专利名称：检测猪繁殖与呼吸综合征抗体的elisa试剂盒及用法的制作方法
技术领域：
本发明检测猪繁殖与呼吸综合征抗体的ELISA试剂盒及用法，属于生物技术领域。用于猪繁殖与呼吸综合征的抗体检测，以此对抗体水平及疫情的分布与流行情况进行监测。
二
背景技术：
猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome；PRRS)是二十世纪八十年代出现的严重�：ρ硪档囊恢执静�。该病的主要特征是引起妊娠母猪的早产、流产、死胎、木乃伊胎及产弱仔猪，仔猪主要表现为咳嗽、呼吸困难、呼吸急促。1987年美国首先报道了该病的发生，随后加拿大、德国、荷兰等国家及地区也相继爆发了该病。现在，本病在世界各养猪国家、地区都有发生，已越来越多地引起人们的关注。我国是世界养猪大国，本病在我国发生、流行的现状不容乐观。本病的病原体是猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcinereproductive and respiratory syndrome virus；PRRSV)，属于套式病毒目动脉炎病毒科动脉炎病毒属成员。根据病毒基因组核苷酸序列的差异，将其分为两个基因型北美洲型与欧洲型。PRRSV共包括8个开放阅读框。
猪繁殖与呼吸综合征自出现至今，关于本病诊断方法与的研究成果不断涌现。应用最为广泛的是以全病毒作为包被抗原建立的ELISA方法，即美国IDEXX公司ELISA试剂盒。由于病毒需由细胞培养物中大量增殖，而真正意义上的纯化病毒很难获得，该试剂盒的检测费用过高使其推广和应用受到限制。
编码核衣壳蛋白的N基因在两个基因型中相当保守，当猪受到PRRSV侵袭后，机体最先产生的抗体便是针对病毒核衣壳蛋白的。现有技术中本发明课题组已经以N基因为目标片段进行扩增，构建了重组质粒pETN，将其在大肠杆菌BL21(DE3)中进行高效表达(相关内容已发表于中国病毒学2003年第18卷第三期279-282页)。但是还没有利用表达产物建立检测猪繁殖与呼吸综合征抗体的ELISA试剂盒及其检测方法的技术。
三
发明内容
技术问题本发明的目的在于提供一种检测猪繁殖与呼吸综合征抗体的ELISA试剂盒及用法，用于猪繁殖与呼吸综合征的抗体检测，测试剂盒具有高度的特异性、敏感性，可大量生产，大大降低了检测成本，检测成本低廉，适于推广。在本病的抗体水平检测、流行病学调查、类症鉴别及采取有效防制措施方面提供重要方法。
技术方案1检测猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)抗体的ELISA试剂盒，包括以下组分(1)ELISA板条以猪繁殖与呼吸综合征病毒N基因的重组N蛋白作为包被抗原，每一试剂盒装有4块经1％(M/V)BSA(牛血清白蛋白)封闭的板条，以包装袋密封包装于4℃保存；(2)洗涤液一倍浓度的pH7.4PBS(磷酸盐缓冲液)溶液；(3)血清稀释液1％(M/V)BSA(牛血清白蛋白)100毫升；(4)显色底物已加入H2O2(按每10毫升TMB中加入15μL30％浓度H2O2)的TMB(四甲基联苯胺)溶液100毫升；(5)兔抗猪酶标二抗已用血清稀释液1％(M/V)BSA稀释至工作浓度(1∶400)的兔抗猪酶标二抗(购自中国军事医学科学院)100毫升；(6)终止液HF溶液100毫升；(7)已知PRRS阳性血清5毫升；(8)已知PRRS阴性学清5毫升。
