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专利名称：一种利用紫外分光光度法测定植物中抗坏血酸含量的方法
技术领域：
本发明属于植物生理生化分析领域，具体涉及ー种利用紫外分光光度法測定植物中抗坏血酸含量的方法。
背景技术：
抗坏血酸，又称维生素C，是动植物体内维持生命所必需的ー种物质。抗坏血酸作为细胞内重要的还原物质，它具有維持细胞氧化还原电位，清除活性氧，維持维生素E的还原状态等重要作用。高等动植物体内存在的谷胱甘肽——抗坏血酸氧化还原系统是细胞内的多条电子传递链之一，參与细胞内能量代谢，防止含巯基蛋白质的氧化，延缓细胞衰老的进程。对抗坏血酸的各方面研究方兴未艾，測定各种生物组织中抗坏血酸含量是研究抗坏血酸的合成，代谢及生理作用的必要手段之一。抗坏血酸(维生素C)分为脱氢抗坏血酸和还原型抗坏血酸，相对应的，不同的方法可以测定脱氢型抗坏血酸和总抗坏血酸的含量。目前国家标准中规定的蔬菜水果总抗坏血酸的測定方法为荧光法和2，4- ニ硝基苯肼法(GB/ T5009. 86-2003)。国家标准中规定的还原型抗坏血酸的测定方法为2，6-ニ氯靛酚滴定-こ 醚萃取法(GB/T 12143. 3-89)和固蓝盐B显色法(GB/T 5009. 159-2003)。几种方法适合于食品质量检测固蓝盐B显色法。适用于实验分析的小样品抗坏血酸含量測定方法仅有红菲罗啉显色法和高效液相色谱法。而目前的红菲罗啉显色法精确度不高，而高效液相色谱法操作条件不易控制且较繁琐。而且，上述国标方法采用间接法測定，会受到样品中其他物质的干扰，比如2，6_ ニ氯靛酚滴定法受样品中其它还原物质干扰，固蓝盐B显色法受蛋白质的影响。发明人考虑采用紫外分光光度法直接測定抗坏血酸含量是最快捷最廉价的方法， 但是准确度同样容易受到样品中其他物质的干扰。

发明内容
本发明的目的在于提供一种采用适当的方法矫正检测背景，使该检测准确度得到充分保证的利用紫外分光光度法測定植物中抗坏血酸含量的方法。本发明的目的是通过以下方式实现的ー种利用紫外分光光度法測定植物中抗坏血酸含量的方法，包括标准样品溶液的制备、标准曲线线性回归方程的获得、待测样品的制备、紫外检测及浓度计算，所述的待测样品的制备、紫外检测及浓度计算包括如下步骤a.待测样品的制备将每2.5 3. 5g偏磷酸和7.5 8. 5mLこ酸用水定容至 IOOml得到偏磷酸-こ酸水溶液，将该溶液与待测物匀浆，离心，取上清液即为待测物提取液；取体积相等的两份待测物提取液(分别作为测定组和校正组，两份待测物提取液还可以根据样品中抗坏血酸含量均用偏磷酸-こ酸溶液稀释至待测物提取液体积的2 5倍)， 用碱处理法破坏第一份待测物提取液背景的光吸收(即波长为245nm下的吸光度超出紫外分光光度计的测定范围)，第二份待测物提取液加入氯化钠溶液，使其含有的氯化钠浓度与第一份待测物提取液中生成的氯化钠浓度相同；b.待测样品的紫外检测采用紫外分光光度法測定两份样品提取液在波长为 245nm下的吸光度；c.待测样品浓度的计算将“b”步骤测得的两次吸光度的差值作为抗坏血酸含量的测量值，代入标准曲线线性回归方程，计算出待测样品中抗坏血酸的浓度。待测液用紫外分光光度计测定245nm下的吸光度，两次吸光度的差值(A-B)值代入标准方程求出回归值，即为样品液的抗坏血酸浓度C，样品的抗坏血酸含量为CXV/W，其中V是加入偏磷酸-こ酸水溶液的体积，W为待测样品鲜重。该方法中所述的碱处理法破坏其中一份待测物提取液背景的光吸收包括以下步骤向待测物提取液中加入浓度为I 10mol/L的氢氧化钠溶液，优选2 4mol/L的氢氧化钠溶液，将提取液的PH值调节至大于12，混匀后室温放置10 30分钟，再加入盐酸将 PH值调回原值，所使用的盐酸浓度优选与氢氧化钠溶液的浓度相同。步骤“a”所述的匀浆时，偏磷酸-こ酸水溶液与待测物采用的比例优选为5ml 0.2 lg，所述的离心的条件可以为10000 12000 (X g)，离心10 20分钟。所述的标准样品溶液的制备包括以下步骤用去离子水配制5g/L的抗坏血酸溶液，用偏磷酸-こ酸溶液稀释成多个不同浓度的标准样品溶液，浓度范围为5 50mg/L，即用偏磷酸-こ酸水溶液配制呈浓度梯度的抗坏血酸标准液。