专利名称：用于样品中桃源性成分检测的引物及方法和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体而言，本发明涉及用于样品中桃源性成分检测的寡核苷酸引物，用于测定样品中桃源性成分的实时荧光PCR检测方法，用于快速检测样品中桃源性成分的PCR检测试剂盒，以及样品中桃源性成分的特异性寡核苷酸引物和探针在检测样品中桃源性成分中的应用。
背景技术：
我国拥有丰富的水果资源，果汁加工业近年来发展迅速。随着人们生活水平和健康意识的提高，果汁饮料产品日趋多元化，各种果汁饮料的种类、类型和品牌层出不穷。然而受经济利益的驱使，一些不法厂商在果汁种类、含量标示上作假，使一些名不副实甚至以假充真的果汁充斥市场。这不仅直接损害了消费者的经济利益，而且极有可能�：ο颜呓】担币睬址噶松瘫瓿钟衅笠档暮戏ㄈㄒ妫钪詹唤銎苹滴夜谐【弥刃颍贾卵现氐母好嫔缁嵝вΓ怕疑缁岢闲盘逑担矣跋煳夜唐吩诠适谐∩系男蜗螅鸷ξ夜隹诿骋桌�。由于桃等水果中含有一种重要的过敏源-类甜蛋白 Thaumatin-LikeProtein(TLP),目前已成为引起过敏反应的主要水果之一，并逐渐受到越来越多的关注。TLP已从多种食物中提取出来，如梨、苹果、桃、番茄和马铃薯等，它是植物果实在受到病原微生物侵害时体内诱导产生的病程相关蛋白(I3Rs)家族的重要成员之一，参与多种抗真菌反应过程，也是部分人群的重要过敏源。目前市场上桃汁饮料中的类甜蛋白成分可能因为标识不清或掺伪造假，造成部分人群对其过敏而侵犯消费者权利。因此，果汁饮料中的过敏源成分类甜蛋白检测具有理论和现实意义。随着科技的发展，桃汁及其相关饮料的掺假手段也越来越隐蔽。最初的掺假仅是加水及蔗糖和糖浆等甜味剂，现在已经发展到根据各种果汁的组成而进行非常精细的添加，甚至将食品鉴伪专家建立的果汁组成数据库作为掺假的“配方”，使得各种传统的桃源性成分检测变得越来越困难。当前，急需一种能不受添加手段影响，从桃原料本质上予以检测的鉴伪技术。国内外关于果汁成分鉴别的研究经历了从单一性状、常见组分、常规分析到多性状、特异组分、专门分析及数理统计方法运用的过程。随着现代生物技术的发展，应用分子生物学方法进行食品鉴别正成为国际上倍受关注的研究方向。分子生物学技术以其方便、 准确、迅速、简洁的特点，从基因水平分析食品原料和产品的特性和来源，灵敏度更高、特异性更强，其结果为证明食品的真伪提供了真实、可靠的依据，给食品种类鉴别、产品溯源等食品鉴伪研究注入了新鲜血液，已成为近年来世界各国的许多机构和学者的研究方向。而实时荧光PCR技术的诞生，弥补了常规化学检测技术的诸多不足，为检测技术的发展开辟了新的领域。实时荧光PCR是在PCR反应体系中加入荧光标记探针，利用荧光信号来实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对模板浓度进行定量分析，使PCR技术从定性水平发展到定量水平。近几年，在分子生物学研究中，利用定量PCR对基因表达量及转基因产品含量进行检测，已获得了广泛应用。由于其大大提高了检测的灵敏度、特异性和精确性、并能有效减少实验过程中产生污染的危险，目前已广泛应用于果汁及其他食品的成分鉴别领域。实时荧光PCR技术的诞生，弥补了常规化学检测技术的诸多不足，为检测技术的发展开辟了新的领域。实时荧光PCR是在PCR反应体系中加入荧光标记探针，利用荧光信号来实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对模板浓度进行定量分析，使PCR技术从定性水平发展到定量水平。近几年，在分子生物学研究中，利用定量PCR对基因表达量及转基因产品含量进行检测，已获得了广泛应用。由于其大大提高了检测的灵敏度、特异性和精确性、并能有效地减少实验过程中产生污染的危险，目前已广泛应用于各个领域。目前，国内外尚未见报道能够快速、简单、特异且灵敏地检测果汁、食品、药品以及营养品等样品中桃源性成分的方法以及试剂盒。因此，本领域需要一种快速、特异性好、灵敏度高的样品中桃源性成分的检测方法以及用于快速检测样品中桃源性成分的试剂盒，进行果汁、食品、药品以及营养品等样品中桃源性成分的检测。
发明内容
本发明的一个目的在于，提供快速检测样品中桃源性成分的特异性寡核苷酸引物。本发明的另一个目的在于，提供快速测定样品中桃源性成分的PCR检测方法。本发明的再一个目的在于，提供用于快速检测样品中桃源性成分的PCR检测试剂
