罗门哈斯公司生产)、JKSD、DA101等型号，或几种树脂的组合；步骤四中所述的葡聚糖凝胶可以为Sephadex系列中任一种或几种的组合、DEAE系列中任一种或几种的组合、Dextran系列中任一种或几种的组合等；所述的乙醇浓度为体积浓度w/v(重量/体积)。
上述步骤二洗脱出的部分即为多糖，占粗提物中的比例极大，但其不是有效的药用活性成分，在本发明中可以弃之不用。本发明的制备方法是保留鞣质和黄酮并防止鞣质的分解。
上述步骤三所提取得到的药用活性成份为鞣质和黄酮，由于鞣质和黄酮均为药用活性成份，所以在工业生产中没有必要进行进一步的细分，以减少工业成本和工艺步骤。但供药理筛选实验用的样品必须将鞣质和黄酮分离开，才能进行实验。用上述步骤再进行以下步骤，可以分别得到鞣质和黄酮。
本发明所述的植物大发表的药用活性成份的药理筛选样品由以下步骤组成一、药材大发表粉碎后，用0-100％任意比例的乙醇-水溶液55℃以下浸泡提�。崛∫杭跹古ㄋ醯么痔嵛铮欢�、上述粗提物与0.7-2倍重量的大孔吸附树脂，拌匀上柱，2-5倍柱体积的洁净水洗脱至无色，洗脱液弃之；三、继续用70％-100％乙醇继续冲洗至无色，收集洗脱液，减压干燥，得到药用活性成份；四、上述步骤三所得到的药用活性成份与2-5倍体积的葡聚糖凝胶拌匀，先用水洗脱，洗脱液丢弃，再用20％-30％乙醇洗脱，收集被洗脱下来的部位，减压干燥，得鞣质部份，供药理筛选用；五、重新取上述步骤三所得到的药用活性成份适量用5-10倍体积60-90％乙醇液充分溶解，用明胶法去除鞣质，减压干燥后得黄酮部位，供药理筛选用。
步骤五所述的明胶法为在60-90％乙醇液中，调ph9-10.5，滴入10％明胶溶液至不再产生新沉淀，可基本除尽鞣质。
本发明所述的植物大发表的药用活性成份的质量标准控制方法有以下几种方法用FeCl3法、NaCl-明胶法和HCHO-HCl法定性鉴别鞣质，用Mg-HCl法、Zn-HCl法定性鉴别黄酮。
根据鞣质和黄酮具有的收缩膀胱肌和缩张尿道平滑肌的生理活性，定性和半定量鉴别鞣质和黄酮。
用络合滴定法定量检测邻酚羟基含量。以乙二胺四乙酸二钠为络合剂，以铬黑T为指示剂，溶液由红色至蓝色即为终点，通过乙二胺四乙酸二钠的用量可以计算出邻酚羟基含量。
用皮粉法定量检测鞣质的含量。
用比色法定量检测邻酚羟基的含量。针对邻酚羟基团可以用氧化剂还原，生成有颜色的产物，可用比色法进行定量测定，如磷钼酸法、磷钼酸-磷钨酸法、三氯化铝法等。
用薄层色谱法定性鉴别大发表提取物中异荭草苷、荭草苷和芦丁的存在。
用高效液相法定量检测(+)-儿茶素、(-)-儿茶素、(+)-表儿茶素、(-)-表儿茶素、(+)-棓儿茶素(2R，3S)和(-)-表棓儿茶素(2R，3R)、异荭草苷、荭草苷、芦丁的存在。在此方法中，任意一种或几种成份的含量可以作为测定有效部位的指标成份。
本发明的优点在于明确了大发表中的有效组份，为工艺和质量标准的改进提供了依据。通常认为鞣质不是生物活性成份，在大多数植物药提取工艺中要尽量去除。因此原工艺并不考虑鞣质是主要的有效成份，采用热回流提�。斐捎行С煞蓣分蚀罅科苹�(鞣质指标性成份儿茶素在提取物中已基本检测不出)。新工艺不但通过降低提取温度以防鞣质分解，从而最大限度地保存鞣质的活性，而且采用大孔吸附树脂法富集鞣质和黄酮，丢弃多糖，极大减少了服药量。以生药50克计，老工艺制剂每日需服用药物6克，新工艺制剂只需1.2克制剂。大孔吸附树脂法工艺去除了制剂中大量糖份，使制剂吸湿性降低，延长了药品贮存时间，降低了药品包装要求。每日服用量相当于生药20-500克，优化的为50-100克。
明确了大发表中的有效组份后，另一个优点是可以设定有效和完善的质量控制标准。可以通过定性、定量和生物检测的手段，严格保证产品质量。
为了更好地理解本发明的实质，下面将用大发表的药理试验及结果来说明。
一、实验药物的制备(一)用现有工艺制得对比制剂KS药材大发表粉碎后，用0-100％任意比例的乙醇-水溶液提�。捎萌然亓�2小时的方法，提取3次，提取液减压浓缩至相对密度为1.02-1.10(45-50℃)浸膏，得粗提物KS收率7.8％。
(二)用本提取方法制得本制剂ESLA药材大发表粉碎后，用0-100％任意比例的乙醇-水溶液提�。捎美浣�72小时的方法，提取3次，提取液减压浓缩至相对密度为1.02-1.10(45-50℃)浸膏，得粗提物，粗提物与等重量大孔吸附树脂AmberliteTMXAD16，拌匀上柱，2.5倍柱体积的洁净水洗脱至无色，收集洗脱液，减压干燥，得多糖部位，供药理实验用，收率6.5％。95％乙醇继续冲洗至无色，收集洗脱液，减压干燥，得ESLA，收率1.2％。ESLA与两倍体积Sephadex LH-20葡聚糖凝胶拌匀，先用水洗脱，洗脱液丢弃。再用20％乙醇洗脱，收集洗脱液。用洗脱液点样，用TCL法展开，1％三氯化铝显色，以指示黄酮；以1％三氯化铁显色，以指示鞣质。收集被洗脱下来的鞣质部位，减压干燥，得ESLA(A)，供药理实验用。ESLA用6倍体积水充分溶解，用明胶法去除鞣质，减压干燥后得黄酮部位ESLA(B)，供药理实验用。