2上述ELISA试剂盒用于检测猪繁殖与呼吸综合征抗体的方法，主要操作步骤如下(1)加入血清样品用血清稀释液1％(M/V)BSA将被检血清作1∶40倍稀释后，按酶标板样品添加模式于每孔中加入100μL，共加两孔，于室温下作用45min后弃去反应孔中的液体；将每个孔用约200μL的洗涤液充分清洗3-5次，每次持续3min，在每次洗涤后将反应孔中的液体除去，最后一次除去洗涤液后，除去残留的液体；(2)加入兔抗猪酶标二抗每孔加入100μL兔抗猪酶标二抗，室温作用40min，洗涤3-5次；(3)加入显色底物每孔中加入100μL已加入H2O2的TMB溶液，室温下作用15min；(4)终止反应；向每孔中加入100μLHF溶液终止液终止反应；(5)用酶标仪测定OD值在630nm波长下测定各孔吸光度OD值，随后判定结果；(6)结果判定检测样品OD630/已知PRRS阴性血清OD630＞2.1且已知PRRS阳性血清OD630＞0.25，即可判为阳性。
四有益效果1特异性高本发明应用重组N蛋白作为包被抗原，在材料选择上具有新意。猪在受到PRRSV感染后，最先产生的抗体是针对病毒的核衣壳蛋白，且此抗体可在猪体内持续存在6个月以上。通过Western-blot试验，证实重组核衣壳蛋白(重组N蛋白)具有良好的反应原性，保证了检测试剂盒的高度特异性。
2检测试剂盒可大量生产目前，在检测猪繁殖与呼吸综合征抗体方面，应用较为广泛的是以全病毒作为包被抗原建立的ELISA方法，即美国IDEXX公司ELISA试剂盒。由于病毒需由细胞培养物中大量增殖，而真正意义上的纯化病毒很难获得。本发明使用的包被抗原为猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)N基因的原核表达产物，其优点在于重组N蛋白易于稳定、大量获得(用光密度扫描法测得重组N蛋白的含量占总表达产物的46％)，纯化方法易于实现(应用His-bind亲和层析柱纯化)，重组N蛋白的包被浓度易于确定和控制，为检测试剂盒的大量生产提供有力保证。
3检测成本低廉，适于推广本发明与现有方法相比，在保证特异性、敏感性的前提下，与IDEXX公司ELISA试剂盒的检测符合率为91％。现有方法检测每份血清样品的费用在50元左右，高昂的检测费用使许多生产单位难以接受。本发明的检测费用在30-35元左右，大大降低了检测成本，有着良好的应用前景。
五
具体实施例方式
本发明所使用的包被抗原—猪繁殖与呼吸综合征病毒N基因的重组N蛋白，按中国病毒学2003年第18卷3期发表论文“猪繁殖与呼吸综合征病毒N基因的克隆及高效表达”(第279-282页)述及的方法制备。
本发明所建立的以重组N蛋白为包被抗原的间接ELISA方法通过以下步骤实现1检测猪繁殖与呼吸综合征抗体的ELISA反应条件的确定1.1方阵试验采用棋盘法测定。取96孔ELISA板，将提纯的N蛋白用pH9.6的CBS自左向右依次做1∶20、1∶40至1∶1280稀释，每孔100μL，后于4℃过夜。次日取出后洗涤三次，每次持续3分钟。后用1％BSA于室温下封闭3h后洗涤同前。将阴、阳性血清也按同样的稀释倍数稀释，自上而下分别加入以上的反应孔中，每孔100μL，于37℃放置1h，取出后洗涤同前。接着每孔中加入100μL稀释至工作浓度(1∶400)的兔抗猪酶标二抗(购自中国军事医学科学院)，于37℃作用15min，随后洗涤同前。继而向每孔中加入100μL OPD(邻苯二胺，按每10毫升OPD溶液加入30％H2O28μL配制)，于37℃作用15min，最后加入50μL 2MH2SO4终止反应。在酶标仪上检测OD值。取阳性血清OD值1.0、阴性血清OD值0.2(OPD为底物)所在孔的抗原浓度和血清稀释液作为最佳抗原工作浓度和血清稀释度。确定以重组N蛋白为包被抗原的最佳工作(包被)浓度为36.5ug/ml，而待检血清样品最佳稀释倍数为1∶40。