品.ο本发明的还一个目的在于，提供样品中桃源性成分的特异性寡核苷酸引物和探针在检测样品中桃源性成分中的应用。针对上述发明目的，本发明提供以下技术方案根据本发明的一个实施方案，本发明提供用于实时荧光PCR方法检测样品中桃源性成分的特异性寡核苷酸引物对，所述引物对是根据类甜蛋白基因内含子和核糖体DNA的ITS区序列在不同植物物种中具有差异性的特点而设计的。在一个实施方案中，其中所述引物对选自 No2-F :5，GAGCCAGCAGCTCTCCTCG 3，(SEQ ID NO 1)和 No2_R 5' GCACCTGCATATTCAAGAACG 3' (SEQ ID NO 2) ；No3-F 5' GAATTGCGCCAAGGAAATTG 3，(SEQ ID NO :3)和 No3-R :5，GAGAGCCGAGATATCCGTTG 3，(SEQ ID NO 4)；以及 Tao-F: TGATCGACCCTCAATCTTACTGTA(SEQ ID NO :5)和 Tao-R:CCCAAGAGCTTCTTATACTTTTACT(SEQ ID NO 6)。在一个优选的实施方案中，所述用于实时荧光PCR方法检测样品中桃源性成分的特异性寡核苷酸引物对是SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2。在另一个优选的实施方案中，所述用于实时荧光PCR方法检测样品中桃源性成分的特异性寡核苷酸引物对是SEQ ID NO 3 和SEQ ID NO :4。在另一个优选的实施方案中，所述用于实时荧光PCR方法检测样品中桃源性成分的特异性寡核苷酸引物对是SEQ ID NO :5和SEQ ID NO :6。根据本发明的另一个实施方案，本发明提供样品中桃源性成分的实时荧光PCR检测方法，所述方法包括使用针对样品中桃源性成分的特异性寡核苷酸引物对，所述引物对是根据类甜蛋白基因内含子和核糖体DNA的ITS区序列在不同植物物种中具有差异性的特点而设计的。在一个实施方案中，在本发明的样品中桃源性成分的实时荧光PCR检测方法中所使用的特异性引物对选自SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2 ；SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4 ；以及 SEQ ID NO 5 和 SEQ ID NO :6。在本发明方法的一个优选的实施方案中，所述实时荧光PCR方法为STOR荧光染料法。在本发明方法的另一个优选的实施方案中，所述实时荧光PCR方法为Taqman荧光探针法。在一个实施方案中，在本发明的检测样品中桃源性成分的Taqman荧光探针法中，还使用特异性的探针。在一个优选的实施方案中，所使用的探针序列为No3-P :5’FAM-CGGCGTCG TCATCTTCAAATATG-TAMAR 3，(SEQ ID NO :7)。在一个实施方案中，本发明的样品中桃源性成分PCR检测方法还进一步包括提取样品总DNA的步骤。在一个实施方案中，所述DNA提取步骤，通过检测植物本身所具有的内源参照基因叶绿体trn基因，来测试样品总DNA的提取质量。在一个优选的实施方案中，所述内参基因植物叶绿体trn基因的通用引物序列为 Nol-F 5‘CTTGATTTTACCAAAGATGATGA3,(SEQ ID NO 8)和Nol-R 5‘TTCTTCGCATGTACCCGCAG 3’(SEQ IDNO :9)。在本发明的样品中桃源性成分PCR检测方法中，所使用的对照样品包括苹果汁、梨汁、橙汁、猕猴桃汁、番茄汁等。在一个实施方案中，使用桃源性成分的特异性寡核苷酸引物对和植物通用扩增引物进行双重PCR扩增。在一个优选的实施方案中，所使用的桃源性成分的特异性寡核苷酸引物对为SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2，所使用的植物通用扩增引物为SEQ ID NO :8和SEQ ID NO :9。在另一个优选的实施方案中，所使用的桃源性成分的特异性寡核苷酸引物对为SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4，所使用的植物通用扩增引物为SEQ ID NO :8和SEQ ID NO :9。在另一个优选的实施方案中，所使用的桃源性成分的特异性寡核苷酸引物对为SEQ ID NO :5和SEQ ID NO :6，所使用的植物通用扩增引物为 SEQ ID NO 8 和 SEQ ID NO :9。根据本发明的另一个实施方案，本发明提供样品中桃源性成分的实时荧光PCR检测方法，所述方法包括使用本发明的针对样品中桃源性成分的特异性寡核苷酸引物对的组合。