二、理化分析(一)KS和ESLA的化学成份预试取一定量KS或ESLA粉，以甲醇于室温搅拌三次，每次30分钟，过滤，合并甲醇液，回收至干，经石油醚脱脂后为甲醇溶样品。过滤后的沉淀以水于室温搅拌三次，每次30分钟，抽滤，水液部分回收至干为甲醇不溶样品。
取甲醇溶样品和甲醇不溶样品，以乙醇(70％)配制成10％的溶液，供以下第1和第2项检测备用。
取甲醇溶样品和甲醇不溶样品样品，以水配制成10％的溶液，供以下第3至第5项检测备用。
实验结果在该项目的定性检测中，KS和ESLA有相同的显色反应。
结果讨论甲醇溶部份对Mg-HCl呈阳性，示含有黄酮体；而对Zn-HCl呈阳性，进一步提示含有黄酮醇3-O-糖甙或二氢黄酮醇。对FeCl3呈绿黑色，提示该部份有邻酚羟基化合物存在。
甲醇不溶部份对FeCl3、NaCl-明胶均呈阳性，提示有鞣质存在；对HCHO-HCl呈阳性，提示有缩合型鞣质存在。
(二)皮粉法测ESLA中鞣质含量参照中国药典2000版一部附录XB用皮粉法测ESLA中鞣质含量。取ESLA粉末(三号筛)2g，精密称定，置锥形瓶中，加水150ml，于水浴上加热30分钟，冷却后，移入250ml量瓶中，用水稀释至刻度，滤过，滤液作为供试液。
总水溶性部分的测定精密量取供试液25ml，蒸干，残渣于105℃干燥3小时，称重(T1)。
不与皮粉结合的水溶性部分的测定精密量取供试液100ml，加皮粉(干燥品6g)，振摇15分钟，滤过，精密量取滤液25ml，蒸干，残渣于105℃干燥3小时，称重(T2)。
皮粉水溶性部分的测定精密量取水100ml，加皮粉(干燥品6g)，振摇15分钟，滤过，精密量取25ml，蒸干，残渣于105℃干燥3小时称重(T0)。
按下式计算鞣质的百分含量鞣质含量％＝(T1-T2+T0)×10÷W×100％式中W为取样量(干燥品)。
经测定，批号为20020408的ESLA鞣质含量为55.5％。
(三)比色法(UV法)测ESLA中邻酚羟基成份(鞣质和黄酮)已知的大发表中的鞣质和黄酮均含有邻酚羟基，多糖类不具有邻酚羟基。鞣质和某些黄酮(如异荭草苷、荭草苷)含有邻酚羟基，具有很强的还原性。这也是它们的生物活性的物质基础。含有邻酚羟基的鞣质和黄酮在人体内具有极强的清除超氧自由基的作用。超氧自由基是引起人体衰老和多种疾病的原因。
利用邻酚羟基能与磷钼酸试剂产生颜色反应，在760nm波长处有最大吸收的特性进行比色测定，可以检查出含邻酚羟基的鞣质和黄酮的总含量。该显色剂不限于磷钼酸，还可以是磷钼酸-磷钨酸试剂、三氯化铝等。当显色剂为磷钼酸-磷钨酸时，检测波长为703nm，显色剂为三氯化铝时，检测波长为203nm。
磷钼酸法测ESLA中邻酚羟基含量磷钼酸试液取磷钼酸5g，加无水乙醇使溶解成100ml，即得。
对照液取儿茶素标准品0.02g，置入25ml容量瓶，加入10ml水中轻微振摇并于35℃水浴中恒温15分钟，用微量移液管加入磷钼酸试液0.20ml，35℃水浴中恒温并轻微振摇15分钟，用水补足25ml，继续轻微振摇5分钟。
取ESLA 0.1g，精密称定，加入10ml水中搅拌并于35℃水浴中恒温15分钟，滤纸过滤，滤液移入25ml容量瓶。用移液管加入磷钼酸试液1.00ml，35℃水浴中恒温并轻微振摇15分钟，用水补足25ml，继续轻微振摇5分钟。
比色法检测时，以水为空白对照，儿茶素对照液为参比值，760nm为检测波长。该法测得ESLA中鞣质和黄酮的总含量为28.6％。
(四)络合滴定法检测邻酚羟基含量邻酚羟基可以被螯合剂络合，通过计算螯合剂的消耗量而得出邻酚羟基团的含量。
取ESLA样品2.0g，加入50％丙酮的水溶液100ml，超声提取(频率35KHz)1小时，过滤，滤液55℃以下减压蒸干黄酮，得邻酚羟基成份的水溶液。精密吸取20ml 1M醋酸锌标准液加入500ml容量瓶中，加14ml氨水，摇匀使白色沉淀溶解.将上述制得的鞣质水溶液加蒸馏水稀释到400ml，于水浴上温热至35±2℃，然后定量的移入容量瓶中，并不断振�。�35±2℃30分钟(间歇振摇数次)，冷至室温，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀后干滤纸过滤，收集续滤液。
鞣质含量的测定精密吸取滤液20ml于锥形瓶中，加300ml蒸馏水，25ml氨-氯化铵缓冲液(PH＝10)，加铬黑T指示剂少许，然后以0.05M乙二胺四乙酸二钠标准液滴定，溶液由红色至蓝色即为终点，以下式计算结果，鞣质含量％＝0.1556×V÷W×100％0.1556由实验求得的比例常数V1M醋酸锌标准液的络合沉淀消耗量＝20×MZn-25×Me×QMZn醋酸锌标准液的克分子浓度Me乙二胺四乙酸二钠标准液的克分子浓度Q乙二胺四乙酸二钠标准液滴定消耗量(ml)W样品重量(克)以该法测得的ESLA样品鞣质含量为32.9％。