1.2抗原最佳包被时间的测定将按最佳抗原浓度包被好的ELISA反应板分别在37℃及室温放置1h、2h、3h后置于4℃过夜。于次日取出包被好的反应板，用已知的阴、阳性血清按前面述及的相关步骤操作，其它条件相同。每份血清重复五孔，观察OD值变化及P/N变化情况。结果显示不论是在37℃还是在室温放置一段时间再移入4℃完成包被，对ELISA结果都不会有明显影响。提示最终移入4℃过夜包被是保证良好包被效果的一个必需环节。
1.3封闭液的选择分别用2％脱脂乳、1％BSA、1.5％明胶和5％犊牛血清(FCS)作为封闭液，于室温封闭2h，在其它条件及操作方法相同的情况下，对已知的阴、阳性血清进行ELISA检测，每种封闭液稀释的血清重复五孔，通过OD值评价其封闭效果。通过试验确定1％BSA作为封闭液。
1.4封闭条件的确定在其它条件相同的情况下，用选定的封闭液分别在37℃及室温封闭1h、2h、3h、4h，后应用已知的阴、阳性血清进行检测，对封闭时间及温度进行确定。结果表明不论在室温还是4℃，封闭3h就可以达到良好的效果。
1.5血清稀释液的选择分别以PBST、1％BSA、3％犊牛血清、6％犊牛血清作为稀释液稀释已知的阴、阳性血清，每一浓度稀释液重复五孔，在其它条件相同的情况下，进行ELISA测定，计算各组P/N值，以该值最大且阴性血清OD值较低来选择血清稀释液。确定的血清稀释液为1％BSA。
1.6血清作用时间的确定用选定的血清稀释液将已知的阴、阳性血清做1∶40稀释至最佳稀释倍数后，分别于室温及37℃下作用15min、30min、45min、60min，在其它条件及操作方法相同的情况下，进行ELISA检测，取P/N最大且阴性血清本底较低的一组确定为最佳作用时间。最终确定血清作用时间为室温及37℃下45min。
1.7酶标二抗作用时间的选择将兔抗猪酶标二抗(购自中国军事医学科学院)用选定的血清稀释液即1％BSA稀释后于37℃及室温下分别作用10min、15min、20min、25min、30min，用已知的阴、阳性血清进行ELISA检测，观察OD值及P/N变化。确定兔抗猪酶标二抗作用时间为37℃20min或室温下30min。
1.8底物及终止液的选择在其他条件相同的情况下，于室温下及37℃下分别用TMB(OD630)、OPD(OD490)作为底物，检测已知的阴、阳性血清，分别加入2MH2SO4、2NHCL、0.12％HF作为终止液，于终止后30min内每隔10min在酶标仪上读值，计算其P/N比值，选择合适的底物。确定TMB为显色底物，终止液为HF。
1.9底物作用时间的选择采用已知的阴、阳性血清，应用选定的底物，分别于室温及37℃作用10min、15min、20min、25min、30min后用确定的终止液终止反应，于终止后30min内在酶标仪上读值，以确定底物作用的时间及作用温度。最后确定底物TMB的作用时间为37℃ 15min或室温20min。
1.10判定标准的确定以200份经IDEXX公司ELISA检测试剂盒检测的血清，按照优化的条件进行ELISA检测，检测结果在计算机上用Microsoft Excel软件进行分析，确定cut-off值，以此作为依据确定判定标准。在630nm波长下测定各孔吸光度(OD值)，随后判定结果S(OD630)/N(OD630)＞2.1且已知阳性血清OD630＞0.25，即可判为阳性。
(注S为检测样品；N为已知阴性血清)1.11重组N蛋白——ELISA操作程序的确定按以上各项所确定的优化条件进行操作，即得到本方法的最佳操作程序取出已包被并封闭好的ELISA板条，用样品稀释液将被检血清作1∶40稀释，加入样品孔中，室温作用45min，弃去反应孔中的液体；将每个孔用约200μL的洗涤液充分清洗3-5次，在每次洗涤后将反应孔中的液体除去；最后一次除去洗涤液后，在吸水纸上拍打，除去残留的液体；每孔加入100μL兔抗猪酶标二抗，室温作用40min，洗涤3-5次。每孔中加入100μLTMB底物溶液，室温避光作用15min；向每孔中加入100μL的终止液，终止反应。用酶标仪在630nm波长下测定各孔吸光度A值，读值计算并判定结果。
