专利名称：一种增加间隔臂的2，4－滴合成抗原的制备方法
技术领域：
本发明属于小分子环境污染物免疫检测领域，特别涉及水体和饮用水中除草剂2，4-滴免疫检测的合成抗原的制备方法。
背景技术：
水体中含有大量有害小分子环境污染物是饮用水�：θ死嘟】档闹饕蛑�。大量使用各种合成农药(包括2，4-滴)，导致地表水中小分子有机污染物不断增加，使水体丧失饮用功能。现有2，4-滴检测技术主要利用固-液萃取(Liquid-Solid Extraction)和气相色谱-质谱技术(GC-MS)。2，4-滴传统检测方法的样品制备(萃取、还原、衍生化和纯化)过程繁复、耗时长，检测结果的一致性较差，这样就限制了常规检测的次数和精度。而免疫检测技术因具有特异性强、灵敏性高、检测迅速、样品通量大等优势近年来在环境污染物检测领域引起了广泛的关注，并对此展开了广泛的研究和一定的应用。目前已有的技术采用各种交联剂，使2，4-滴分子的羧基和载体蛋白分子的氨基直接缩合，分子间通过酰胺键而连接，但是合成抗原上的部分2，4-滴分子被蛋白表面的一些长链基团所掩蔽，免疫动物所产生的2，4-滴特异性抗体的含量较低、并且特异性和亲和力相对较弱。
发明内容
本发明的目的是为克服已有技术的不足之处，提出一种增加间隔臂的2，4-滴合成抗原的制备方法，本方法在载体蛋白和2，4-滴分子增加了一个间隔臂，可合成一种免疫性能好的半抗原，使2，4-滴分子充分暴露在载体蛋白分子表面，以便获得特异性强、亲和力好的2，4-滴抗体。这种增加了间隔臂分子的2，4-滴免疫原，可以刺激动物的免疫系统地产生2，4-滴的特异性抗体含量更高的多克隆抗体。所产生的多克隆抗体能应用于水体或者饮用水中的2，4-滴的常规检测。
本发明提出一种增加间隔臂的2，4-滴合成抗原的制备方法，先合成2，4-滴和具有C3链或者C6链的分子(如L-赖氨酸)的缩合物，然后再和载体蛋白交联；包括以下步骤1)按质量比(0.5～1.2)∶1将叔丁氧羰基-赖氨酸与2，4-滴混合溶于缓冲溶液PBS中，调节pH为5.5～6.5；2)缓慢加入与2，4-滴质量比为(0.5～1)的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺，于室温20℃～30℃条件下反应1～3小时；3)制备HCl/乙酸乙酯溶液在吸滤瓶中放入固体NH4Cl，缓慢加入98％浓H2SO4，产生的HCl气体经硫酸洗瓶和CaCl2干燥塔干燥后通入冰冷却的乙酸乙酯中，将获得的溶液密封保存于0℃～4℃冰箱中；
4)将2，4-滴与叔丁氧羰基-赖氨酸的缩合产物在50℃～70℃下用旋转蒸发器干燥，产物溶于乙酸乙酯中，于0℃下与第3)步制备的HCl/乙酸乙酯溶液混合，脱除赖氨酸的氨基保护叔丁氧羰基，0℃～4℃反应2～3小时后收集沉淀，并用预冷的乙酸乙酯反复洗涤；5)采用强酸性阳离子交换树脂去除自身环化的赖氨酸单体，获得纯化的2，4-滴和赖氨酸ε-氨基的交联物；6)按照载体蛋白2，4-滴为(0.35～0.7)∶1将载体蛋白(牛血清白蛋白、兔血清白蛋白、鸡卵清蛋白或血蓝蛋白)和纯化后的缩合物混合溶解在PBS溶液中，调节pH为5.5～6.5；7)再次缓慢加入与2，4-滴质量比为0.5～1的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺，并且轻轻搅拌均匀。4℃条件下静置12小时以上。反应产物溶液经0.1M的NaHCO3水溶液透析，然后再用pH7.2的PBS透析，将获得的产物溶液分装冻存。
本发明提出另一种增加间隔臂的2，4-滴合成抗原的制备方法，在载体蛋白表面连接具有C3链或者C6链的分子(如β-丙氨酸、ε-氨基己酸或者L-赖氨酸)，然后将2，4-滴的羧基与充当间隔臂分子的氨基缩合。包括以下步骤1)封闭载体蛋白的羧基将Tris和载体蛋白(牛血清白蛋白、兔血清白蛋白、鸡卵清蛋白或血蓝蛋白)溶于PBS中，调节pH为5.5～6.5，加入与载体蛋白质量比为0.5～1.5的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺，并缓慢搅拌均匀，于室温20℃～30℃条件下反应1～3小时；2)将ε-氨基己酸或者β-丙氨酸的羧基和载体蛋白的氨基交联将1)的溶液加入与载体蛋白质量比为0.8～1.0的ε-氨基己酸(或者β-丙氨酸)，接着加入与1)步中等量的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺，并缓慢搅拌均匀，4℃条件下静置12小时以上，反应产物溶液经pH 7.2的PBS透析；3)按照载体蛋白2，4-滴为(0.35～0.7)∶1在透析后的载体蛋白中加入2，4-滴，调节pH为5.5～6.5；4)缓慢加入与1)步中等量的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺，并缓慢搅拌均匀，4℃条件下静置12小时以上，反应产物溶液经0.1M的NaHCO3水溶液透析，然后再用pH7.2的PBS透析，将获得的产物溶液分装冻存。