(五)ESLA中黄酮的分离及结构鉴定ESLA脱酯浸膏500克，以1500ml甲醇于室温搅拌提取三次，每次2小时，过滤，甲醇可溶部份减压回收至干，加入3000ml水成悬浮液，用水饱和的正丁醇萃�。〈驾腿∫夯厥罩粮傻�110克。该部份以甲醇溶解，吸附于220克硅胶上(60-100目)，室温挥干，以400克硅胶柱层析(200-300目)，CHCl3-MeOH-H2O(7∶8∶0.8)混合溶剂洗脱，按色带分成6个部份，其中第3至6主含黄酮，合并后，以D101大孔吸附树脂柱层析，H2O-EtOH(100％-90％)洗脱，将含有黄酮的流分合并，回收至干得61克。
61克粗黄酮以甲醇溶解，吸附于100克硅胶(60-100目)，用450克硅胶(200-300目)柱层析，EtOAC-MeOH-H2O(15∶2∶1)洗脱，每250ml为一流分，第5-7合并，得10克(FR I，主含荭草苷)；第11-17合并得7克(FRIII，主含异荭草苷和芦丁)。
FR I以甲醇溶解，吸附于20克硅胶(60-100目)，以60克硅胶(200-300目)柱层析，EtOAC-MeOH-H2O(15∶2∶1)洗脱，每60ml为一流分，第2-5合并，得4.5克。取0.6克，以LichroprepRP-18柱层析，30％EtOH-H2O洗脱，得化合物荭草苷。
FRIII以甲醇溶解，吸附于14克硅胶(60-100目)，用50克硅胶(200-300目)，EtOAC-MeOH-H2O(15∶2∶1和20∶2∶1)反复柱层析，得化合物芦丁和粗异荭草苷部分。
粗异荭草苷部分以LichroprepRP-18柱层析，20％EtOH-H2O洗脱，第7-25合并，得化合物异荭草苷。
(六)薄层色谱法(TLC法)与高效液相法(HPLC法)检测ESLA中黄酮取ESLA粉末25mg，精密称定，置锥形瓶中，用5ml甲醇溶解，于水浴上超声助溶30分钟，冷却后，移入25ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，通过2.2μm微孔滤膜滤过，滤液作为供试液。
另取异荭草苷、荭草苷、芦丁的对照品，分别用甲醇溶解，配成每毫升含对照品1mg的对照品溶液。芦丁标准品购于中国药品生物制品检验所，异荭草苷、荭草苷购于德国PHYTOPLAN公司。
薄层色谱法的步骤为取大发表提取物0.5g，加水20mL，超声处理(功率250W，频率25KHz)30分钟，滤过，滤液用水饱和正丁醇提取3次(20mL、10mL、10mL)，合并正丁醇提取液，用10mL水洗涤，分取正丁醇层，蒸干。残渣加甲醇5mL使溶解，作为供试品溶液。另取异荭草苷、芦丁对照品，加甲醇制成每1mL各含0.5mg的混合溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2000年版一部附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各1～2μL，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以异丙醇-水(3∶2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1％三氯化铝乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
薄层色谱法中薄层板、流动相和显色剂的选择不是唯一的，比如薄层板还可以用硅胶G板，但标准品必须用异荭草苷、荭草苷、芦丁中一种或几种。
高效液相法色谱步骤为对照品溶液的制备精密称取异荭草苷对照品适量，加70％甲醇制成每1mL含0.05mg异荭草苷的溶液，作为对照品溶液。
供试品溶液的制备 取大发表提取物或其制剂形式0.6g，精密称定，置50mL具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇20mL，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率25KHz)30分钟，称定重量，用70％甲醇补足减失重量，摇匀，放置，取上清液于具塞离心管内，密塞，离心(4000转/分钟)10分钟，取上清液适量通过微孔滤膜(0.45μm)作为供试品溶液。
色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相乙腈-水-磷酸(10∶90∶0.1)；检测波长350nm；柱温40℃；流量1.0mL/min。理论塔板数按异荭草苷峰计算应不低于3000。
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μL，注入高效液相色谱仪，测定，即得。