实施例一、检测猪繁殖与呼吸综合征抗体的ELISA试剂盒，包括以下组分(1)ELISA板条以中国病毒学2003年第18卷3期发表论文“猪繁殖与呼吸综合征病毒N基因的克隆及高效表达”(第279-282页)中的方法获得的重组N蛋白作为包被抗原，每一试剂盒装有4块经1％(M/V)BSA(牛血清白蛋白)封闭的板条，以包装袋密封包装于4℃保存；(2)洗涤液一倍浓度的pH7.4PBS(磷酸盐缓冲液)溶液；(3)血清稀释液1％(M/V)BSA(牛血清白蛋白)100毫升；(4)显色底物已加入H2O2(按每10毫升TMB中加入15μL30％浓度H2O2)的TMB(四甲基联苯胺)溶液100毫升；(5)兔抗猪酶标二抗已稀释至工作浓度(1∶400)的兔抗猪酶标二抗(购自中国军事医学科学院)100毫升；(6)终止液HF溶液100毫升；(7)已知PRRS阳性血清5毫升；(8)已知PRRS阴性学清5毫升。
二、ELISA试剂盒用于检测猪繁殖与呼吸综合征抗体，主要操作方法如下(1)加入血清样品用血清稀释液1％(M/V)BSA将被检血清作1∶40倍稀释后，按酶标板样品添加模式于每孔中加入100L，共加两孔，于室温下作用45min后弃去反应孔中的液体；将每个孔用约200L的洗涤液充分清洗3-5次，每次持续3min，在每次洗涤后将反应孔中的液体除去，最后一次除去洗涤液后，除去残留的液体；(2)加入兔抗猪酶标二抗每孔加入100μL兔抗猪酶标二抗，室温作用40min，洗涤3-5次；(3)加入显色底物每孔中加入100μL已加入H2O2的TMB溶液，室温下作用15min；(4)终止反应向每孔中加入100μL HF溶液终止液终止反应；(5)用酶标仪测定OD值在630nm波长下测定各孔吸光度OD值，随后判定结果；(6)结果判定检测样品OD630/已知PRRS阴性血清OD630＞2.1且已知PRRS阳性血清OD630＞0.25，即可判为阳性。
表1 酶标板样品添加模式12 3 4 5678 9 10 1112
ABCDEFGH注P已知PRRS阳性血清； N已知PRRS阴性血清S1，S2，S3，S4，S5，S6......S..表示加各被检样品1、特异性试验1.1交叉试验 在同一条件下用本实验室保存的PRRS阴、阳性血清及猪细小病毒病阳性血清、猪圆环病毒病阳性血清、猪乙型脑炎阳性血清、猪瘟阳性血清、猪布鲁氏菌病阳性血清进行ELISA检测，每份血清重复检测4孔。通过OD值来判定阴阳性结果，以此来判定是否存在交叉反应。检测结果显示PRRS阳性血清发生阳性结果，而其它均为阴性结果。
1.2与PRRSV单克隆抗体的反应使用农业部动物检疫所提供的针对PRRSV的三株单抗，分别标记为McAb1、McAb2、McAb3，同时设立已知的阴阳性血清作为对照，每份样品重复检测4孔，按照ELISA方法进行检测，通过OD判定阴阳性结果。三株单抗均为阳性结果。
2、敏感性试验 取200份血清分别用本组建立的重组N蛋白-ELISA方法与IDEXX公司ELISA检测试剂盒进行检测，根据结果统计二者的符合率。两种方法的检出符合率为91％。
3、重复性试验3.1批内重复 用同一批制备的重组N蛋白包被板条，取已知的阴阳性血清各一份，另外取三份待检血清，在其它条件不变的情况下，应用本方法进行检测，每份样品重复四孔，根据OD值判定批内重复性。
3.2批间重复 取不同时间制备并纯化的重组N蛋白(处理方法同前所述)，用pH9.6的CBS稀释至最佳包被浓度，经包被、封闭(同前所述)后对已知的阴阳性血清及另外三份待检血清进行检测，每份血清检测4孔，重复检测五次。根据OD值判定不同时间制备的抗原建立的ELISA的可重复性。试验结果显示本发明具有良好的重复性。