所述的标准曲线线性回归方程的获得是将浓度范围为5 50mg/L的多个不同浓度的标准样品溶液分别采用紫外分光光度法进行检测，检测波长为245nm，将得到的吸光度绘制标准曲线，井根据朗伯-比尔定律计算获得标准曲线线性回归方程。本发明所述的待测物为不含单宁酸的植物或植物部位，植物部位可以是植物的茎、叶或根部，所述的植物优选为蔬菜、果树、灌木，如茶树叶等，本发明方法特别适用測定十字花科芸薹属叶用蔬菜中抗坏血酸的含量，该类蔬菜优选白菜、甘蓝等，可采用其茎、叶測定其中抗坏血酸含量。在偏磷酸-こ酸水溶液中，抗坏血酸在245nm下的吸光特性符合朗伯比尔定律。植物样品的偏磷酸-こ酸水提取液中，存在酚等物质在245nm下有吸光度，影响测定結果，因此需要将样品中的抗坏血酸破坏掉以除去样品提取液的背景干扰。抗坏血酸在强碱性溶液中极其不稳定，会迅速发生不可逆的变化，形成在245nm下没有光密度的物质，而强碱性溶液中抗坏血酸及各种有机物的紫外光密度大大增加，导致紫外吸光无法测量，本发明加入对应的强酸将PH值还原即可測定背景干扰。本发明采用紫外分光光度差減法，建立了ー种操作简单的測定植物组织中还原型抗坏血酸的方法。该方法不需要复杂的仪器设备和昂贵的药品，只需要常规的紫外分光光度计和常规药品即可完成。本发明比较了三种清除抗坏血酸以矫正背景的方法。在实验中，发现加入铜离子用量不易控制，量大则影响样品本身的吸光度，量少对抗坏血酸清除效果不佳，且加入铜离子后需煮沸，使操作繁复；活性炭处理对抗坏血酸清除效果极佳，但活性炭本身可以吸附一些色素物质和酚类物质，使样品背景受到较大影响，对于不同的植物样品測定效果不稳定， 处于旺盛生长阶段的茶树叶片和甘蓝叶片，用活性炭校正背景后測定的结果比其它方法的测定值高出3倍之多；用NaOH调节待测溶液体系PH值大于6时，抗坏血酸标准液与植物组
4织提取液在波长为245nm下的吸光度大幅増加，超出紫外分光光度计的测定范围，叶片样品提取液的颜色加深，再用HCl调节待测溶液体系PH值为I 2时，其吸光度回到紫外分光光度计的测定范围，叶片样品提取液的颜色恢复至无色透明；用NaOH调节待测溶液体系 PH值大于12，再用HCl将PH值调回I 2，经检测100mg/L的抗坏血酸的偏磷酸-こ酸水溶液中抗坏血酸破坏率大于98% (通过245nm下吸光度判断)。本发明调解pH过程能生成高浓度氯化钠，实验中未发现氯化钠在245nm下对偏磷酸-こ酸水溶液的吸光度造成明显的影响，但为了排除高盐对其他物质的不可知的影响，在补齐体积时优选使用2 4mol/ L NaCl，使测定组与校正组之间可能出现的差异最小。与现有技术比较本发明的有益效果本发明采用紫外分光直接測定法准确有效地清除溶液体系中的抗坏血酸以测定背景对吸光度的干扰。本发明采用碱处理后调回PH值的方法校正样品背景，操作简单，清除效率高，适合小量植物组织的批量測定。但是，单宁酸在碱性环境下受破坏严重且在245nm下有明显的光吸收，富含单宁酸的植物不适合本发明中的方法。因此，本发明方法适用于不含单宁酸的植物中抗坏血酸含量測定，特别适用十字花科芸薹属叶用蔬菜的含量測定。


图I为实施例I标准样品溶液中抗坏血酸浓度与吸光度A-B的线性关系图。
具体实施例方式以下通过具体实施例进ー步说明本发明。但实施例的具体细节仅用于解释本发明，不应理解为对本发明总的技术方案的限定。其中，抗坏血酸购自于Sigama公司。实施例I.配制偏磷酸-こ酸水溶液将偏磷酸15g，こ酸40mL和250mL水混合后，加热搅拌至偏磷酸溶解，用水定容至500mL。2.配制抗坏血酸标准样品溶液用去离子水配制浓度为5g/L的抗坏血酸溶液，用偏磷酸-こ酸溶液分别稀释成浓度为50mg/L, 40mg/L, 30mg/L, 20mg/L, lOmg/L, 5mg/L的标准液。3.标准曲线线性回归方程的获得将上述多个不同浓度的标准样品溶液分别采用紫外分光光度法进行检测，检测波长为245nm，将得到的吸光度绘制标准曲线，井根据朗伯-比尔定律计算获得标准曲线线性回归方程(如图I所示)。4.待测样品的制备准确称取0. 2 Ig白菜(Brassica rapapekinensis或 Brassica campestris pekinensis 或 Brassicapekinensisノ ロ十片，刀U入 5mL 偏憐酸一乙酸水溶液匀浆，转移至离心管中，10000 12000 (Xg)离心10分钟，取上清液，分为两等份，其中一份稀释一倍，因为白菜抗坏血酸含量高，该步骤为调节待测液浓度符合本方法的測定范围，另ー份加入等体积的10mg/L抗坏血酸-偏磷酸标准液。5.待测样品的測定每份再分别吸取2mL至两个IOmL离心管，其中ー个加入