折算每日所服异荭草苷不得少于1.2mg。
高效液相法中色谱柱、流动相、检测波长和方法、柱温、流速的选择均不是唯一的，但标准品必须用异荭草苷、荭草苷、芦丁中一种或几种。
(七)高效液相法(HPLC法)检测ESLA中鞣质标准品(+)-儿茶素(2R，3S)[(+)-catechin]，(-)-儿茶素(2S，3R)[(-)-catechin]，(-)-表儿茶素(2R，3R)[(-)-epicatechin]，(+)-表儿茶素(2S，3S)[(+)-epicatechin]，(+)-棓儿茶素(2R，3S)[(+)-gallocatechin]，(-)-表棓儿茶素(2R，3R)[(-)-epigallocatechin]均购自美国SIGMA公司。
仪器为日本岛津产LC-10A系列高效液相色谱仪(包括体积20微升的AGE型通用高效液相色谱仪进样器，SPD-10A型可变波长紫外检测器，温度控制系统，CR7A数据台，LC-10AD型输液泵，SCL-10A型自动系统控制器)，超声波脱气器，滤膜过滤器等。
方法1)准确称取ESLA 0.1g，用双蒸水溶解于100ml容量瓶中，经微孔滤膜过滤作为待测样品。
2)高效液相色谱条件色谱柱(德国产)LDC/Milton Roy，RivieraBeach，FL33404 ODS。填料粒径5μm。填料表面处理OSD2。检测器紫外检测器(280nm)。流动相双重蒸水/乙睛/乙酸乙酯(86/12/2v∶v∶v)加浓硫酸调PH值于3.0-4.0。柱温40℃。流速1ml/min。
在此条件下，以上六个标准品可达基线分离。检测出ESLA中(+)-儿茶素、(-)-儿茶素、(-)-表儿茶素、(+)-表儿茶素含量分别为0.95％，0.86％，1.23％，0.52％，(+)-棓儿茶素(2R，3S)和(-)-表棓儿茶素(2R，3R)的含量分别为0.13％，0.09％。
以上所述高效液相法中色谱柱、流动相、检测波长和方法、柱温、流速的选择均不是唯一的，但标准品必须用(+)-儿茶素(2R，3S)、(-)-儿茶素(2S，3R)、(-)-表儿茶素(2R，3R)、(+)-表儿茶素(2S，3S)、(+)-棓儿茶素(2R，3S)、(-)-表棓儿茶素(2R，3R)中一种或几种。
药理实验(一)ESLA对离体膀胱肌和尿道平滑肌的作用研究1、ESLA对离体大鼠(或其它动物)膀胱平滑肌的收缩作用选取成年雄性大鼠(320-400g)或其它动物，脱颈椎处死后立即分离出膀胱制成条片(10×2mm)，悬置于盛有25ml Kerb’s营养液的麦氏浴皿中，恒温36±1℃，负荷500mg。稳定30min，给药换液后休息十分钟。以0.1ml0.0625％的Ach(终浓度相当于2.5μg/ml)收缩幅度为100％，分别给予ESLA200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml、KS400μg/ml、舍尼通400μg/ml及其它试药高特灵5-25μg/ml、竹林胺10μg/ml、津源灵10μg/ml。结果见表1表1大发表各组份对大鼠膀胱肌条的收缩作用
其它试药ESLA(B)、多糖类加至400μg/ml对膀胱无影响，说明大发表中黄酮、多糖类无膀胱收缩作用；高特灵5-25μg/ml、竹林胺10μg/ml、津源灵10μg/ml(均为α-受体拮抗剂)未见收缩膀胱肌的作用。从大发表中分离的两个二聚体和一个三聚体均无收缩膀胱肌的作用。
2.ESLA对兔(或其它动物)离体尿道平滑肌的舒张作用选用雄性日本大耳兔或其它动物，棒击后脑处死后立即分离出尿道制成条片(10×2mm)，悬置于麦氏浴皿中，加入25ml Kerb’s营养液，恒温36±1℃，负荷500mg。稳定30min，加入NA 0.1ml(相当于10μg/ml)，至曲线平稳后，分别加入ESLA100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、大发表(KS)200μg/ml、舍尼通100μg/ml及其它试药竹林胺10μg/ml。记录35分钟，观察药物对抗NA所致尿道收缩作用。以NA所致收缩作用为100％，计算各药舒张率。结果见表2表2ESLA对家兔离体尿道平滑肌的松弛作用
实验中我们除再次认为ESLA(A)为有效组份外，ESLA(B)也是有效组份，详见表3。表3中实验观察时间为20分钟。
表3ESLA(B)对家兔离体尿道平滑肌的松弛作用
大发表中的多糖类加至400μg/ml无舒张尿道平滑肌作用。
实验结果1、大发表中鞣质类成份既能够收缩膀胱平滑�。帜芄凰沙谀虻榔交。仆芄凰沙谀虻榔交。虼苏饬嚼喑煞菔侵饕挠行С煞�。多糖类不具有这两方面作用，提示不是改善排尿功能所需成份。
2、临床上能够改善前列腺疾病所引起的排尿困难的药物主要有