4、包被抗原保存期的确定 纯化蛋白以最佳工作浓度包被并经封闭后，用包装袋封好，置于4℃保存，以后每隔1月取出用已知阴阳性血清按所建立的方法进行检测。共检测6次。结果显示包被的重组N蛋白保存六个月仍可用于检测。
5、重组N蛋白——ELISA田间试验的应用 从江苏、上海、山东、浙江、湖北、安徽等省市采集和收集血清样品860份，采用本发明方法检测PRRS抗体，结合样品背景进行结果分析，并对其中的400份血清分别应用本发明方法及IDEXX公司试剂盒进行检测，结果显示二者的检出符合率为91％。检测结果分别见表2、表3。
表2重组N蛋白-ELISA的检测应用
表3重组N蛋白-ELISA、IDEXX公司ELISA试剂盒检测结果
权利要求
1.检测猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)抗体的ELISA试剂盒，包括以下组分(1)ELISA板条以猪繁殖与呼吸综合征病毒N基因的重组N蛋白作为包被抗原，每一试剂盒装有4块经1％(M/V)BSA(牛血清白蛋白)封闭的板条，以包装袋密封包装于4℃保存；(2)洗涤液一倍浓度的pH7.4PBS(磷酸盐缓冲液)溶液；(3)血清稀释液1％(M/V)BSA(牛血清白蛋白)100毫升；(4)显色底物已加入H2O2的TMB(四甲基联苯胺)溶液100毫升，其中每10毫升溶液TMB中含有30％(M/V)浓度H2O215μL；(5)兔抗猪酶标二抗已用血清稀释液1％(M/V)BSA稀释至工作浓度1∶400的兔抗猪酶标二抗100毫升；(6)终止液HF溶液100毫升；(7)已知PRRS阳性血清5毫升；(8)已知PRRS阴性学清5毫升。
2.权利要求1所述ELISA试剂盒用于检测猪繁殖与呼吸综合征抗体的方法，主要操作步骤如下(1)加入血清样品用血清稀释液1％(M/V)BSA将被检血清作1∶40倍稀释后，按酶标板样品添加模式于每孔中加入100μL，每一血清样品添加两孔，同时设立PRRS阴、阳性血清作为对照，各添加两孔；随后于室温下作用45min，弃去反应孔中的液体；将每个孔用约200μL的洗涤液充分清洗3-5次，每次持续3min，在每次洗涤后将反应孔中的液体除去，最后一次除去洗涤液后，除去残留的液体；(2)加入兔抗猪酶标二抗每孔加入100μL兔抗猪酶标二抗，室温作用40min，洗涤3-5次；(3)加入显色底物每孔中加入100μL已加入H2O2的TMB溶液，室温下作用15min；(4)终止反应；向每孔中加入100μL HF溶液终止液终止反应；(5)用酶标仪测定OD值在630nm波长下测定各孔吸光度OD值，随后判定结果；(6)结果判定检测样品OD630/已知PRRS阴性血清OD630＞2.1且已知阳性血清OD630＞0.25，即可判为阳性。
全文摘要
本发明检测猪繁殖与呼吸综合征抗体的ELISA试剂盒及其方法，属于生物技术领域。试剂盒包括以重组N蛋白作为包被抗原的ELISA板条、PBS溶液、血清稀释液、兔抗猪酶标二抗、显色底物、终止液、PRRS阳性血清、PRRS阴性血清等。该方法经特异性、敏感性、重复性等指标的检验后，将其用于血清样品的检测。本发明的优势体现在有良好的特异性、可大量生产以及检测成本低廉。与IDEXX公司ELISA试剂盒的检测符合率为91％。大大降低了检测成本，有着良好的应用前景。
文档编号G01N33/535GK1525170SQ0315821
公开日2004年9月1日 申请日期2003年9月15日 优先权日2003年9月15日
发明者陈溥言, 许立华, 曹瑞兵 申请人:南京农业大学
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