在一个实时方案中，根据本发明的实时荧光PCR检测方法，还包括使用内参基因植物叶绿体trn基因通用引物序列SEQ ID NO 8和SEQ ID NO :9，通过检测植物本身所具有的内源参照基因叶绿体trn基因，来测试样品总DNA的提取质量。在本发明的样品中桃源性成分的PCR检测方法中，还进一步包括对PCR扩增条件进一步优化的步骤。在一个优选的实施方案中，在PCR扩增条件优化的步骤中，使用不同的退火温度进行扩增。在一个优选的实施方案中，所述PCR扩增条件是95°C，IOmin ；95°C 15s ；60°C，lmin。根据本发明的另一个实施方案，本发明提供快速检测样品中桃源性成分的试剂盒，所述试剂盒包括本发明的用于实时荧光PCR方法检测样品中桃源性成分的特异性寡核苷酸引物对和使用说明书。在一个优选的实施方案中，所述试剂盒还包括用于样品DNA提取的试剂和用于PCR反应的试剂。在一个优选的实施方案中，所述试剂盒的使用说明书中包括对用于样品中桃源性成分PCR扩增的条件的描述。在一个优选的实施方案中，所述试剂盒的说明书中给出的PCR扩增条件是95°C，IOmin ；95°C 15s ；60°C，lmin。根据本发明的再一个实施方案，本发明提供本发明的用于实时荧光PCR方法检测样品中桃源性成分的特异性寡核苷酸引物对在检测样品中桃源性成分中的应用。在一个优选的实施方案中，本发明提供样品中桃源性成分的特异性寡核苷酸引物对SEQ ID N0:1和SEQ ID NO 2 ；SEQ IDNO 3 和 SEQ ID NO 4 ；或 SEQ ID NO 5 和 SEQ ID NO 6 在检测样品中桃源性成分中的应用。本发明以桃的DNA为检测基础，根据类甜蛋白基因内含子和核糖体DNA的ITS区序列在不同植物物种中具有差异性的特点，克隆了桃类甜蛋白基因内含子及其核糖体DNA 的ITS1-5. 8S-ITS2区序列。根据这些序列设计引物，利用实时荧光PCR法检测样品中的桃源性成分。实时荧光定量PCR即在常规PCR方法的基础上，加入荧光标记的探针或者荧光染料，随着PCR产物的积累，探针或染料发出的荧光信号增强，而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每产生一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。因此可以实时监控整个PCR反应过程，并最终检测出待测样品的初始拷贝数， 从而可检测待测样品中所含桃源性成分。本发明的实时荧光PCR检测方法采用完全闭管检测，无需PCR后处理，避免了交叉污染和假阳性。本发明的方法巧妙地运用了 PCR技术的DNA高效扩增、核酸杂交的特异性和荧光检测技术的快速和敏感性，具有操作简单、省时省力、结果可靠和准确灵敏等优点。 本发明的按照引物序列制成的试剂盒，用于此类产品的定性、定量检测，具有灵敏度高、特异性强、结果稳定可靠且避免交叉污染造成假阳性的优点。本发明的检测方法和试剂盒不仅适合检测果汁中的桃源性成分，还能够检测其他物品，例如食品、营养品等中的桃源性成分。使用本发明的PCR检测方法和PCR检测试剂盒，既可用于定性检测，又可用于定量检测，其简单、快速、特异且灵敏的特点适合用于国内外市场上桃汁及其相关饮料的真伪鉴别和过敏源成分的检测等。
图1是显示待测样品DNA提取效果的凝胶电泳图，其中使用植物通用引物检测，各泳道的样品如下=M =DNA分子量标记(2000bp) ；1 雪花梨；2 汇源梨汁；3 海太梨汁；4 汇源梨果肉饮料；5 茹梦牌梨汁；6 乐天梨汁；7 国光苹果；8 光明苹果汁；9 汇源苹果汁； 10 大湖苹果汁；11 乐活滋100%苹果汁；12 水蜜桃；13 汇源桃汁；14 汇源桃果肉饮料；15 茹梦牌桃汁；16 海太桃汁；17 橙汁；18 猕猴桃汁；19 番茄汁；20 空白对照(无菌水)。图2是显示通过实时荧光PCR检测样品中桃的类甜蛋白基因的结果，其中荧光曲线1-11依次为阳性对照(水蜜桃)、汇源桃汁、茹梦牌桃汁、海太桃汁、汇源桃果肉饮料、苹果汁、梨汁、橙汁、猕猴桃汁、番茄汁及空白对照。图3是显示实时荧光PCR检测样品中桃的ITS区序列的结果，其中荧光曲线1_11 依次为阳性对照(水蜜桃)、汇源桃汁、汇源桃汁、茹梦牌桃汁、海太桃汁、苹果汁、梨汁、橙汁、猕猴桃汁、番茄汁及空白对照。
具体实施例方式通过实施例的方式对本发明作进一步的说明，但是本发明并不仅仅局限于以下实施例。实施例1
