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专利名称：人肿瘤抗原p185的制作方法
技术领域：
本发明涉及肿瘤抗原的制备、可溶性肿瘤标记物的免疫学检测技术及其在肿瘤诊断中的应用。
背景技术：
p185HER-2是由癌基因neu/erbB-2/HER-2编码的一种重要的肿瘤细胞表面跨膜糖蛋白，在乳腺、卵巢、肺、胃、肝等十余种癌症中均显示有过量表达的p185HER-2蛋白。据美国《科学》杂志(Science，1989，244707-712)报导，约有30％以上的乳腺癌和卵巢癌病人肿瘤组织的细胞出现p185HER-2高表达，该类病人肿瘤恶性程度高、预后差。《英国癌症杂志》(Br J Cancer，1994，70，739-742)报导，检测p185HER-2对多种肿瘤的鉴别诊断、判断预后以至治疗均有重要意义。尤其对乳腺癌，p185HER-2已被国际公认为一个重要的临床指标。《中国免疫学杂志》(2000，16；539-541)报导，通过细胞表面表位包埋法研制的p185HER-2单抗能特异性地与高表达p185HER-2的细胞膜外区结合，对高表达p185HER-2肿瘤组织具有很强的膜定位性和低胞浆染色，特别适合对临床病例组织中p185HER-2进行免疫组织化学方法检测。虽然免疫组化方法是目前较为常规的检测方法，但该方法必须在外科手术切除病患组织的前提下才能使用，而且不便于检测大批样品以及对术后病人的长期跟踪，而病人手术前后p185HER-2的表达水平对预后和指导治疗方案具有非常重要的作用。血清p185HER-2检测技术可对病人进行动态观察又简便易行，更适合临床需要。美国《生物化学杂志》(JBiol Chem，1990；2661716-20.)报导，应用抗体在转基因的高表达p185HER-2的细胞株培养上清中可以检测到可溶性p185HER-2即p105水平；并指出p185HER-2与其他细胞膜受体分子类似，在过量表达时其胞外区可自细胞表面脱落而进入血清。随后荷兰《乳腺癌研究和治疗》杂志(Breast cancer Res treat 1993；2497-102)和美国《癌症》杂志(Oncology1997；54475-481)等先后报导了利用抗p185HER-2抗体并采用酶联免疫吸附(ELISA)技术进行血清p185HER-2检测。《美国临床病理杂志》(Am J ClinPathol，1999112(suppl.1)S53-S67)综述了世界上16个实验室有关血清p185HER-2的研究结果，指出血清p185抗原水平升高与肿瘤复发或转移具有很强的相关性，并且预示着对化疗、放疗及激素治疗的抗性，因此血清p185HER-2抗原可以作为一个重要的肿瘤标记物供临床使用。
现有制备p185HER-2抗原的方法主要有A法如美国《临床分析杂志》(Journal ofClinical Analysis，12298-303，1998)报导的用Superose 12 HR层析方法从含有p185HER-2蛋白的细胞裂解液中纯化p185HER-2蛋白，这种方法是根据蛋白的分子量进行分离纯化，没有特异性，因此p185HER-2抗原容易丢失，纯化效率低；B法美国《癌症研究》(Cancer Research，51，2593-2598，May15，1991)报导的用凝集素亲合柱从含有p185HER-2蛋白的细胞裂解液中亲合层析p185HER-2蛋白，这种方法使用的亲和柱对所有的糖蛋白包括p185HER-2蛋白都有吸附作用，因此特异性低，所得抗原的纯度低；C法，如美国《癌症研究》(CancerResearch，51，2593-2598，May15，1991)报导的用活化的Sepharose 4B亲和柱从含有p185HER-2胞外区蛋白的细胞培养上清中亲和层析p185HER-2蛋白，这种方法中使用的亲和柱需要先标记上抗体，但是抗体在Sepharose 4B亲和珠上定位的多样性使得抗体上结合抗原的位点没有充分地暴露于亲和珠之外，又由于p185HER-2的分子量较大，因此造成了一定的空间位阻，p185HER-2抗原不能充分地与亲和柱上的抗体结合，层析效率低；D法，如美国《免疫学方法杂志》(Journal of Immunological Methods，132，1990，73-80)报导的先对含有p185HER-2胞外区蛋白的细胞培养上清进行亲合层析，再进行离子交换层析，这种方法中增加了离子交换层析，离子交换层析是根据蛋白等电点的不同进行纯化，没有特异性，因此不仅步骤烦琐，而且增加了抗原损失的机会。