(1)α-拮抗剂类，通过松驰膀胱颈及前列腺平滑�。獬拍蚬Ｗ柚⒆矗ㄖ窳职�(盐酸酚苄明片)、高特灵(盐酸特拉唑嗪)、哈乐、X-ATRAL等，此类药物对膀胱肌无收缩作用；(2)5α-羟基还原酶抑制剂，抑制双氢睾酮的产生，治疗良性前列腺增生，使增大的前列腺缩�。佣纳颇蛄鳎硪┪锸潜Ａ兄危枰瘟瓢肽瓴趴加行В�(3)植物花粉提取物舍尼通具有与大发表类似的双相调节作用，但从我们的实验和文献报道[1][2]来看，作用比大发表要弱得多。
3、由以上实验模型我们筛选出黄酮和鞣质为主要有效成份，多糖类为无效成份；并且在改善排尿功能方面，大发表提取物具有作用机制合理，起效迅速；ESLA富集了有效成份，作用比KS强。
(二)在体动物膀胱内压的影响SD雄性大鼠，20~23周龄[1]，提前一天灌胃给药，分别给予清洁水、ESLA0.27g/kg、0.135g/kg、0.067g/kg、KS 1.06g/kg、KS 0.53g/kg、KS0.27g/kg以及舍尼通50mg/kg，每日一次，连续四天。末次给药后一小时腹腔注射乌拉坦(1.0g/kg)麻醉。
参考Keisvke Yokoi[2][3]和铃木孝宪等[4]的方法，在耻骨弓上部纵向切开，暴露膀胱。在膀胱底用线松松打一活结。膀胱顶部剪一小洞，插入一根导管(直径1.2mm)，导管通过血压传感器与生理记录仪相连；导管内扎入7号针头与蠕动泵相连(灌注速度为0.2ml/min)。描记泵启动后的图形，至出现排尿反射，停止泵液。记录排尿时间、排尿阈值(开始排尿压力)、最大排尿压(排尿反射引起的一过性最大压力)、停尿压(排尿结束后压力)。排尿结束曲线走平后重复一次，记录排尿阈值、最大排尿压。计算激发压、最大膀胱容量。排尿结束后结扎膀胱底的线，剪下膀胱，重差法计算残尿量。
激发压＝最大排尿压-排尿阈值最大膀胱容量＝排尿时间×灌注速度实验结果见表4和表5表4 ESLA对大鼠膀胱内压的影响(n＝8)单位KPa
x±SD，t-test *P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001表5 ESLA对大鼠最大膀胱容量和残尿量的影响(n＝8)单位克
结果(1)、KS和ESLA各剂量组均可升高最大排尿压、激发压，中、高剂量与正常组相比均有显著性差异(P＜0.05)，表明KS和ESLA可增加膀胱平滑肌的收缩力及增强排尿反射；ESLA的作用与KS相似。
(2)、KS和ESLA对最大膀胱容量无明显影响(P＞0.05)，但均显著减少残尿量，ESLA比KS效果更好。KS和ESLA中、高剂量与正常组相比有显著性差异，ESLA在低剂量时(5倍人体剂量)仍然有效(P＜0.05)，而KS低剂量时已无明显效果。ESLA和KS既可松弛膀胱颈平滑�。帜茉黾影螂妆颇蚣〉氖账�(见离体实验部份)，因而可同时减小最大膀胱容量和残尿量。舍尼通和竹林胺主要是松弛膀胱颈平滑�。圆心蛄考跎俨幻飨�。
(3)、植物花粉制剂舍尼通可以降低排尿阈值(P＞0.05)，但升高最大排尿压(P＜0.05)，升高激发压(P＜0.05)，说明舍尼通主要降低排尿阻力。
(4)、各受试药物对停尿压均无明显影响(P＞0.05)。
4、对消痔灵所致非细菌性前列腺炎症的影响试验5、不同药物联合的增效作用取2×105个结核杆菌培养24小时后用同浓度(5ug/ml)不同药物处理24小时，检测细胞生长抑制率(％)，结果见表3表3 不同药物联合的增效作用(抑制率％)
实验5结果表明，抗结核病药利福平及利福平类似物单独应用均有明显的抑菌作用，但联合应用的效果为好(P＜0.01)。
总之，局部放置及局部注射利福平或利福平类似物缓释剂对细菌生长均有明显的抑制作用，所表现出的显著的治疗作用与其局部获得的有效药物浓度有关。因此，本发明所述的缓释剂的有效成分为利福平或任意一种利福平类似物。所用的利福平类似物可为但不限于利福霉素、利福喷汀和利用布汀。
含有以上有效成分的药物可制成缓释微球，进而制成缓释注射剂和植入剂，其中以与含助悬剂的特殊溶媒组合形成的混悬注射剂为优选。
缓释注射剂或缓释植入剂还可通过以下实施方式得以进一步说明。上述实施例及以下实施例只是对本发明作进一步说明，并非对其内容和使用作任何限制。
具体实施方式
实施例1.
将90、90和80mg聚苯丙生(对羧苯基丙烷(p-CPP)∶葵二酸(SA)为20∶80)共聚物分别放入(甲)、(乙)及(丙)三个容器中，然后每个中加100毫升二氯甲烷，溶解混匀后，分别加入10mg利福平、10mg利福霉素、10mg利福平和10mg利福霉素，重新摇匀后用喷雾干燥法制备含10％利福平、10％利福霉素及10％利福平和10％利福霉素的注射用微球。然后将微球悬浮于含15％甘露醇的生理盐水中，制得相应的混悬型缓释注射剂。注射剂的黏度为300cp-600cp(20℃-30℃时)。该缓释注射剂在体外生理盐水中的释药时间为15-20天，在小鼠皮下的释药时间为30-40天左右。
实施例2.