I.5mg/LNaCl溶液2mL，混匀，转入石英比色皿，用紫外分光光度计测定245nm下吸光度A ； 另外ー个离心管加入3mg/L NaOH溶液lmL，将提取液的pH值调节至大于12，混匀，静置10 分钟，加入3mg/L HCL溶液ImL，混勻，将pH值调回至I 2，测定吸光度245nm下吸光度B。
6.待测样品浓度的计算将步骤5测得的两次吸光度的差值(A-B)作为抗坏血酸含量的测量值，代入标准曲线线性回归方程，计算出待测样品中抗坏血酸的浓度C。样品的抗坏血酸含量为CXV/W，其中V是加入偏磷酸-こ酸水溶液的体积，W为待测样品鲜重。按上述方法測定同样生长环境下三份白菜叶片样品。I.计算样品的抗坏血酸含量，加样回收率及标准偏差。结果表I所示表I
权利要求
1.ー种利用紫外分光光度法測定植物中抗坏血酸含量的方法，包括标准样品溶液的制备、标准曲线线性回归方程的获得、待测样品的制备、紫外检测及浓度计算，其特征在于所述的待测样品的制备、紫外检测及浓度计算包括如下步骤a.待测样品的制备将每2.5 3. 5g偏磷酸和7. 5 8. 5mLこ酸用水定容至IOOml得到偏磷酸-こ酸水溶液，将该溶液与待测物匀浆，离心，取上清液即为待测物提取液；取体积相等的两份待测物提取液，用碱处理法破坏第一份待测物提取液背景的光吸收，第二份待测物提取液加入氯化钠溶液，使其含有的氯化钠浓度与第一份待测物提取液中生成的氯化钠浓度相同，待测物为不含单宁酸的植物或植物部位；b.待测样品的紫外检测采用紫外分光光度法測定两份样品提取液在波长为245nm下的吸光度；c.待测样品浓度的计算将“b”步骤测得的两次吸光度的差值作为抗坏血酸含量的测量值，代入标准曲线线性回归方程，计算出待测样品中抗坏血酸的浓度。
2.根据权利要求I所述的利用紫外分光光度法測定植物中抗坏血酸含量的方法，其特征在于步骤“a”中所述的碱处理法破坏第一份待测物提取液背景的光吸收包括以下步骤 向待测物提取液中加入浓度为I lOmol/L的氢氧化钠溶液，将提取液的pH值调节至大于 12，混匀后室温放置10 30分钟，再加入浓度为I 10mol/L的盐酸将pH值调至I 2。
3.根据权利要求I所述的利用紫外分光光度法測定植物中抗坏血酸含量的方法，其特征在于所述的标准样品溶液的制备包括以下步骤用去离子水配制5g/L的抗坏血酸溶液， 用偏磷酸-こ酸溶液稀释成多个不同浓度的标准样品溶液，浓度范围为5 50mg/L。
4.根据权利要求I所述的利用紫外分光光度法測定植物中抗坏血酸含量的方法，其特征在于所述的标准曲线线性回归方程的获得是将浓度范围为5 50mg/L的多个不同浓度的标准样品溶液分别采用紫外分光光度法进行检测，检测波长为245nm，将得到的吸光度绘制标准曲线，井根据朗伯-比尔定律计算获得标准曲线线性回归方程。
5.根据权利要求I所述的利用紫外分光光度法測定植物中抗坏血酸含量的方法，其特征在于步骤“a”所述的取体积相等的两份待测物提取液再分别用偏磷酸-こ酸溶液稀释至待测物提取液体积的2 5倍。
6.根据权利要求I所述的利用紫外分光光度法測定植物中抗坏血酸含量的方法，其特征在于步骤“a”所述的匀浆时，偏磷酸-こ酸水溶液与待测物采用的比例为5ml : 0.2 lg。
7.根据权利要求I所述的利用紫外分光光度法測定植物中抗坏血酸含量的方法，其特征在于步骤“a”所述的离心的条件为10000 12000 (Xg)，离心10 20分钟。
全文摘要
本发明公开了一种利用紫外分光光度法测定植物中抗坏血酸含量的方法，该方法测定样品提取液中抗坏血酸的紫外吸收值，再用碱处理法破坏抗坏血酸测定背景紫外吸收值，两者的差值计算抗坏血酸的含量。特点在于测定背景样品时采用高浓度碱处理方法，使还原型抗坏血酸清除完全，同时避免了碱性环境对待测液紫外吸收的影响。该方法操作简单，测定结果准确，不易受到还原性物质的干扰，适用于植物学研究中数量较多的样品抗坏血酸的测定。
文档编号G01N21/33GK102608056SQ201210081629
公开日2012年7月25日 申请日期2012年3月23日 优先权日2012年3月23日
发明者侯喜林, 张硕, 李英 申请人:南京农业大学