专利名称：一种具己糖激酶抑制作用的活性成分的筛选方法
技术领域：
本发明属药物分析领域，涉及中药材中活性成分的筛选方法，具体涉及一种具己糖激酶抑制作用的中药活性成分的筛选方法。
背景技术：
恶性肿瘤是严重威胁人类生命的疑难疾�。墙龃斡谛脑嗖〉牡诙笔�。目前，临床常用的药物治疗方法为化疗，然而，化疗时常会带来及其严重的副作用。因此，从天然资源中寻找和筛选抗肿瘤的活性成分，开发有效低毒的药物，已经引起医药工作者的广泛关注。但是，实践证实，天然药材，如中药材，其成分十分的复杂，为其中的活性成分筛选带来极大的挑战。有必要寻找一种快捷、有效的筛选方法。众所周知，药效的发生是通过与靶分子结合而引起的一系列生物效应，这种作用直接影响药物的分布、排泄、代谢、活性和毒副作用。将中药提取物与作用靶分子在一定条件下混合，与靶分子具有相互作用的活性成分与之发生可逆的结合，形成活性分子-靶分子复合物。研究显示，如果获得中药活性成分与多靶点作用前后的信息，就可以揭示出与靶分子结合的活性化合物。例如选择某活性酶作为靶分子，通过一定的手段测定该靶分子与中药提取物结合后其底物或产物的量是否发生变化，则可初步判断中药提取物有无活性。己糖激酶(hexokinase，HK)是催化己糖使之磷酸化的酶，在正常组织中表达量很少。它是糖酵解途径的第一个酶，也是糖酵解途径的限速酶。己糖激酶在肿瘤组织中表达的量及活性的增加，使得肿瘤组织在缺乏氧的情况下，仍能保证足够的能源，并且糖酵解的许多中间产物可以被瘤细胞所利用，以合成蛋白质、核酸及脂类等，从而为瘤细胞本身的生长和增生提供了必需的物质基础。研究发现肿瘤具有高糖代谢的特点肿瘤细胞中大约 60%的ATP来源于糖酵解途径。鉴于己糖激酶对于各种肿瘤细胞活动的重要意义，研究人员合理推测，若能寻找到有效的己糖激酶抑制剂，抑制该酶的活性，则抑制了肿瘤细胞的糖酵解，使肿瘤细胞不能获得足够的6-磷酸葡萄糖，ATP无法转换为ADP为细胞各种活动提供能量，继而导致肿瘤细胞发生调亡。
发明内容
本发明的目的是提供一种简便、快速且经济的中药材活性的体外筛选方法。具体涉及一种具己糖激酶抑制作用的中药活性成分的筛选方法。尤其是一种LC-MS法辅助的具己糖激酶抑制作用的活性提取物的筛选方法。本发明方法基于在糖酵解过程中，己糖激酶催化ATP转化为ADP的过程，将待筛选药物或组分加入该反应体系中，以LC-MS法对ATP和ADP进行定量测定，观察ATP和ADP 的变化情况以评价待筛选药物或组分是否具有己糖激酶抑制剂的活性，并对其活性进行测定。具体而言，本发明的一种具己糖激酶抑制作用的中药活性成分的筛选方法，其特征在于，以ATP为底物的己糖激酶催化反应，通过对ATP以及产物ADP的定量分析，筛选出中药材中具己糖激酶抑制作用的活性组分，其包括步骤，(1)建立高效液相-质谱联用方法(LC-MS)，通过在流动相中添加5mM的醋酸铵，实现对ATP以及产物ADP的检测及定量分析；本发明中，对于极性分子ATP的最低定量限为5 μ g/mL。本发明中，流动相需添加5mM的醋酸铵，以质谱为检测器，毛细管电压设置为 3000V，监测离子分别是 ATP :m/z 508，ADP :m/z 428。(2)基于LC-MS对ATP进行定量分析，测定以ATP作为底物的己糖激酶活性；(3)对筛选得到的具己糖激酶抑制剂活性的中药提取物MBZA进行测定及计算。本发明的一个实施例中，选择中药材木鳖子为筛选对象，以LC-MS为手段，测定 ATP作为底物的己糖激酶活性，对木鳖子四种提取物(MBZA，MBZB, MBZC和MBZD)进行己糖激酶抑制剂活性的筛�。凰龅闹幸┎哪颈钭右言擞迷诳怪琢龈捶街校├碇な灯渚哂猩⒔嵯祝ザ玖拼淖饔�。本发明基于在糖酵解过程中，己糖激酶催化ATP转化为ADP的反应，将ATP与中药提取物在一定条件下混合，以LC-MS方法为手段，分别测定反应前后(加入或不加入中药提取物)，ATP的变化量及生成ADP的量，用以评价中药提取物的己糖激酶抑制活性。在LC-MS 法的实施过程中，在流动相中加入5mM醋酸铵，极大地提高了 ATP的质谱信号及对ATP定量的稳定性。筛选结果显示，本发明的LC-MS法辅助的具己糖激酶抑制作用的活性提取物的筛选方法操作简单、自动化程度高、灵敏度高且筛选快速。本方法无需进行大批量的动物实验，相比细胞试验，本发明提取物用量少，生化试剂节省且筛选周期短，对于中药材中活性组分的筛选和研究有重要意义。本发明中经优化的LC-MS中各项实验参数对于利用质谱技术测定其它类似性质的生物分子具有很好的参考价值。本发明方法快速简便，经济有效，适合中药材中具己糖激酶活性抑制作用的活性组分的筛选。本发明方法可用于各种复杂基质中ATP的检测。
图1.典型ATP色谱图，其中，上分别为ATP及空白，下ADP及空白图2.己糖激酶米氏常数计算。图3.木鳖子提取物色谱分离图。图4.木鳖子提取物抑制己糖激酶典型色谱图，图中，从左到右为ATP、ADP ；各峰表示空白对照组，酶抑制组，酶促反应组。
具体实施例方式实施例1 木鳖子提取物中己糖激酶抑制活性组分的筛选1. LC-MS 法测定 ATP 和 ADP
