专利名称：：一种载脂蛋白e检测试剂的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种测定血清成分试剂的制备方法及试剂盒，特别是测定血清中APOE的试剂，可广泛应用在医学及生物化学
技术领域：
。
背景技术：
：载脂蛋白E(APOE)是一个含有299个氨基酸结合有磷脂的糖蛋白.其分子量为34kD。ApoE可以在各种组织中合成，但以肝脏为主，首先合成的是含有317个氨基酸的前肽，这个前肽在内质网中经过蛋白水解作用除去18个氨基酸的信号肽，再经过糖基化作用和细胞外液的脱唾液酸作用形成成熟的ApoE；ApoE分泌入血后即转移到脂蛋白中。APOE是脂蛋白所必须的结构蛋白，可通过与各组织细胞的受体结合，参于脂蛋白代谢，调节胆固醇水平，激活卵磷脂腿固醇脂舫蘸转移酶(LCAT)，并具有某种免疫调节作用。测定ApoE对诊断和治疗高脂血症动脉粥样硬化等疾病提供了重要理论依据。已知测定APOE的方法有层析法、电泳法、免疫分析法、其中层析法和电泳法操作繁琐，不能进行批量样本分析和直接上全自动生化分析仪等缺点，而免疫分析法中的免疫扩散法、放射免疫分析法、荧光标记免疫分析法、酶标记免疫分析法、化学发光免疫分析法也存在诸多不足之处；如需要特殊的设备，样品需要预处理，不能上全自动生化分析仪进行批量检测分析等。临床上常用的免疫透射比浊法因其样本用量少，可直接在全自动上进行批量样本分析、操作简单受其欢迎；但目前建立的方法及试剂都存在一些缺点和/或不足，主要表现在一是抗体效价不高，特异性、亲合力、亲和力不好；二是校准血清是以人血清为基质，虽然乙肝表面抗原阴性、HIV检测阴性、丙氨酸氨基转移酶正常的人血清，但这也很难排除没有其他传染病的可能，给操作者带来很大的危险性；而且校准血清为冻干品，每批的定值不一，使用前需用水复溶，操作极其不便；另外，不同的复溶者复溶后瓶间差异大，复溶后必须冰冻保存，特别是不能反复解冻使用，不但造成试剂浪费，而且质量也得不到保证，测定结果差异大，其稳定性也不好；三是对高脂、黄疸、溶血样本抗干扰能力差；四是采用单点校准液定标，不符合曲线回归方程计算，导致出现高值偏低，低值偏高的现象，所测结果不准确；五是抗血清在短时间内出现沉淀，使上机操作困难，影响检测效果。
发明内容本发明的目的就是提供一种样本无需稀释、操作简单、准确度高、重复性好、抗干扰能力强，采用优质新生牛血清代替人血清作为基质制备的稳定的以液体血清型恒定值校准液联合检测载脂蛋白E的试剂，来解决上述
背景技术：
的不足之处。本发明提供的技术方案是一种载脂蛋白E检测试剂，包括a、试剂Rl—种使样品中APOE抗原位点充分暴露，有利于与抗APOE抗体充分结合的反应剂，包括5-200mmol/L缓冲液、0.1_10%的表面活性剂、0.1_40%电解质、20%-80%高分子加速剂、0.1%-0.5%反应促进剂、0.1%-1%的稳定剂以及适量防腐剂，其余为纯化水。b、试剂R2—种与人血清中的APOE抗原有高度特异反应性的抗APOE抗体溶液，在一定量的试剂Rl中加入体积比为20-50%的抗人APOE抗血清以及0.001%-5%的抗氧化剂；C、恒定值校准液一种用来与样品比较，进行结果计算的液体血清型溶液，包括:20-100mmol/L的缓冲液、80_160mg/L的APOE抗原、0.01-20mmol/L的抗氧化剂、0.01-15mmol/L的增效剂、0.l-50mmol/L的稳定剂、适量防腐剂，其余为纯化水。恒定值校准液的浓度可以是高浓度单点参考校准品，在使用时用生理盐水稀释成多个不同浓度的参考校准品，也可以直接制备成多个不同浓度的参考校准品，这里没有特别的限制，只要制得的APOE恒定值校准液能与样本比较，能够测定样本中恒定值校准液的含量即可。进一步，试剂R2中还加入反应促进剂聚凝胺，以缩短整个反应时间。增效剂可选用柠檬酸、洒石酸、抗坏血酸中的一种或多种。