加工成缓释注射剂的方法步骤与实施例1相同，但所不同的是所含抗结核有效成分及其重量百分比为(a)2-40％的利福平、利福霉素、利福喷汀或利用布�。�
基本正常炎细胞偶见或无。0分轻度少量炎细胞散在浸润。3分重度大量炎细胞浸润，有的还可见多核巨噬细胞形成炎性肉芽肿性病变。6分4、纤维组织增生程度分级标准基本正常偶见极少量纤维组织增生或无。0分同轻度少量纤维组织增生。3分重度大量纤维组织增生。6分小结与讨论1、本实验采用比较成熟且效果与临床有较好相关性的消痔灵致炎法，造成大鼠非细菌性慢性前列腺炎模型。从前列腺腺体管腔大小、腺体分泌物多寡、间质炎细胞浸润和纤维组织增生四项病理改变的指标进行疗效评价，综合结果表明新工艺制剂ESLA大、中、小三个剂量组和原工艺制剂KS大、中、小三个剂量组均对大鼠慢性前列腺炎显示明显治疗的效果，与模型组比较P＜0.05～0.001。尤其表现为对前列腺腺体管腔的梗阻、炎细胞浸润和间质纤维组织增生等方面，部分给药组能够恢复到接近操作对照组水平。按综合疗效(病变总分)排列顺序为ESLA中(7.0)＜KS中(7.42)＜ESLA大(8.25)＜ESLA小(9.25)＜KS大(9.66)＜舍尼通(11.66)＜KS小(11.75)，本发明优于原工艺药效。说明以鞣质和黄酮为目标的工艺改革是成功的。
具体实施例方式
以下制备方式中每日服用量相当于生药20-500克，优化的为50-100克。
实施例1用20％的乙醇溶液提�。捎檬椅吕浣�72小时的方法，提取大发表固体粉碎物3次，提取液减压浓缩至相对密度为1.06(45-50℃)浸膏，得粗提物。粗提物与等重量大孔吸附树脂AmberliteTMXAD16，拌匀上柱，5倍柱体积的洁净水洗脱至无色，弃去该部份洗脱液。70-95.7％乙醇，如80％，继续冲洗至无色，收集洗脱液，得精提物。可将精提物加入淀粉及相应的辅料，混匀后装入胶囊中制成胶囊剂。
实施例2用60％的乙醇溶液提�。捎美浣�72小时的方法，提取大发表固体粉碎物3次。提取液减压浓缩至相对密度为1.08(45-50℃)浸膏。浸膏与等重量大孔吸附树脂(DA101型号)拌匀上柱，3倍柱体积的洁净水洗脱至无色，弃去该部份洗脱液。80-95.7％乙醇继续冲洗至无色，收集洗脱液，得ESLA，真空干燥。研磨后加入微粉硅胶、淀粉，混匀后压片制成片剂。
实施例3用50％的乙醇溶液提�。捎�45℃温浸12小时的方法，提取3次。提取液减压浓缩至相对密度为1.10(45-50℃)浸膏，得粗提物。粗提物与等重量JKSD型号的大孔吸附树脂，拌匀上柱，5倍柱体积的洁净水洗脱至无色，弃去该部份洗脱液。70-100％乙醇，如95％，继续冲洗至无色，收集洗脱液，得精提物。可将精提物加入淀粉及相应的辅料，混匀后装入胶囊中制成胶囊剂。
权利要求
1.植物大发表的药用活性成份，其特征在于为含邻酚羟基成份。
2.按照权利要求1所述的植物大发表的药用活性成份，其特征在于所述的含邻酚羟基成份主要为鞣质和黄酮。
3.按照权利要求2所述的植物大发表的药用活性成份，其特征在于所述的鞣质的基本缩合单位为儿茶素，包含(+)-儿茶素、(-)-儿茶素、(+)-表儿茶素、(-)-表儿茶素、(+)-棓儿茶素(2R，3S)和(-)-表棓儿茶素(2R，3R)。
4.按照权利要求2所述的植物大发表的药用活性成份，其特征在于所述的黄酮为异荭草苷、荭草苷和芦丁。
5.按照权利要求1所述的植物大发表的药用活性成份的制备方法由以下步骤组成一、药材大发表粉碎后，用任意比例的乙醇-水溶液55℃以下浸泡提�。崛∫杭跹古ㄋ醯么痔嵛铮欢⑸鲜龃痔嵛镉�0.7-2倍重量的大孔吸附树脂，拌匀上柱，2-5倍柱体积的洁净水洗脱至无色，洗脱液弃之；三、继续用70％-100％乙醇冲洗至流出液变为无色，收集洗脱液，减压干燥，得到药用活性成份。
6.按照权利要求5所述的植物大发表的药用活性成份的制备方法，其特征在于步骤一的提取温度为15-45℃。
7.按照权利要求1所述的植物大发表的药用活性成份的质量标准控制方法，其特征在于用FeCl3法、NaCl-明胶法和HCHO-HCl法定性鉴别鞣质，用Mg-HCl法、Zn-HCl法定性鉴别黄酮。
8.按照权利要求7所述的植物大发表的药用活性成份的质量标准控制方法，其特征在于由以下步骤组成一、取一定量大发表提取物，以甲醇于室温搅拌三次，每次30分钟，过滤，合并甲醇液，回收至干，经石油醚脱脂后为甲醇溶样品，过滤后的沉淀以水于室温搅拌三次，每次30分钟，抽滤，水液部分回收至干为甲醇不溶样品；二、取甲醇溶样品和甲醇不溶样品，以乙醇(70％)配制成10％的溶液，供以下第1和第2项检测备用；三、取甲醇溶样品和甲醇不溶样品样品，以水配制成10％的溶液，供以下第3至第5项检测备用；四、实验结果大发表提取物在以下鉴别反应中的表现
9.按照权利要求1所述的植物大发表的药用活性成份的质量标准控制方法，其特征在于根据鞣质和黄酮具有的收缩膀胱肌和缩张尿道平滑肌的生理活性，定性和半定量鉴别鞣质和黄酮。