色谱柱Agilent Extend C—18 (3· 1 X 100mm，3 μ m ;Agilent，Palo Alto, CA, USA)； 流动相5mM乙酸铵(pH7. 5)甲醇=6 4 ；流速0. 3mL/min ；柱温20°C ；进样量10 μ L离子源液相色谱-质谱联用接口 电喷雾接口(ESI)，正离子模式(positive ion)；干燥气流速:10mL/min ；干燥气温度300°C ；雾化气压力30psi (上限60psi)；毛细管电压:3000V ；质量分析器检测方式选择离子监测(SIM)；检测区间:0-1. 6min ；碎片电压100V ；监测离子ATP，准分子离子峰(m/z 508) ；ADP，准分子离子峰(m/z^8)专属性如图1所示，ATP保留时间为1.39分钟，ADP保留时间为1.40分钟，与空白色谱图对比可知，出峰位置无明显杂质干扰。结果显示，用本方法定量ATP，专属性良好。线性范围在5-60 μ g/mL范围内，以ATP峰面积Y对ATP的理论浓度X，以l/χ为权重系数作加权线性回归，得标准曲线方程为=Y = 3022. 6X+1902. 9(r = 0. 998)。灵敏度本方法对ATP的最低定量限(LLOQ)为5 μ g/mL(S/N彡10)，最低检测限 (LLOD)为1 μ g/mL(LLOD)。LLOQ的天内及天间精密度分别为3. 95%和11. 36%，准确度分别为 105. 37%和 101. 09%。精密度和准确度配制ATP低、中、高3个浓度质控样品(12，35，55 μ g/mL)各5份， 进样分析，并以当天标准曲线计算天内精密度及准确度。依法连续测定3天，计算天间精密度及准确度。结果显示(如表1所示)，本方法低、中、高浓度质控样品，天内及天间精密度均小于10%，准确度在100 士 5%之内。表1 :ATP质控样品的准确度和精密度
权利要求
1.一种具己糖激酶抑制作用的中药活性成分的筛选方法，其特征在于，以ATP为底物的己糖激酶催化反应，通过对ATP以及产物ADP的定量分析，筛选出中药材中具己糖激酶抑制作用的活性组分，其包括步骤(1)建立高效液相-质谱联用方法(LC-MS)，在流动相中添加5mM的醋酸铵，对ATP以及产物ADP检测及定量分析；(2)基于高效液相-质谱联用方法对ATP进行定量分析，测定以ATP作为底物的己糖激酶活性；(3)对筛选得到的具己糖激酶抑制剂活性的中药提取物进行测定及计算。
2.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中对极性分子ATP的最低定量限为 5 μ g/mL0
3.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，流动相添加5mM的醋酸铵， 以质谱为检测器，毛细管电压设置为3000V，监测离子分别是ATP :m/z 508, ADP :m/z 428。
4.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，对ATP以及产物ADP检测及定量分析色谱柱Agilent Extend C-18 (3· 1 X 100mm，3 μ m ;Agilent，Palo Alto, CA, USA)；流动相5mM 乙酸铵(pH7. 5)甲醇=6 4 ；流速0. 3mL/min ；柱温20°C ；进样量10 μ L ；离子源液相色谱-质谱联用接口 电喷雾接口(ESI)，正离子模式(positive ion)； 干燥气流速10mL/min ；干燥气温度300°C ；雾化气压力30psi (上限60psi)；毛细管电压:3000V ；质量分析器检测方式选择离子监测(SIM)；检测区间:0-1. 6min ；碎片电压 100V ；监测离子ATP，准分子离子峰(m/z 508) ；ADP，准分子离子峰(m/z^8)。
5.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，中药提取物为中药材木鳖子的四种提取物MBZA，MBZB, MBZC和MBZD。
6.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，对筛选得到的具己糖激酶抑制剂活性的中药提取物MBZA进行测定及计算。
全文摘要
本发明属药物分析领域，涉及中药材中活性成分的筛选方法，具体涉及一种具己糖激酶抑制作用的中药活性成分的筛选方法。本发明基于以ATP为底物的己糖激酶催化反应，通过对ATP以及产物ADP的定量分析，筛选出中药材中具己糖激酶抑制作用的活性组分。本发明方法快速简便，经济有效。相比细胞试验，本发明提取物用量少，生化试剂节省且筛选周期短，对于中药材中活性组分的筛选和研究有重要意义。本发明中经优化的LC-MS中各项实验参数对于利用质谱技术测定其它类似性质的生物分子具有较好参考价值。
文档编号G01N30/72GK102335221SQ201010238510
公开日2012年2月1日 申请日期2010年7月26日 优先权日2010年7月26日
发明者潘乐, 郁韵秋 申请人:复旦大学
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