本实施例为通过使用植物通用引物测试样品总DNA的提取质量。通过检测植物本身所具有的内源参照基因叶绿体trn基因，可以测试样品总DNA 的提取质量。本实施例中所使用的用于检测样品中植物源性成分的植物叶绿体trn基因通用引物序列为 SEQ ID NO 8 和 SEQ ID NO :9。在本实施例中，检测了雪花梨、汇源梨汁(北京汇源食品饮料有限公司，中国)、海太梨汁(海太，韩国)、汇源梨果肉饮料(北京汇源食品饮料有限公司，中国)、茹梦牌梨汁 (大湖(天津)新鲜食品果汁有限公司，中国)、乐天梨汁(乐天，韩国)、国光苹果、光明苹果汁(光明乳业股份有限公司乳品工厂，中国)、汇源苹果汁(北京汇源食品饮料有限公司， 中国)、大湖苹果汁(大湖(天津)新鲜食品果汁有限公司，中国)、乐活滋100%苹果汁 (北京乐活滋科技发展有限公司，中国)、水蜜桃、汇源桃汁(北京汇源食品饮料有限公司， 中国)、汇源桃果肉饮料(北京汇源食品饮料有限公司，中国)、茹梦牌桃汁(大湖(天津) 新鲜食品果汁有限公司，中国)、海太桃汁(海太，韩国)、橙汁、猕猴桃汁、番茄汁的总DNA 的提取质量。如图1所示，用植物通用引物扩增待测样品的DNA时均能在约159bp处出现条带， 表明所有待测样品DNA提取成功。实施例2本发明的发明人首次通过PCR克隆并测序了桃的类甜蛋白基因内含子序列。本实施例为通过PCR克隆测序获得桃的类甜蛋白基因内含子序列。根据类甜蛋白基因内含子在不同植物品种中具有差异性的特点，采用苹果类甜蛋白基因序列(Genbank No. AY792604)设计上下游引物扩增桃。按照Wizard Gel Extraction Kit (!Iomega，美国)的操作说明对桃PCR产物进行纯化、回收。按TaKaRa pMD19_T Vector 试剂盒(TaKaRa，日本)的说明书将纯化产物与pMD19_T Vector连接，连接体系10 μ L，其反应组分为pMD19-T Vector 1 μ L、PCR 产物 2 μ L、ddH20 2 μ L、Solution I 5 μ L，同时设置阳性和阴性对照。将连接体系置于室温02-37°C)反应30min，反应结束后，立即置于冰上。 加连接产物于50 μ LTOP感受态细胞中，轻弹混勻，冰浴30min，42°C准确热激90s，立即置于冰上2min，然后加入800 μ L已灭过菌的脑心浸液，37°C、200r/min振荡培养lh。5000r/min 低速离心lmin，弃600 μ L上清，将沉淀混勻，取100 μ L混合液涂于Amp+、X_Gal和IPTG处理的营养琼脂平板上，37°C过夜培养后置于4°C冰箱中4h。挑取单菌落白斑，在含有终浓度 200 μ g/mL的Amp的脑心浸液中在37°C、200r/min振荡过夜培养。(1)阳性克隆鉴定挑取单个白色克�。芯銹CR反应，体系为25yL，其组份为反应IOXBuffer 2. 5μ L.dNTPs 1 μ L、上下游引物各0. 5 μ L、Taq酶0. 2 μ L，挑取单菌落作为模板，加水补至25 μ L。反应程序为94°C 5min，94°C 30s, 55°C 30s, 72°C lmin，40个循环。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳鉴定。(2)测序确定阳性克隆后，挑取该菌落，在含有终浓度200 μ g/mL Amp的5 μ L脑心浸液中在37°C、200r/min振荡过夜培养。取ImL菌液送生物公司进行测序鉴定。PCR克隆测序得到的桃类甜蛋白基因内含子部分序列如下TGTAAGAAGATGAGAGCCAGCAGCTCTCCTCGGCCTCACCACCTTGGCCATCCTCTTCTTCTCAGGTAT AATATTTTACAATTTTTGTTAGTCGATCAGATATCGATCAAAAGTTTATTTTTACAATTGTCTCTGTAATCTGTATTCTTATGATCACGTACGTTCTTGAATATGCAGGTGCACATGCAGCGAAAATCAC(SEQ ID NO :10)。实施例3本实施例为通过使用桃的类甜蛋白基因的引物序列经实时荧光PCR特异性检测样品中桃源性成分的类甜蛋白基因序列。STOR荧光染料法STOR Green是高灵敏的DNA 荧光染料，在各种分析中至少可检出20pgDNA。STOR Green染料与双链DNA的亲和力非常高，在PCR反应中与产物dsDNA结合后荧光信号会增强800-1000倍且对分子生物学中常用的酶没有抑制作用。STOR Green PCR反应体系为Faststart Universal SYBRGreen Master (Roche) 12. 5 μ L ；上下游引物(10 μ mol/L)各 0. 5 μ L ；DNA 模板 5 μ L (约 50ng)，用无菌水补至总体系为25 μ L0采用Bio-Rad iQTM5多色实时PCR仪进行PCR扩增及结果分析，扩增条件如下95°C预变性IOmin ；95°C 10s,58°C 30s,40个循环，在PCR反应后进行熔解曲线分析。