如上所说的添加间隔臂技术是利用β-丙氨酸、ε-氨基己酸、L-赖氨酸的碳链长度将2，4-滴分子在载体蛋白表面充分暴露，更好地刺激免疫动物产生特异性抗体的技术。
本发明的特点及技术效果本发明将载体蛋白和2，4-滴分子之间通过一个具有C3链或者C6链的分子连接在一起，也就是在载体蛋白和2，4-滴分子增加了一个间隔臂，使2，4-滴分子充分暴露在载体蛋白分子表面，这种方法可以刺激动物的免疫系统最大限度地产生2，4-滴的特异性抗体。
本发明通过大量实验研究，从多种2，4-滴合成免疫原免疫动物所产生的抗血清对水中2，4-滴的检测中比较，并以此为基础开发出了能够产生特异性强、亲和力好的抗体的增加间隔臂技术。
本发明首先明确了2，4-滴合成抗原能够刺激实验动物免疫系统产生特异性抗体的基础上，为了提高抗体的特异性而设计并合成的带有间隔臂的2，4-滴的合成抗原。符合免疫学基本原理，可以产生特异性更强的2，4-滴抗体，减少其对2，4-滴的相似物(2，4，5-涕、2，4-二氯苯氧丁酸)的交叉反应。
具体实施例方式
实施例1为采用合成2，4-滴和具有C3链或者C6链的分子(如L-赖氨酸)的缩合物，然后再和载体蛋白交联的增加间隔臂的方法。具体实施步骤如下246.3mg叔丁氧羰基-赖氨酸、221mg 2，4-滴溶于10ml PBS中，调节pH为6.0，缓慢加入200mg1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺，于25℃条件下反应2小时。
制备HCl/乙酸乙酯溶液在2L吸滤瓶中放入200g固体NH4Cl，缓慢加入98％的浓H2SO4，产生的HCl气体经硫酸洗瓶和CaCl2干燥塔干燥后通入冰冷却的500ml乙酸乙酯中，将获得的溶液密封保存于4℃冰箱中。
将2，4-D与叔丁氧羰基-赖氨酸的偶联产物在60℃下用旋转蒸发器干燥，产物溶于10ml乙酸乙酯，于0℃下同之前制备的10ml HCl/乙酸乙酯溶液混合，脱除赖氨酸的氨基保护叔丁氧羰基，4℃反应2.5h后收集沉淀，并用30ml预冷的乙酸乙酯反复洗涤。
采用三菱化学的pK208大孔强酸性阳离子交换树脂去除自身环化的赖氨酸单体，获得纯化的2，4-滴和赖氨酸ε氨基的交联物。将纯化后的缩合物和150mg载体蛋白(牛血清白蛋白、兔血清白蛋白、鸡卵清蛋白或血蓝蛋白)溶解在10ml PBS溶液中，调节pH为6.0。缓慢加入200mg 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺，并且轻轻搅拌。4℃条件下静置18小时。反应产物溶液经0.1M的NaHCO3水溶液透析1天(期间4次更换透析液2L)，然后再用pH7.2的PBS透析1天(期间4次更换透析液2L)。将获得的产物溶液分装冻存。
实施例2为采用在载体蛋白表面连接具有C3链或者C6链的分子(如β-丙氨酸、ε-氨基己酸或者L-赖氨酸)，然后将2，4-滴的羧基与充当间隔臂分子的氨基残基交联增加间隔臂的方法。具体实施步骤如下121mg Tris和150mg载体蛋白(牛血清白蛋白、兔血清白蛋白、鸡卵清蛋白或血蓝蛋白)溶于10ml PBS中，调节pH为6.0，缓慢加入100mg-200mg 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺，并搅拌均匀。于25℃条件下反应2小时。封闭载体蛋白的羧基。
上述反应溶液中加入132mgε-氨基己酸(或者90mgβ-丙氨酸)，100mg-200mg 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺。将ε-氨基己酸或者β-丙氨酸的羧基和载体蛋白的氨基交联。反应产物溶液经pH7.2的PBS透析1天(期间4次更换透析液2L)。
透析后的反应溶液中加入221mg 2，4-滴，调节pH为6.0。缓慢加入200mg 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺，并且轻轻搅拌均匀。4℃条件下静置18小时。反应产物溶液经0.1M的NaHCO3水溶液透析1天(期间4次更换透析液2L)，然后再用pH7.2的PBS透析1天(期间4次更换透析液2L)。将获得的产物溶液分装冻存。