现有检测人血清p185HER-2的方法主要有A法，如荷兰《乳腺癌研究及治疗》(Breastcancer research and treatment，4387-95，1997)杂志报导的均相磁微粒法。这种检测方法将抗体标记的磁微粒作为固相载体，操作要求较高，检测抗体需要标记上acridiniumeaster，检测时将acridinium easter激活，产生的信号是荧光信号，需要用特殊的荧光检测仪，费用较高，尚不易于推广。B法，如美国《肿瘤研究》(cancer research 51，2593-2598，May 15，1991)报导的放射免疫测定法这种检测方法需要将检测抗体标记上同位素，产生的信号是γ射线，需要用γ计数仪检测，操作时需要特殊的防护。C法，如美国《临床化学》(Clinical Chemistry 45，No2，1999，292-295)报导的凝集素—酶联免疫方法(lectin-ELISA方法)，这种方法用凝集素代替抗体作为检测试剂，特异性低。D法，如美国《抗癌研究》(Anticancer research 182891-2894，1998)报导的三抗体夹心酶联免疫检测方法(三抗体夹心ELISA法)，这种方法步骤较为繁琐，不仅需要制备抗p185HER-2的单抗，还要制备抗p185HER-2的多抗，多抗的特异性不够强，批次间的稳定性不易于保持。E法，如美国《临床癌症杂志》(Journal of Clinical Oncology，Vol 10，N0 9(September)，1992，1436-1443)报导的双抗体夹心酶联免疫方法(双抗体夹心ELISA法)。这种方法采用ELISA酶标板作为固相基质，操作简单；反应的信号是酶底物反应后的颜色变化，人体不需要接触放射性同位素，安全；采用双抗体夹心法特异性强，永生细胞产生的单克隆抗体的稳定性易于保持。但现有的E法由于其使用的标准抗原与A、B、C、D方法一样，通常是采用凝集素亲和柱亲合层析方法、离子交换层析方法、Superose 12 HR层析方法或者Sepharose 4B亲合层析方法获得的，特异性不够强，抗原的纯度低。

发明内容
本发明的目的是提供一种标准可溶性p185HER-2抗原的制备方法、可溶性p185HER-2抗原的双抗体夹心ELISA检测方法以及该检测方法在肿瘤血清诊断中的用途。
本发明的标准可溶性p185HER-2抗原的制备方法，包括制备与抗体交联的亲和珠、制备含有p185HER-2抗原的样品、将含有p185HER-2抗原的样品与亲合珠混合、将混合物装柱和洗脱抗原；其特征在于所述与抗体交联的亲和珠是采用表面表位包埋法制备的抗p185HER-2胞外区的单克隆抗体与Sepharose 4B-ProteinG共价交联的亲和珠。
本发明的可溶性p185HER-2抗原的双抗体夹心ELISA检测方法，包括将一种p185HER-2单克隆抗体作包被抗体结合于固相支持物上，分别将含有可溶性p185HER-2的样品和纯化的已知浓度的p185HER-2标准抗原与包被的抗体温育，其中的p185HER-2抗原被包被抗体选择性地捕获，再用另一种酶标记的p185HER-2单克隆抗体作检测抗体，然后加酶的底物，采用显色反应的酶免疫检测方法来检测样品的光吸收；用已知浓度的纯化的p185HER-2标准抗原作对照，以显色反应的光吸收值对标准抗原的浓度作图，制定标准直线；将待测样品的光吸收值与标准抗原的光吸收值相比较，计算样品中p185HER-2的浓度；其特征在于(1)所述使用于双抗体夹心ELISA检测方法的p185HER-2单克隆抗体，是经纯化和辣根过氧化物酶标记的、采用表面表位包埋法制备的p185HER-2单克隆抗体；(2)所述纯化的p185HER-2标准抗原是采用表面表位包埋法制备的抗p185HER-2胞外区的单克隆抗体与Sepharose 4B-ProteinG共价交联的亲和珠对含有p185HER-2抗原的样品进行亲和层析的方法得到的。