引物序列为:SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO :2。所使用的检测主要仪器微量移液器(10μ LUOOy LUOOOy L Eppendorf)、荧光定量 PCR 仪 (Mastercycler 印 realplex4 Eppendorf)、高速台式离心机(Picol7 Thermo)、高速粉碎机(IKA-WEARKE GERMANY)、凝胶成像系统(Gene Genius)、电泳仪(DYY22C型，北京六一仪器厂)、核酸蛋白分析仪(DYY-6C，北京六一仪器厂)、冷冻干燥机(Modulyod Freeze Dryer Thermo)、制冰机(XB70GRANT)等。检测主要试剂Taq酶、dNTPs、10XPCR Buffer、溴化乙锭、DNA Ladder Marker(2000) (Takara)购自上海生工公司；TaciMan Universal SYBR Green Master 购自 Roche 公司；引物(SEQ ID NO :1和SEQ ID NO 2)由上海奥科生物科技有限公司合成等。检测主要步骤IDNA 提取待测果汁样品为汇源桃汁、茹梦牌桃汁、海太桃汁、汇源桃果肉饮料、苹果汁、梨汁、橙汁、猕猴桃汁和番茄汁。取30mL样品至一洁净培养皿中，抽真空冻干；称取0. 2g冷冻干物质至一洁净 50mL 离心管中，加入 5mLCTAB 裂解液(2% CTAB (ff/V), 0. lmol/LTris-HCl, 20mmol/L EDTA,
1.4mol/LNaCl)，65°C 2h，间期不断混勻几次；8000rpm 15min,取ImL上清液至1支洁净
2.OmL离心管中，加入700 μ L氯仿，剧烈混勻30s, 14500rpm IOmin,分别取650 μ L上清液至洁净 2. OmL 离心管中，加入 1300 μ L CTAB 沉淀液(0. 5% CTAB (ff/V), 0. 04mol/LNaCl)， 剧烈混勻30s，室温静置Ih ； 14500rpm 20min，弃上清液，加入350 μ L 1. 2Μ NaCl，剧烈振荡 30s，再加入350 μ L氯仿，剧烈混勻30s, 14500rpm IOmin ；分别取上清液320 μ L，加入0. 8 倍体积异丙醇，混勻后，-200C lh，14500rpm 20min，弃上清液，加入500 μ L 70%乙醇，混勻后，14500rpm 20min，弃上清液，晾至风干，加入30 μ L ddH20溶解，4°C储存备用。2实时荧光PCR检测所用引物SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO :2。3实时荧光PCR反应体系Faststart Universal SYBR Green Master 12. 5μ L
上游引物(10ymol/L)0·5μ L下游引物(10ymol/L)0·5μ L模板 DNA 5μ L 力卩ddH20至总体积为25 μ L注每次PCR检测均设立相应的空白对照(用配制反应体系的超纯水代替DNA模板，检测试剂是否受到污染)；4实时荧光PCR反应参数95 "C IOmin95 "C IOs58 "C 30s40个循环反应。注不同仪器应将PCR各试剂及反应参数做适当调整。如图2所示，以桃汁为例，利用实时荧光PCR检测样品中桃的类甜蛋白基因时，水蜜桃、汇源桃汁、茹梦牌桃汁、海太桃汁、汇源桃果肉饮料样品PCR扩增片段的熔解曲线峰值均在73. 20士 1. 0°C，而苹果汁、梨汁、橙汁、猕猴桃汁、番茄汁及空白对照均无此熔解曲线峰值，表明该引物能有效检测出样品中的桃源性成分。实施例4与根据实施例3所述的方法相同，只是以待测样品DNA为模板，采用类甜蛋白基因的引物序列SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2以及植物通用扩增引物对SEQ ID NO :8和SEQ ID NO :9，进行双重PCR扩增。实施例5本实施例为通过使用桃的ITS基因的引物序列经实时荧光PCR特异性检测样品中桃源性成分的序列。Taqman荧光探针法=TaqMan技术是一种对单管PCR产物进行实时荧光定量检测的技术，在普通PCR扩增系统中，加入一个与靶基因序列特异互补的双荧光标记探针，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。