权利要求
1.一种增加间隔臂的2，4-滴合成抗原的制备方法，其特征在于，先合成2，4-滴和具有C3链或者C6链的分子的缩合物，然后再和载体蛋白交联；包括以下步骤1)按质量比(0.5～1.2)∶1将叔丁氧羰基-赖氨酸与2，4-滴混合溶于缓冲溶液PBS中，调节pH为5.5～6.5；2)缓慢加入与2，4-滴质量比为(0.5～1)的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺，于室温20℃～30℃条件下反应1～3小时；3)制备HCl/乙酸乙酯溶液在吸滤瓶中放入固体NH4Cl，缓慢加入98％浓H2SO4，产生的HCl气体经硫酸洗瓶和CaCl2干燥塔干燥后通入冰冷却的乙酸乙酯中，将获得的溶液密封保存于4℃冰箱中；4)将2，4-滴与叔丁氧羰基-赖氨酸的缩合产物在50℃～70℃下用旋转蒸发器干燥，产物溶于乙酸乙酯中，于0℃下与第3)步制备的HCl/乙酸乙酯溶液混合，脱除赖氨酸的氨基保护叔丁氧羰基，0℃～4℃反应2～3小时后收集沉淀，并用预冷的乙酸乙酯反复洗涤；5)采用强酸性阳离子交换树脂去除自身环化的赖氨酸单体，获得纯化的2，4-滴和赖氨酸ε-氨基的交联物；6)按照载体蛋白2，4-滴为(0.35～0.7)∶1将载体蛋白和纯化后的缩合物混合溶解在PBS溶液中，调节pH为5.5～6.5；7)再次缓慢加入与2，4-滴质量比为0.5～1的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺，并且轻轻搅拌均匀后于0℃～4℃静置12小时以上，反应产物溶液经0.1M的NaHCO3水溶液透析，然后再用pH7.2的PBS透析，将获得的产物溶液分装冻存。
2.一种增加间隔臂的2，4-滴合成抗原的制备方法，其特征在于，在载体蛋白表面连接具有C3链或者C6链的分子(如β-丙氨酸、ε-氨基己酸或者L-赖氨酸)，然后将2，4-滴的羧基与充当间隔臂分子的氨基缩合；包括以下步骤1)封闭载体蛋白的羧基将Tris和载体蛋白溶于PBS中，调节pH为5.5～6.5，加入与载体蛋白质量比为0.5～1.5的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺，并缓慢搅拌均匀，于室温20℃～30℃条件下反应1～3小时；2)将ε-氨基己酸或者β-丙氨酸的羧基和载体蛋白的氨基交联将1)的溶液加入与载体蛋白质量比为0.8～1.0的ε-氨基己酸(或者β-丙氨酸)，接着加入与1)步中等量的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺，并缓慢搅拌均匀，4℃条件下静置12小时以上，反应产物溶液经pH7.2的PBS透析；3)按照载体蛋白2，4-滴为(0.35～0.7)∶1在透析后的载体蛋白中加入2，4-滴，调节pH为5.5～6.5；4)缓慢加入与1)步中等量的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺，并缓慢搅拌均匀，4℃条件下静置12小时以上，反应产物溶液经0.1M的NaHCO3水溶液透析，然后再用pH7.2的PBS透析，将获得的产物溶液分装冻存。
全文摘要
本发明涉及一种增加间隔臂的2，4－滴合成抗原的制备方法，属于小分子环境污染物免疫检测领域，包括两种方法其一，先合成2，4－滴和具有C3链或者C6链的分子(如L－赖氨酸)的缩合物，然后再和载体蛋白交联；其二，在载体蛋白表面连接具有C3链或者C6链的分子(如β－丙氨酸、ε－氨基己酸或者L－赖氨酸)，然后将2，4－滴的羧基与充当间隔臂分子的氨基缩合。本发明能使2，4－滴分子充分暴露在载体蛋白分子表面，以便获得特异性强、亲和力好的2，4－滴抗体。这种方法可以刺激动物的免疫系统地产生2，4－滴的特异性抗体含量更高的多克隆抗体。所产生的多克隆抗体能应用于水体或者饮用水中的2，4－滴的常规检测。
文档编号G01N33/531GK1634975SQ20041009607
公开日2005年7月6日 申请日期2004年11月29日 优先权日2004年11月29日
发明者刘举, 施汉昌, 何苗, 余若祯 申请人:清华大学
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