本发明的可溶性p185HER-2抗原的双抗体夹心ELISA检测方法在肿瘤血清诊断上的用途，包括将双抗体夹心ELISA显色反应的结果中标准可溶性p185HER-2抗原的光吸收值对标准可溶性p185HER-2抗原的已知浓度作图，得到一条标准直线；将正常人血清反应的平均光吸收值加两倍标准方差的值与此标准直线比较，找到该值所对应的p185HER-2抗原浓度，设为阈值；将待测人血清反应的光吸收值与标准直线比较，计算血清中p185HER-2抗原的浓度，大于阈值的则诊断为p185HER-2高表达的肿瘤病人；其特征在于所述纯化的p185HER-2标准抗原是采用表面表位包埋法制备的单克隆抗体与Sepharose 4B-ProteinG共价交联的亲和珠对含有p185HER-2抗原的样品进行亲和层析的方法得到的。
本发明与现有技术相比具有以下优点和特异性(1)本发明可溶性p185HER-2标准抗原的制备方法与现有技术相比具有以下优点相对于A法本方法具有p185HER-2抗原与层析柱结合的特异性强、纯化效率高的优点；相对于B法，本方法也具有p185HER-2抗原与层析柱结合的特异性强、抗原纯化度高的优点；相对于C法，本方法具有克服了空间位阻、纯化效率高的优点；相对于D法，本方法具有步骤简单、纯化效率高的优点。由于利用抗体进行亲合层析方法，是根据抗原抗体结合的特异性进行纯化，而不是根据分子量的不同进行纯化，也不是根据糖基化与否进行纯化，也不是根据等电点的不同进行纯化，因此特异性大大提高；由于采用Sepharose 4B-ProteinG亲和珠而不是Sepharose 4B或Sepharose4B-protein A作为基质，抗体与其共价交联时，抗体的Fcγ1片段被Sepharose 4B上的proteinG特异性结合，抗体上结合p185HER-2抗原的Fab片段朝向Sepharose 4B-ProteinG亲和珠外，使得p185HER-2抗原与亲和珠结合的空间位阻大大降低，纯化效率得以提高。(2)本发明可溶性p185HER-2抗原的双抗体夹心ELISA检测方法是采用细胞表面表位包埋法制备的单克隆抗体检测可溶性p185HER-2抗原的双抗体夹心ELISA方法，是在原E法的基础上进一步改进，因此具有原E法的所有优点。而且由于标准抗原制备方法的改进，相对于原E法，本发明方法具有纯化可溶性标准p185HER-2抗原的效率高、特异性强、抗原的纯度高的优点。方法中所用的抗体是采用表面表位包埋法制备的抗p185HER-2胞外区的单抗，这些单抗目前只用在免疫组化检测病理切片上，这种检测需要提供手术时切除的组织样品，未见将其用于可溶性肿瘤抗原的ELISA检测和纯化p185HER-2抗原的报道。我们的进一步研究发现，将抗体纯化后标记上辣根过氧化物酶，并对标记前后抗体的性质进行免疫印迹法的检测，结果表明这几株纯化的单抗标记前后都与p185HER-2胞外区特异性结合，并且稳定性很好，我们根据抗体不同的亲和性，选择最适的两种抗体的组合方式和抗体工作浓度，首次将其应用于可溶性p185HER-2抗原的ELISA检测方法，这种检测不需要做手术，且具有很好的检测特异性和灵敏度。(3)根据我们采用本发明可溶性p185HER-2的双抗体夹心ELISA检测方法对88例肿瘤病人和137例正常人的血清进行多次检测的结果，证明本发明的检测方法重复性、稳定性好。该检测方法检测p185HER-2的灵敏度达到10到30ng/ml。x2分析的结果表明，该方法能明显区别肿瘤病人和正常人群(P＜0.025)，具有实用性，可应用于临床诊断。