定量步骤①确定CT值(C表示循环数(Cycle)，T表示荧光域值(Threshold)，即每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数；②利用标准曲线对未知样品进行定量测定。获得未知样品的CT值后，从标准曲线计算出该样品的起始拷贝数。每个模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，即起始拷贝数越多，CT值越小。 反应体系为TaqMan Universal probe Master 12. 5yL;探针(10 μ mol/L) 0. 5 μ L ；上、下游引物(10 μ mol/L)各0. 5 μ L ；模板DNA 5 μ L ；加ddH20至总体积为25 μ L。反应程序为 950C IOmin ；95°C 15s ；60°C Imin0所使用的检测样品中桃源性成分的ITS基因引物序列为上游引物SEQ ID NO 3 ； 下游引物SEQ ID NO :4;探针SEQ ID NO :7。I1aqMan探针是一种寡核苷酸探针，它的荧光与目的序列的扩增相关。它设计为与目标序列上游引物和下游引物之间的序列配对。荧光基团FAM(6-羧基荧光素(6-carboxy fluo-rescein))和TAMRA连接在探针的5'末端，而淬灭剂 TAMAR(6-羧基罗丹明(6-carboxy tetramethyl rhodamine))则在 3'末端。当完整的探针与目标序列配对时，荧光基团发射的荧光因与3'端的淬灭剂接近而淬灭。但在进行延伸反应时，聚合酶的5'外切酶活性将探针进行酶切，使得荧光基团与淬灭剂分离。
所使用的检测主要仪器微量移液器(10μ L、100 μ L、1000 μ L Eppendorf)、荧光定量 PCR 仪(ABI 7700 Applied Biosystems, USA))、高速台式离心机(Picol7 Thermo)、高速粉碎机(IKA-ffEARKE GERMANY)、凝胶成像系统(Gene Genius)、电泳仪(DYY22C型北京六一仪器厂)、核酸蛋白分析仪(DYY-6C北京六一仪器厂)、冷冻干燥机(Modulyod Freeze Dryer Thermo)、制冰机 (XB70GRANT)等检测主要试剂Taq 酶、dNTPs、10XPCR Buffer、溴化乙锭、DNA LadderMarker (2000) (Takara)购自上海生工公司；TaqMan Universal probe Master购自ABI公司；引物(上游引物SEQ ID NO :3;下游引物SEQ ID NO :4;探针SEQ ID NO :7。)由上海奥科生物科技有限公司合成等。检测主要步骤IDNA 提取待测果汁样品为汇源桃汁、茹梦牌桃汁、海太桃汁、汇源桃果肉饮料、苹果汁、梨汁、橙汁、猕猴桃汁和番茄汁。取30mL样品至一洁净培养皿中，抽真空冻干；称取0. 2g冷冻干物质至一洁净 50mL离心管中，加入5mLCTAB裂解液，65°C 2h，间期不断混勻几次；8000rpm 15min，取ImL 上清液至1只洁净2. OmL离心管中，加入700 μ L氯仿，剧烈混勻30s, 14500rpm IOmin,分别取650 μ L上清液至洁净2. OmL离心管中，加入1300 μ L CTAB沉淀液，剧烈混勻30s，室温静置Ih ;14500rpm 20min，弃上清液，加入350 μ L 1. 2Μ NaCl，剧烈振荡30s，再加入350 μ L 氯仿，剧烈混勻30s，14500rpm IOmin ；分别取上清液320 μ L，加入0. 8倍体积异丙醇，混勻后，-20°C lh，14500rpm 20min，弃上清液，加入 500 μ L 70 % 乙醇，混勻后，14500rpm 20min,弃上清液，晾至风干，加入30 μ L ddH20溶解，4°C储存备用。2实时荧光PCR检测所用引物和探针引物序列为上游引物SEQ ID NO 3 ；下游引物SEQ ID NO 4 ；探针SEQ ID NO 7 ；3实时荧光PCR反应体系TaqMan Universal probe Master 12. 5 μ L探针(10μΜ)0·5μ L上游引物(10ymol/L)0·5μ L下游引物(10ymol/L)0·5μ L模板 DNA 5μ L 力卩ddH20至总体积为25 μ L注每次PCR检测均设立相应的空白对照(用配制反应体系的超纯水代替DNA模板，检测试剂是否受到污染)；4实时荧光PCR反应参数95 "C IOmin95 "C 15s60 °C Imin注不同仪器应将PCR各试剂及反应参数做适当调整。