抗氧化剂可以先溶解在IO-IOOml丙二醇或乙醇中，然后加入试剂R2中。本发明的检测原理是利用抗原抗体反应，加入试剂Rl(反应剂)解除样本中抗原周围的电子层和水化层，使抗原位点充分暴露，然后加入试剂R2(抗APOE抗体溶液)使有高度特异反应性的抗APOE抗体与样本中相应的抗原反应，形成不溶性的抗原_抗体复合物，产生一定的浊度，其浊度高低与样本中的APOE含量成正比；在规定波长下测定该不溶性抗原-抗体复合物的吸光度值，与已知恒定的校准液(ΑΡ0Ε抗原浓度相同的校准液)比较，则可计算出样本中APOE的含量。本发明的有益效果是由于首次采用抗氧化剂的再生技术(加入增效剂)来稳定载脂蛋白E参考校准品，提高了抗干扰能力，使校准液的值在2-8°C—年几乎保持不变，这就显著提高了检测数据的准确性(与放射免疫分析法的检测数据基本一致)，并且重复性好；另外，检测样本无需稀释、能够直接采用全自动生化分析仪，操作方法和步骤得到了大幅度的简化，检测效率显著提高。图1是本发明实施例1进行检测所得的APOE的测定值与通过放射免疫分析法所得的APOE测得值的相互关系示意图。图2是本发明实施例2进行检测所得的APOE的测定值与通过放射免疫分析法所得的APOE测得值的相互关系示意图。图3是本发明实施例3进行检测所得的APOE的测定值与通过放射免疫分析法所得的APOE测得值的相互关系示意图。具体实施例方式本发明提供的检测试剂盒，其中主要包括一种与APOE抗原有高度特异反应活性的抗体和使样品中APOE抗原位点充分暴露的反应剂(或称样品稀释液)以及液体血清型恒定值校准液。本发明的有关细节描述如下缓冲液可以是磷酸盐、三羟甲基氨基甲烷、PIPES、HEPES、TAPS、甘氨酸、硼酸，或者硼酸盐中的一种或多种；本发明优选磷酸盐缓冲液，缓冲液的PH值为5-10，优选7.4-8.1。表面活性剂可选用是非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂或两性离子表面活性剂，这里优选非离子表面活性剂，作为实例有Theist、Tween系列、聚氧乙烯月桂醚系列、聚氧乙烯苯基醚、聚氧乙烯辛基苯醚、聚氧乙烯烷基苯基醚、聚氧乙烯壬基苯基醚等，这些表面活性剂可以单独使用，也可以两种或两种以上混合使用，这里不作限制。电解质可选用阴离子电解质或阳离子电解质，本发明优选阳离子中的氯化钠(NaCl)。高分子加速剂可选用聚乙二醇2000、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000中的一种或多种，优选聚乙二醇6000。防腐剂可选用叠氮钠、乙基汞硫代硫酸钠、对羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸乙酯、苯酚、广谱杀菌剂中的一种或多种混合；从环保角度考虑，本发明优选广谱杀菌剂。防霉剂可选用丙酸钠、脱氧乙酸中的一种或多种。稳定剂可选用乙二胺四乙酸二钠、氯化镁、牛(人)血清白蛋白乙二醇、甘露糖醇、海藻糖中的一种或多种混合。抗人APOE抗血清可以是羊抗人APOE抗血清、兔抗人APOE抗血清、鼠抗人APOE抗血清、�？谷薃POE抗血清中的一种。抗氧化剂可选用丁基羟基茴香醚、硫代二丙酸二月桂酯、二丁基羟基甲苯、苯多酚、甘草抗氧化物、磷脂中的一种或多种混合。反应促进剂可选用聚凝胺。恒定值校准液是决定试剂准确度的重要因素之一；载脂蛋白APOE在液体状态下，能自发氧化，使校准液的值在短时间内发生很大的下降，所以必须使用抗氧化剂来减缓或阻止载脂蛋白APOE的氧化速度；但是由于时间过长或某些客观的因素，抗氧化剂本身也发生了还原，其抗氧化效果下降。为了提高校准液在液体状态下的稳定性，发明人进行了长期研究后发现抗氧化剂被还原的同时，产生了一定量的自由基，在其中加入适量的增效剂，使增效剂与抗氧化剂还原产生的自由基作用，使抗氧化剂得以再生.