具体实施例方式实施例1、制备含可溶性p185HER-2抗原的细胞裂解液和细胞培养上清(1)制备含可溶性p185HER-2抗原的细胞裂解液分别收集长至80％以上满度的NIH/3T3细胞(一种小鼠的成纤维细胞)和T6-17细胞(转染了人的HER-2基因的NIH/3T3细胞，该细胞表面高表达p185HER-2)，用冷的0.01M、PH7.2的PBS洗一次，加入由50mM Tris-HCl PH7.5、1％Trion X-100、150mM NaCl和8mMPMSF组成的冷的裂解缓冲液，冰浴振荡30分钟，收集裂解液，4℃离心，12000rpm 10分钟，T6-17细胞的上清即为含p185粗抗原的细胞裂解液。NIH/3T3细胞裂解液作为阴性对照。(2)制备含可溶性p185HER-2抗原的细胞培养上清T6-17细胞传代时改用无血清培养，待长满时，收集培养的上清，NIH/3T3细胞的培养上清作为阴性对照。
以下各实施例中使用的细胞裂解液均按此法制备，不另注明。
实施例2、检测可溶性p185HER-2抗原的双抗体夹心ELISA法条件的建立(1)培养用细胞表面表位包埋法获得的能特异性分泌抗p185HER-2胞外区单抗的永生的杂交瘤细胞如A18和A21，扩增后种入6到8周的Balb/c小鼠的腹腔中，待长腹水后，取出腹水，即为粗制的单克隆抗体A18和A21。(2)采用常规的辛酸—硫酸铵两步沉淀法纯化腹水中的单克隆抗体A18和A21(3)采用改良的过碘酸钠方法制备过氧化物酶标记的纯化的单克隆抗体A18即A18-HRP称5mg HRP溶于蒸馏水中，加入0.2ml新配制的0.1M过碘酸钠NaIO4，室温避光搅拌20分钟；于4℃对1mM、PH4.4的NaAC溶液透析过夜；于4℃将待标记抗体对0.01M NaHCO3缓冲液透析过夜；在透析好的HRP溶液中加入20ul0.2M NaHCO3溶液，将PH值调到PH9.0和PH9.5之间，立即加入透析好的10mg/ml的1ml抗体溶液，室温避光搅拌两小时；加入0.1ml新配的4mg/ml的硼氰化钠NaBH4溶液，于4℃搅拌2小时；于4℃对0.01M PH7.2 PBS透析过夜。标记的克分子比值和标记率均符合标记抗体使用要求的抗体即为标记好的检测抗体A18-HRP溶液，其中加入等量的60％灭菌甘油，-20℃保存。(4)确定包被抗体A21的工作浓度将纯化的抗体A21系列稀释于0.05M NaHCO3、PH为9.5的包被缓冲液，按100ul/孔加入ELISA酶标板，于4℃包被过夜；用泛特津公司的一号封闭剂封闭后分别加入系列稀释的作为对照的NIH/3T3细胞裂解液和含有可溶性p185HER-2抗原的T6-17细胞裂解液；洗涤后加入固定浓度的A18-HRP；加入临苯二胺(OPD)底物溶液显色，492nm测光吸收(OD)值。以检测到的p185HER-2抗原量基本达到饱和时的A21浓度的2倍即10ug/ml作为包被抗体A21的浓度。(5)确定检测抗体A18-HRP的工作浓度步骤基本同(4)，只是T6-17细胞裂解液和NIH/3T3细胞裂解液的浓度改为固定浓度，A18-HRP浓度改为系列稀释。将细胞裂解液在490nm处的光吸收值ODT6-17和ODNIH/3T3分别对抗体浓度作图，得到两条光滑曲线；以ODT6-17大于两倍的ODNIH/3T3时对应的A18-HRP浓度作为阳性。阳性范围内的抗体浓度即为抗体的工作浓度。通常选择5ug/ml作为A18-HRP的工作浓度。
实施例3、采用抗p185HER-2的单克隆抗体与Sepharose 4B-Protein G交联的亲和珠纯化p185HER-2抗原的方法该方法的具体步骤为(1)制备与抗p185HER-2的单克隆抗体交联的Sepharose 4B-Protein G亲和珠将纯化的抗体溶液与经缓冲液充分溶胀的Sepharose 4B-Protein G胶颗粒混合，4℃旋转温育过夜；用10倍体积的0.08M，PH9.0的四硼酸钠缓冲液离心洗涤两次，每次转速为3000g，时间为2分钟；弃上清，将亲和珠重悬于10倍体积的四硼酸钠缓冲液中，加入固体双功能试剂DMP，至终浓度为20mM，室温轻微振荡30分钟；用10倍体积的0.2M，PH8.0的乙醇胺缓冲液离心洗涤一次；重悬亲和珠于10倍体积的上述乙醇胺缓冲液中，室温轻微振荡2小时；用10倍体积的组成为50mM Tris-HCl PH7.5，150mM NaCl，1％Triton X-100，0.025％NaN3的Binding Buffer洗涤一次。