如图3所示以桃汁为例，利用实时荧光PCR检测样品中桃的ITS区序列时，水蜜桃、汇源桃汁、茹梦牌桃汁、海太桃汁、汇源桃果肉饮料样品均出现PCR扩增，而苹果汁、梨汁、橙汁、猕猴桃汁、番茄汁及空白对照均未出现，表明该引物探针能有效检测出样品中的桃源性成分。实施例6与根据实施例5所述的方法相同，只是以待测样品DNA为模板，采用ITS基因的引物序列SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4以及探针SEQ ID NO 7和植物通用扩增引物对SEQ ID NO 8, SEQ ID NO :9，进行双重 PCR 扩增。实施例7本发明的发明人首次克隆并测序了桃的叶绿体Trnk基因和matK基因间区的序列。本实施例为通过PCR克隆测序获得桃的叶绿体Trnk基因和matK基因间区的序列。根据植物Trnk基因和matK基因间区设计上下游引物扩增桃的DNA。按照Wizard Gel Extraction Kit的操作说明对桃的PCR产物进行纯化、回收。按TaKaRa pMD19_T Vector试剂盒的说明书将纯化产物与pMD19-TVeCtor连接，连接体系10 μ L，其反应组分为PMD19-T Vector 1 μ L、PCR 产物 2 μ L、ddH20 2 μ L、Solution I 5 μ L，同时设置阳性和阴性对照。将连接体系置于室温02-37°C)反应30min，反应结束后，立即置于冰上。加连接产物于50 μ LTOP感受态细胞中，轻弹混勻，冰浴30min，42°C准确热激90s，立即置于冰上 2111士11，然后加入80(^1^已灭过菌的脑心浸液，37°C、200r/min振荡培养Ih0 5000r/min低速离心lmin，弃600 μ L上清，将沉淀混勻，取100 μ L混合液涂于Amp+、X_Gal和IPTG处理的营养琼脂平板上，37°C过夜培养后置于4°C冰箱中4h。挑取单菌落白斑，在含有终浓度 200 μ g/mL的Amp的脑心浸液37°C、200r/min振荡过夜培养。(1)阳性克隆鉴定挑取单个白色克�。芯銹CR反应，体系为25yL，其组份为反应IOXBuffer 2. 5μ L.dNTPs 1 μ L、上下游引物各0. 5 μ L、Taq酶0. 2 μ L，挑取单菌落作为模板，加水补至25 μ L。反应程序为94°C 5min，94°C 30s, 55°C 30s, 72°C lmin，40个循环。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳鉴定。(2)测序确定阳性克隆后，挑取该菌落，在含有终浓度200 μ g/mLAmp的5 μ L脑心浸液中37°C、200r/min振荡过夜培养。取ImL菌液送生物公司进行测序鉴定。PCR克隆测序得到桃的叶绿体Trnk基因和matK基因间区的部分序列如下CTCAGTTGATCGACCCTCAATCTTACTGTATGAACATTTCATAATAGAAATAAATGCAMTTTTTTGTT ATCTCTTCATTATTTAAAGATAATTCCATTTCTACGATCGCATAACCAATTATTCATAATTGATTAGATCATTGATG CAAAAAATATCCAAATACCAAATCCGACCTCTATAAAGTTTCTTAAAAGTAAAAGTATAAGAAGCTCTTGGGAAGAC C (SEQ ID NO 11)。通过叶绿体Trnk基因和matK基因间区的PCR引物定量检测样品中桃汁相对含量，用于定量检测混合果汁中桃汁成分相对含量的叶绿体Trnk基因和matK基因间区的PCR 引物为SEQ ID NO 5SEQ ID NO :6。以此对引物扩增混合果汁的DNA，桃成分所扩增的PCR产物长度为212bp ；通过在2. 5%的琼脂糖上进行电泳分离，可以确定PCR产物长度，从而判断混合汁中是否含有桃汁成分。实施例8本实施例提供快速检测样品中桃源性成分的试剂盒。所述试剂盒包括引物对SEQ ID N0:5、SEQ ID NO :6和引物对SEQ IDNO :8、SEQ ID NO :9，以及使用说明书，其中引物对SEQ ID NO 5,SEQID NO :6是用于实时荧光PCR检测样品中桃源性成分的特异性寡核苷酸引物对，SEQ ID NO 8, SEQ ID NO :9是植物通用扩增引物，所述使用说明书中给出了 PCR扩增条件，该条件为95°C, IOmin ；95°C,15s ；60°C，lmin。 对于不同仪器，反应参数做适当调整。实施例9本实施例提供快速检测样品中桃源性成分的试剂盒。