10.按照权利要求9所述的植物大发表的药用活性成份的质量标准控制方法，其特征在于根据鞣质具有的收缩膀胱肌的生理活性，鉴别产品中有效成份的活性，由以下步骤组成选取成年雄性大鼠，体重320-400g，脱颈椎处死后立即分离出膀胱制成10×2mm的条片，悬置于盛有25ml Kerb’s营养液的麦氏浴皿中，恒温36±1℃，负荷500mg，稳定30min，给药换液后休息十分钟，以0.1ml0.0625％的乙酰胆碱的收缩幅度为100％，其终浓度相当于2.5μg/ml，分别给予不同浓度的大发表提取物，记录收缩高度。
11.按照权利要求9所述的植物大发表的药用活性成份的质量标准控制方法，其特征在于根据鞣质和黄酮具有的缩张尿道平滑肌的生理活性，鉴别产品中有效成份的活性，由以下步骤组成选用雄性日本大耳兔，棒击后脑处死后立即分离出尿道制成10×2mm条片，悬置于麦氏浴皿中，加入25ml Kerb’s营养液，恒温36±1℃，负荷500mg，稳定30min，加入去甲肾上腺素0.1ml，终浓度相当于10μg/ml，至曲线平稳后，分别不同浓度的大发表提取物，记录20-35分钟，观察药物对抗去甲肾上腺素所致尿道收缩作用，以去甲肾上腺素所致收缩作用为100％，计算各药舒张率。
12.按照权利要求1所述的植物大发表的药用活性成份的质量标准控制方法，其特征在于用络合滴定法定量检测邻酚羟基含量。
13.按照权利要求12所述的植物大发表的药用活性成份的质量标准控制方法，其特征在于以乙二胺四乙酸二钠为络合剂，以铬黑T为指示剂，溶液由红色至蓝色即为终点，通过乙二胺四乙酸二钠的用量可以计算出邻酚羟基含量，由以下步骤组成一、取大发表提取物2.0g，加入50％丙酮的水溶液100ml，频率35KHz超声提取1小时，过滤，滤液55℃以下减压蒸干丙酮，得邻酚羟基成份的水溶液；精密吸取20ml 1M醋酸锌标准液加入500ml容量瓶中，加14ml氨水，摇匀使白色沉淀溶解.将上述制得的鞣质水溶液加蒸馏水稀释到400ml，于水浴上温热至35±2℃，然后定量的移入容量瓶中，并不断振，水浴35±2℃30分钟，间歇振摇数次，冷至室温，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀后干滤纸过滤，收集续滤液；二、邻酚羟基成份含量测定精密吸取滤液20ml于锥形瓶中，加300ml蒸馏水，25ml氨-氯化铵缓冲液，PH＝10，加铬黑T指示剂少许，然后以0.05M乙二胺四乙酸二钠标准液滴定，溶液由红色至蓝色即为终点，以下式计算结果鞣质含量％＝0.1556×V÷W×100％，式中0.1556由实验求得的比例常数，V1M醋酸锌标准液的络合沉淀消耗量＝20×MZn-25×Me×Q，MZn醋酸锌标准液的克分子浓度，Me乙二胺四乙酸二钠标准液的克分子浓度，Q乙二胺四乙酸二钠标准液滴定消耗量，ml，W样品重量，克。
14.按照权利要求1所述的植物大发表的药用活性成份的质量标准控制方法，其特征在于用皮粉法定量检测鞣质的含量，由以下步骤组成一、参照中国药典2000版一部附录XB用皮粉法测大发表提取物中鞣质含量；取过三号筛大发表提取物粉末2g，精密称定，置锥形瓶中，加水150ml，于水浴上加热30分钟，冷却后，移入250ml量瓶中，用水稀释至刻度，滤过，滤液作为供试液；二、溶性部分的测定精密量取供试液25ml，蒸干，残渣于105℃干燥3小时，称重，T1；三、与皮粉结合的水溶性部分的测定精密量取供试液100ml，加皮粉干燥品6g，振摇15分钟，滤过，精密量取滤液25ml，蒸干，残渣于105℃干燥3小时，称重T2；四、皮粉水溶性部分的测定精密量取水100ml，加皮粉干燥品6g，振摇15分钟，滤过，精密量取25ml，蒸干，残渣于105℃干燥3小时称重，T0；五、按下式计算鞣质的百分含量鞣质含量％＝(T1-T2+T0)×10÷W×100％式中W为干燥品取样量。
15.按照权利要求1所述的植物大发表的药用活性成份的质量标准控制方法，其特征在于用比色法定量检测邻酚羟基的含量。
16.按照权利要求15所述的植物大发表的药用活性成份的质量标准控制方法，其特征在于用磷钼酸法测邻酚羟基总含量，由以下步骤组成一、磷钼酸试液取磷钼酸5g，加无水乙醇使溶解成100ml，即得；二、对照液取儿茶素标准品0.02g，置入25ml容量瓶，加入10ml水中轻微振摇并于35℃水浴中恒温15分钟，用微量移液管加入磷钼酸试液0.20ml，35℃水浴中恒温并轻微振摇15分钟，用水补足25ml，继续轻微振摇5分钟；三、取大发表提取物0.1g，精密称定，加入10ml水中搅拌并于35℃水浴中恒温15分钟，滤纸过滤，滤液移入25ml容量瓶。用移液管加入磷钼酸试液1.00ml，35℃水浴中恒温并轻微振摇15分钟，用水补足25ml，继续轻微振摇5分钟；四、以水为空白对照，儿茶素对照液为参比值，760nm为检测波长。