通过SDS-PAGE电泳对加DMP前后等体积亲和珠进行检测，浓缩胶为胶浓度5％，分离胶为胶浓度10％。将亲和珠与上样缓冲液混合煮沸后，离心取上清上样；加DMP前的泳道中有抗体带，加DMP后的泳道中没有抗体带，说明交联成功。交联好的抗体亲和珠在4℃保存于Binding Buffer中备用。(2)将含有可溶性p185HER-2抗原的液体(细胞裂解液或细胞培养上清液)与抗体亲和珠混合，装柱，洗涤柱并洗脱和收集抗原。
将含有可溶性p185HER-2抗原的细胞裂解液或细胞培养上清液与交联好的抗体亲和珠混合，4℃旋转温育过夜；将混合液装柱；使液体缓慢通过层析柱，收集所有通过液；将其以同样流速再上一次柱，分部收集通过液备测(以下各步的流速可适当加快)；用20倍柱体积的Binding Buffer洗涤层析柱，分部收集洗涤液；用20倍柱体积的10mM phosphate，PH6.8的预洗脱液洗涤层析柱，分部收集预洗脱液备测；用5倍柱体积的100mM Glysine，PH 2.5的洗脱液洗脱抗原，分部收集洗脱液，每只收集管中含有0.1倍体积的1.5MTris-HCl，PH8.8的中和缓冲液，以使洗脱液PH值迅速恢复到中性。
(3)用本发明的夹心ELISA方法和常规的免疫印迹法对各步分部收集的样品中的可溶性p185HER-2抗原进行检测分析a.采用本发明的夹心ELISA法测定层析过程中各种收集液中可溶性p185HER-2抗原分布纯化的抗p185HER-2单克隆抗体A21稀释于0.05M、PH9.6的NaHCO3溶液至终浓度为10ug/ml，包被于ELISA酶标板，每孔100ul，于4℃温育过夜；用含0.05％吐温的0.01M、PH7.2的TPBS洗涤液洗三次，每次两分钟；每孔加入350ul泛特津公司一号封闭剂，室温封闭40分钟；同上洗涤；每孔加入100ul稀释于封闭液的各部收集样品，4℃温育过夜；同上洗涤；每孔加入100ul 5ug/ml稀释于封闭液的A18-HRP，于37℃保湿温育1.5小时；同上洗涤；每孔加入100ul 1mg/ml OPD底物溶液，室温避光反应10分钟左右；每孔加入100ul 1M H2SO4，终止反应；在酶标比色仪上测490nm的光吸收值OD490。显色反应结果显示，细胞裂解液、洗涤液和预洗脱液的通过液中抗原的含量很少，获得的抗原集中在洗脱液中。说明在上样时大部分可溶性抗原都被吸附在抗体亲和柱上，通过液中都是未被吸附的杂蛋白通过特异性洗脱液的洗涤，被抗体特异性吸附的抗原被洗脱下来，也说明洗脱液中的p185HER-2抗原已经得到了纯化。
b.采用免疫印迹法测定层析过程中各种收集液中可溶性p185HER-2抗原的含量和免疫特异性先对通过液进行常规的SDS-PAGE电泳，浓缩胶为胶浓度5％，分离胶为胶浓度7％；电转移到Hybond-ECL膜上；丽春红染色；洗涤后用封闭缓冲液封闭膜；加入2ug/ml的抗p185HER-2单克隆抗体，37℃温育2小时；洗涤，加入1∶2000稀释的辣根过氧化物酶表记的羊抗鼠IgG，37℃温育1.5小时；洗涤，荧光底物显色，用X光片曝光；结果与a测定的结果吻合，即夹心ELISA法鉴定为阳性的洗脱样品在丽春红染色以及免疫印迹法的泳道中，在185KD和105KD附近各有一条带，分别为p185HER-2抗原及其胞外区。而夹心ELISA法鉴定为阴性的洗脱样品泳道中无免疫印迹带。说明洗脱液中的p185抗原已被纯化，纯化的p185HER-2抗原具有被抗p185HER-2单克隆抗体识别的特异性，纯化的抗原浓度在1ug/ml以上。
实施例4、用本发明的夹心ELISA方法检测细胞裂解液或细胞培养上清中的可溶性p185HER-2抗原同实施例3(3)a。只是样品分别为细胞裂解液和细胞培养上清，用纯化的可溶性p185HER-2抗原作为对照。显色反应的结果表明纯化的可溶性p185HER-2抗原的浓度和OD值之间有很好的线性相关性；T6-17细胞裂解液和T6-17细胞培养上清的OD值均分别为NIH/3T3细胞裂解液和细胞培养上清的OD值的两倍以上。说明该方法能够检测出细胞裂解液和细胞培养上清中的可溶性的p185HER-2抗原。