从而达到提高了校准液的稳定性。本发明首次采用抗氧化剂的再生技术(加入增效剂)来稳定载脂蛋白E参考校准品，使校准液的值在2-8°C—年几乎保持不变。本发明所用生化原料可全部外购。以下通过具体实施例进一步说明。实施例1试剂Rl(反应剂)磷酸盐(缓冲液)25mmol/L(5-200mmol/L)聚氧乙烯月桂醚(表面活性剂)5%(0.1-10%)NaCL(电解质)4.5%(0.1%-0.5%)PEG-6000(高分子加速剂)40%(20%-80%)广谱杀菌剂(防腐剂)3%(0.-5%)聚凝胺(反应促进剂)0.3%(0.1%-0.5%)乙二胺四乙酸二钠(稳定剂)0.5%(0.-1%)牛血清白蛋白(稳定剂)1%(0.1%-1%)APOE抗体试剂其余为纯化水试剂R2(抗APOE抗体溶液)反应剂稀释液(或样本稀释液)IOOOml羊抗人APOE抗血清400ml丁基羟基茴香醚0.03%恒定值校准液(血清型溶液):CAPSO(缓冲液)20mmol/L丁基羟基茴香醚(抗氧化剂)6mmol/L柠檬酸(增效剂)lOmmol/L广谱杀菌剂(防腐剂)2mmol/L乙二胺四乙酸二钠(稳定剂)2mmol/L牛血清白蛋白(稳定剂)3mmol/L丙酸钠(防霉剂)2mmol/LAPOE抗原120mg/L其余为纯化水按照需要的恒定值校准液浓度将相应量的APOE抗原加入上述溶液中，制备得APOE恒定值校准液。APOE恒定值校准液的浓度可以是高浓度单点参考校准品，在使用时用生理盐水稀释成多个不同浓度参考校准品，也可以直接制备成多个不同浓度的参考校准品。然后用0.22μm的滤膜抽滤除菌，放2-8°C保存。采用本实施例获得的APOE测定值与通过放射免疫分析法所得的APOE测得值进行比较(如图1所示；并进行回归分析)，获知相关性r=0.9795(y=0.9758X-0.5125)；显示出本实施例与放射免疫分析法具有良好的相关性。实施例2试剂Rl(反应剂)磷酸盐(缓冲液)30mmol/L聚氧乙烯月桂醚(表面活性剂)5%NaCL(电解质)4.5%PEG-6000(高分子加速剂)40%广谱杀菌剂(防腐剂)3%聚凝胺(反应促进剂)0.3%乙二胺四乙酸二钠(稳定剂)0.5%牛血清白蛋白(稳定剂)1%其余为纯化水试剂R2(抗APOE抗体溶液)反应剂稀释液(样本稀释液)IOOOml羊抗人APOE抗血清250ml丁基羟基茴香醚0.03%恒定值校准液(血清型溶液)CAPSO(缓冲液)50mmol/L丁基羟基茴香醚(抗氧化剂)6mmol/L柠檬酸(增效剂)lOmmol/L广谱杀菌剂(防腐剂)2mmol/L乙二胺四乙酸二钠(稳定剂)2mmol/L牛血清白蛋白(稳定剂)3mmol/L丙酸钠(防霉剂)2mmol/LAPOE抗原150mg/L其余为纯化水按照需要的恒定值校准液浓度将相应量的APOE抗原上述溶液中，制备得APOE恒定值校准液。APOE恒定值校准液的浓度可以是高浓度单点参考校准品，在使用时用生理盐水稀释成多个不同浓度参考校准品，也可以直接制备成多个不同浓度的参考校准品。然后用0.22μm的滤膜抽滤除菌，放2-8°C保存。采用本实施例获得的APOE测定值与通过放射免疫分析法所得的APOE测得值进行比较(如图2所示；并进行回归分析)，获知相关性r=0.9889(y=1.0076X-1.3128)；显示出本实施例与放射免疫分析法具有良好的相关性。实施例3试剂Rl(反应剂)磷酸盐(缓冲液)200mmol/L(5-200mmol/L)聚氧乙烯月桂醚(表面活性剂)5%(0.1-10%)NaCL(电解质)4.5%(0.1%-0.5%)PEG-6000(高分子加速剂)40%(20%-80%)广谱杀菌剂(防腐剂)3%(0.-5%)聚凝胺(反应促进剂)0.3%(0.1%-0.5%)乙二胺四乙酸二钠(稳定剂)0.5%(0.