所述试剂盒包括引物对SEQ ID NO =USEQ ID NO :2和引物对SEQ IDNO :8、SEQ ID NO :9，以及使用说明书，其中引物对SEQ ID NO :1和SEQID NO :2是用于实时荧光PCR检测样品中桃源性成分的特异性寡核苷酸引物对，SEQ ID NO 8, SEQ ID NO :9是植物通用扩增引物，所述使用说明书中给出了 PCR扩增条件，该条件为95°C，IOmin ；95°C，15s ；58°C，30s。 对于不同仪器，反应参数做适当调整。实施例10本实施例提供快速检测样品中桃源性成分的试剂盒。所述试剂盒包括引物SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4以及探针SEQ IDNO 7和引物对SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9，以及使用说明书，其中引物对SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4以及探针SEQ ID NO :7是用于实时荧光PCR检测样品中桃源性成分的特异性寡核苷酸引物对，SEQ ID NO 8,SEQ ID NO :9是植物通用扩增引物，所述使用说明书中给出了 PCR扩增条件，该条件为95°C，IOmin ；95°C,15s ；60°C，lmin。对于不同仪器，反应参数做适当调整。虽然已经对本发明的具体实施方案进行了描述，但是本领域技术人员应认识到， 在不偏离本发明的范围或精神的前提下可以对本发明进行多种改变与修饰。因而，本发明意欲涵盖落在权利要求书及其同等物范围内的所有这些改变与修饰。
权利要求
1.用于实时荧光PCR方法检测样品中桃源性成分的特异性寡核苷酸引物对，其中所述引物对选自以下引物对中的一种或多种:SEQ ID NO :1和SEQ ID NO 2 ；SEQ ID NO :3和SEQ ID NO 4 ；以及 SEQ ID NO 5 和 SEQ ID NO :6。
2.根据权利要求1所述的寡核苷酸引物对，其中所述引物对为SEQID NO :5和SEQ ID NO :6。
3.根据权利要求1所述的寡核苷酸引物对，其中所述实时荧光PCR方法为STOR荧光染料法，所述引物对为SEQ ID NO 1和SEQ ID NO :2。
4.根据权利要求1所述的寡核苷酸引物对，其中所述实时荧光PCR方法为Taqman荧光探针法，所述引物对为SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4，且所使用的探针为SEQ ID NO -J0
5.样品中桃源性成分的实时荧光PCR检测方法，所述方法包括使用权利要求1-4中任一项所述的特异性寡核苷酸引物对。
6.根据权利要求5所述的实时荧光PCR检测方法，还包括使用植物叶绿体trn基因通用引物序列 SEQ ID NO 8 和 SEQ ID NO :9。
7.快速检测样品中桃源性成分的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1-4中任一项所述的特异性寡核苷酸引物对和使用说明书。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包括植物叶绿体trn基因通用引物序列 SEQ ID NO 8 和 SEQ ID NO :9。
9.权利要求1-4中任一项所述的特异性寡核苷酸引物对在检测样品中桃源性成分中的应用。
全文摘要
本发明涉及用于样品中桃源性成分检测的寡核苷酸引物。本发明还涉及用于测定样品中桃源性成分的实时荧光PCR检测方法，所述方法包括使用针对样品中桃源性成分的特异性寡核苷酸引物。本发明还涉及用于快速检测样品中桃源性成分的PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括用于实时荧光PCR检测样品中桃源性成分的特异性寡核苷酸引物。本发明还涉及针对样品中桃源性成分的特异性寡核苷酸引物在检测样品中桃源性成分中的应用。使用本发明的PCR检测方法和PCR检测试剂盒，能够简单、快速、特异且灵敏地测定果汁、食品、药品以及营养品等样品中是否含有桃源性成分。
文档编号G01N21/64GK102344953SQ20101024051
公开日2012年2月8日 申请日期2010年7月30日 优先权日2010年7月30日
发明者吴亚君, 邓婷婷, 陈颖, 韩建勋, 黄文胜 申请人:中国检验检疫科学研究院
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