17.按照权利要求1所述的植物大发表的药用活性成份的质量标准控制方法，其特征在于用薄层色谱法定性鉴别大发表提取物中异荭草苷、荭草苷和芦丁的存在。
18.按照权利要求17所述的植物大发表的药用活性成份的质量标准控制方法，其特征在于用聚酰胺膜法定性检测异荭草苷、荭草苷、芦丁的存在，其步骤为一、取大发表提取物0.5g，加水20mL，超声处理30分钟，滤过，滤液用水饱和正丁醇提取3次，合并正丁醇提取液，用10mL水洗涤，分取正丁醇层，蒸干，残渣加甲醇5mL使溶解，作为供试品溶液；二、另取异荭草苷、芦丁对照品，加甲醇制成每1mL各含0.5mg的混合溶液，作为对照品溶液；三、照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各1～2μL，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以异丙醇-水3∶2为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1％三氯化铝乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外灯下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
19.按照权利要求1所述的植物大发表的药用活性成份的质量标准控制方法，其特征在于用高效液相法定量检测(+)-儿茶素、(-)-儿茶素、(+)-表儿茶素、(-)-表儿茶素、(+)-棓儿茶素(2R，3S)和(-)-表棓儿茶素(2R，3R)、异荭草苷、荭草苷、芦丁的存在。
20.按照权利要求19所述的植物大发表的药用活性成份的质量标准控制方法，其特征在于用异荭草苷、荭草苷、芦丁它们中的任意一种或几种的组合的含量测定作为有效部位的指标性成份，由以下步骤组成一、精密称取异荭草苷对照品适量，加70％甲醇制成每1mL含0.05mg异荭草苷的溶液，作为对照品溶液；二、取大发表提取物或其制剂形式0.6g，精密称定，置50mL具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇20mL，密塞，称定重量，超声处理30分钟，称定重量，用70％甲醇补足减失重量，摇匀，放置，取上清液于具塞离心管内，密塞，离心10分钟，取上清液适量通过微孔滤膜作为供试品溶液；三、用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相乙腈-水-磷酸10∶90∶0.1；检测波长350nm；柱温40℃；流量1.0mL/min，理论塔板数按异荭草苷峰计算应不低于3000；一、测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μL，注入高效液相色谱仪，测定，即得。
21.按照权利要求19所述的植物大发表的药用活性成份的质量标准控制方法，其特征在于用(+)-儿茶素、(-)-儿茶素、(+)-表儿茶素、(-)-表儿茶素、(+)-棓儿茶素(2R，3S)和(-)-表棓儿茶素(2R，3R)中的任意一种或几种的组合的含量测定作为有效部位的指标性成份，由以下步骤组成一、准确称取大发表提取物0.1g，用双蒸水溶解于100ml容量瓶中，经微孔滤膜过滤作为待测样品；二、另取(+)-儿茶素、(-)-儿茶素、(+)-表儿茶素、(-)-表儿茶素、(+)-棓儿茶素(2R，3S)和(-)-表棓儿茶素(2R，3R)的对照品，分别用甲醇溶解，配成每毫升含对照品1mg的对照品溶液；三、高效液相色谱条件色谱柱ODS反相色谱柱，填料粒径5μm，流动相双重蒸水/乙睛/乙酸乙酯(86/12/2v∶v∶v)加浓硫酸调PH值于3.0-4.0，柱温40℃，流速1ml/min。
全文摘要
本发明涉及一种植物大发表的有效组份、制备方法，以及该有效组分的质量标准控制方法。本发明所述的植物大发表的药用活性成份为含邻酚羟基成份，主要为鞣质和黄酮。制备方法由以下步骤组成一、药材大发表粉碎后，用任意比例的乙醇－水溶液55℃以下浸泡提�。崛∫杭跹古ㄋ醯么痔嵛铮欢�、上述粗提物与0.7－2倍重量的大孔吸附树脂，拌匀上柱，2－5倍柱体积的洁净水洗脱至无色，洗脱液弃之；三、继续用70％－100％乙醇冲洗至流出液变为无色，收集洗脱液，减压干燥，得到药用活性成份。本发明明确了大发表中的有效组份，制备工艺中最大限度地保存鞣质的活性，极大减少了服药量。
文档编号G01N30/90GK1857371SQ200510010788
公开日2006年11月8日 申请日期2005年4月30日 优先权日2005年4月30日
发明者唐书明, 冯有, 龙飞, 杨晓源, 杨存金, 王亚琳 申请人:云南白药集团股份有限公司
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