-1%)牛血清白蛋白(稳定剂)1%(0.1%-1%)其余为纯化水试剂R2(抗APOE抗体溶液)反应剂(样品稀释液)IOOOml羊抗人APOE抗血清300ml丁基羟基茴香醚0.03%恒定值校准液(血清型溶液)CAPSO缓冲液100mmol/L丁基羟基茴香醚抗氧化剂6mmol/L柠檬酸增效剂IOmmol/L广谱杀菌剂防腐剂2mmol/L乙二胺四乙酸二钠稳定剂2mmol/L牛血清白蛋白稳定剂3mmol/L丙酸钠防霉剂2mmol/LAPOE抗原100mg/L其余为纯化水按照需要的恒定值校准液浓度将相应量的APOE抗原上述溶液中，制备得APOE恒定值校准液。APOE恒定值校准液的浓度可以是高浓度单点参考校准品，在使用时用生理盐水稀释成多个不同浓度参考校准品，也可以直接制备成多个不同浓度的参考校准品。然后用0.22μm的滤膜抽滤除菌，放2-8°C保存。采用本实施例获得的APOE测定值与通过放射免疫分析法所得的APOE测得值进行比较(如图3所示；并进行回归分析)，获知相关性r=0.9967(y=0.9994X-0.9826；显示出本实施例与放射免疫分析法具有良好的相关性。本发明的测定步骤<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>结果的计算<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>式中ΔΑΤ以空白管吸光度作对照的样品管吸光度值AAS以空白管吸光度作对照的校准管吸光度值CS校准液中ApoE的浓度尚需说明的是本文中未特别标明的比例均为重量比。权利要求一种载脂蛋白E检测试剂，包括a、试剂R1一种使样品中APOE抗原位点充分暴露，有利于与抗APOE抗体充分结合的反应剂，包括5-200mmol/L缓冲液、0.1-10％的表面活性剂、0.1-40％电解质、20％-80％高分子加速剂、0.1％-0.5％反应促进剂、0.1％-1％的稳定剂以及适量防腐剂，其余为纯化水。b、试剂R2一种与人血清中的APOE抗原有高度特异反应性的抗APOE抗体溶液，在一定量的试剂R1中加入体积比为20-50％的抗人APOE抗血清以及0.001％-5％的抗氧化剂；c、恒定值校准液一种用来与样品比较，进行结果计算的液体血清型溶液，包括20-100mmol/L的缓冲液、80-160mg/L的APOE抗原、0.01-20mmol/L的抗氧化剂、0.01-15mmol/L的增效剂、0.1-50mmol/L的稳定剂、适量防腐剂，其余为纯化水。2.根据权利要求1所述的一种载脂蛋白E检测试剂，其特征在于试剂R2中还加入反应促进剂聚凝胺。3.根据权利要求1或2所述的一种载脂蛋白E检测试剂，其特征在于所述的增效剂可选用柠檬酸、洒石酸、抗坏血酸中的一种或多种。4.根据权利要求3所述的一种载脂蛋白E检测试剂，其特征在于所述抗氧化剂先溶解在IO-IOOml丙二醇或乙醇中，然后加入试剂R2中。全文摘要本发明涉及一种测定血清中APOE的试剂。目的是提供一种样本无需稀释、操作简单、准确度高、重复性好、抗干扰能力强，采用优质新生牛血清代替人血清作为基质制备的稳定的以液体血清型恒定值校准液联合检测载脂蛋白E的试剂。技术方案是一种载脂蛋白E检测试剂包括a、试剂R1缓冲液、表面活性剂、电解质、高分子加速剂、反应促进剂、稳定剂以及适量防腐剂，其余为纯化水。b、试剂R2在一定量的试剂R1中加入体积比为20-50％的抗人APOE抗血清以及抗氧化剂；c、恒定值校准液包括缓冲液、APOE抗原、抗氧化剂、增效剂、稳定剂、适量防腐剂，其余为纯化水。文档编号G01N33/96GK101799475SQ20101013941公开日2010年8月11日申请日期2010年3月31日优先权日2010年3月31日发明者王贤理,蒙凯,蔡其浩申请人:浙江伊利康生物技术有限公司
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