实施例5、本发明用于人血清中可溶性p185HER-2的检测实验(1)人血清样品的检测试验利用本发明的双抗体夹心ELISA方法已经检测137例正常人，65例乳腺癌病人和33例其他癌症病人血清中的可溶性p185HER-2水平。每次实验用标准的可溶性p185HER-2抗原作为对照。具体步骤见实施例3。将显色反应的结果中已知浓度的可溶性p185HER-2标准抗原的光吸收值对标准可溶性p185HER-2抗原的浓度作图，得到一条标准直线；实验中检测的所有正常人血清反应的平均光吸收值加两倍标准方差的值与此标准直线比较，找到该值所对应的p185HER-2抗原浓度，设为阈值，为30ng/ml；每个人血清反应的光吸收值与标准直线比较，计算血清中p185HER-2抗原的浓度，大于30ng/ml的则诊断为p185HER-2高表达的肿瘤病人。(2)血清样品检测结果的统计学分析应用本发明的双抗体夹心ELISA方法对上述的肿瘤病人血清和正常人血清进行检测后，对测定结果进行卡方(x2)检验。结果表明P值小于0.025，说明本方法能明显区别病人和对照组，检测结果具有统计学意义，已达到临床实用要求。
权利要求
1.一种标准可溶性p185HER-2抗原的制备方法，包括制备与抗体交联的亲和珠、制备含有p185HER-2抗原的样品、将含有p185HER-2抗原的样品与亲合珠混合、将混合物装柱和洗脱抗原；其特征在于所述与抗体交联的亲和珠是采用表面表位包埋法制备的抗p185HER-2胞外区的单克隆抗体与Sepharose 4B-ProteinG共价交联的亲和珠。
2.一种可溶性p185HER-2抗原的双抗体夹心ELISA检测方法，包括将一种p185HER-2单克隆抗体作包被抗体结合于固相支持物上，分别将含有可溶性p185HER-2的样品和纯化的已知浓度的p185HER-2标准抗原与包被的抗体温育，其中的p185HER-2抗原被包被抗体选择性地捕获，再用另一种酶标记的p185HER-2单克隆抗体作检测抗体，然后加酶的底物，采用显色反应的酶免疫检测方法来检测样品的光吸收；用已知浓度的纯化的p185HER-2标准抗原作对照，以显色反应的光吸收值对标准抗原的浓度作图，制定标准直线；将待测样品的光吸收值与标准抗原的光吸收值相比较，计算样品中p185HER-2的浓度；其特征在于(1)所述使用于双抗体夹心ELISA检测方法的p185HER-2单克隆抗体，是经纯化和辣根过氧化物酶标记的、采用表面表位包埋法制备的p185HER-2单克隆抗体；(2)所述纯化的p185HER-2标准抗原是采用表面表位包埋法制备的抗p185HER-2胞外区的单克隆抗体与Sepharose 4B-ProteinG共价交联的亲和珠对含有p185HER-2抗原的样品进行亲和层析的方法得到的。
3.可溶性p185HER-2抗原的双抗体夹心ELISA检测方法在肿瘤血清诊断上的用途，包括将双抗体夹心ELISA显色反应的结果中标准可溶性p185HER-2抗原的光吸收值对标准可溶性p185HER-2抗原的已知浓度作图，得到一条标准直线；将正常人血清反应的平均光吸收值加两倍标准方差的值与此标准直线比较，找到该值所对应的p185HER-2抗原浓度，设为阈值；将待测人血清反应的光吸收值与标准直线比较，计算血清中p185HER-2抗原的浓度，大于阈值的则诊断为p185HER-2高表达的肿瘤病人。其特征在于(1)所述纯化的p185HER-2标准抗原是采用表面表位包埋法制备的单克隆抗体与Sepharose 4B-ProteinG共价交联的亲和珠对含有p185HER-2抗原的样品进行亲和层析的方法得到的。(2)所述的双抗体夹心法是采用表面表位包埋法制备的抗体，并按抗体不同亲和性，选择两种抗体最佳组合而建立的方法。
全文摘要
本发明可溶性p18文档编号G01N33/96GK1397803SQ0111378
公开日2003年2月19日 申请日期2001年7月13日 优先权日2001年7月13日
发明者刘兢, 李平, 吴强, 姚阳, 官伟宁, 杨峰 申请人:中国科学技术大学