专利名称：一种检测转抗虫基因玉米对非靶标生物是否安全的方法
技术领域：
本发明涉及一种检测转抗虫基因玉米对非靶标生物是否安全的方法。
背景技术：
传统化学杀虫剂的主要问题是对无害的其它昆虫、动物乃至人类也具有毒性。杀虫剂在杀灭靶标害虫的同时，也杀伤了非靶标昆虫，如次要害虫、中性昆虫、重要经济昆虫、 害虫的天敌以及其它非靶标生物，如土壤微生物等，从而破坏生态平衡。抗虫转基因作物的应用是替代杀虫剂的重要途径。抗虫转基因作物也可能存在潜在的负面效应，如害虫对抗虫基因产生抗性，及对非靶标生物产生影响等。对转基因植物潜在的安全性问题进行深入研究，开发新的技术以消除这种安全性隐患，或者对这种风险进行控制和管理，对于转基因技术的健康发展具有
重要意义。转基因作物对非目标生物的�：赡懿焕谏锏亩嘌�。与世界各国一样，我国也很重视对转基因生物对非靶标生物影响技术的研究。上世纪90年代初期，我国就开始了转基因生物的安全性研究。1997年农业部实施农业转基因生物安全性管理后，转基因技术的开发者们也加大了对转基因生物安全研究的投入。研究范围包括转基因生物的环境与食品安全性、GMO检测与技术，覆盖了从转基因生物安全性基本问题到具体GMO产品的安全性，从长期监测到近期急需解决的转基因生物安全性问题。 研究对象包括转基因动物、微生物及植物，以转基因作物为主。研究内容主要包括转基因性状的遗传稳定性、基因漂流、GMC风险管理策略以及种植GMC对食品、饲料及生态环境的影响等。叶蝉不仅仅是许多种作物的害虫，也是转基因玉米的非靶标害虫。叶蝉是植食性害虫，通过刺吸作物的汁液取食，所以能够直接接触转基因玉米中的杀虫蛋白质，也是捕食性节肢动物接触杀虫蛋白的主要来源之一。对转基因生物的安全测试，目前只能选择部分优势种类或经济重要性的种类如家蚕等，不可能用实验来证明转基因作物对所有非靶标生物的安全性。CrylAc基因是Bt基因的一种。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种检测转抗虫基因植物对具有刺吸式口器的昆虫是否安全的方法。本发明所提供的检测转抗虫基因植物对具有刺吸式口器的昆虫是否安全的方法， 包括如下步骤以具有刺吸式口器的昆虫为待测种群，分别检测种植转抗虫基因植物的田地中和种植非转基因亲本植物的田地中所述待测种群的种群消长动态，再将两种田地中所述待测种群的种群消长动态进行比较，若两种田地中所述待测种群的种群消长动态无显著差异，则确定所述转抗虫基因植物为候选的对所述待测种群安全的转抗虫基因植物，即确定所述转抗虫基因植物为候选的对所述具有刺吸式口器的昆虫安全的转抗虫基因植物；若两种田地中所述待测种群的种群消长动态有显著差异，则确定所述转抗虫基因植物为候选的对所述待测种群不安全的转抗虫基因植物，即确定所述转抗虫基因植物为候选的对所述具有刺吸式口器的昆虫不安全的转抗虫基因植物。上述检测方法中，所述种群消长动态为种群数量消长动态。上述检测方法中，所述植物为玉米。上述检测方法中，所述检测种群消长动态的方法包括如下步骤调查所述田地中的待测种群的个体数量，得出调查数据，根据调查数据，统计分析，得到所述田地中待测种群的种群消长动态；所述调查方法为如下1)和/或2)所示1)包括如下步骤捕获所述田地中的待测种群，再统计捕获的待测种群的个体数量；2)包括如下步骤目测观察所述玉米的叶片、茎杆、玉米穗和花丝上着落过的所述待测种群的个体数量。本发明的另一个目的是提供另一种检测转抗虫基因植物对具有刺吸式口器的昆虫是否安全的方法。本发明所提供的另一种检测转抗虫基因植物对具有刺吸式口器的昆虫是否安全的方法，包括如下步骤1)以具有刺吸式口器的昆虫为待测种群；2)分别检测种植转抗虫基因植物的田地中和种植非转基因亲本植物的田地中所述待测种群的种群消长动态，再将两种田地中所述待测种群的种群消长动态进行比较；3)分别检测种植所述转抗虫基因植物的田地中和种植非转基因亲本植物的田地中所述待测种群的群落多样性，再将两种田地中所述待测种群的群落多样性进行比较；4)若两种田地中所述待测种群的种群消长动态无显著差异，且两种田地中所述待测种群的群落多样性无显著差异，则确定所述转抗虫基因植物为候选的对所述待测种群安全的转抗虫基因植物，即确定所述转抗虫基因植物为候选的对所述具有刺吸式口器的昆虫安全的转抗虫基因植物；若两种田地中所述待测种群的种群消长动态有显著差异，且两种田地中所述待测种群的群落多样性有显著差异，则确定所述转抗虫基因植物为候选的对所述待测种群不安全的转抗虫基因植物，即确定所述转抗虫基因植物为候选的对所述具有刺吸式口器的昆虫不安全的转抗虫基因植物。上述另一种检测方法中，所述种群消长动态为种群数量消长动态；上述另一种检测方法中，所述待测种群的群落多样性用所述待测种群的多样性指数表示；上述另一种检测方法中，所述植物为玉米。上述另一种检测方法中，所述检测种群消长动态的方法包括如下步骤调查所述田地中的待测种群的个体数量，得出调查数据，根据调查数据，统计分析，得到所述田地中待测种群的种群消长动态；上述另一种检测方法中，所述调查方法为如下1)和/或2、所示1)包括如下步骤捕获所述田地中的待测种群，再统计捕获的待测种群的个体数量；2)包括如下步骤目测观察所述玉米的叶片、茎杆、玉米穗和花丝上着落过的所述待测种群的个体数量；上述另一种检测方法中，所述检测群落多样性的方法包括如下步骤调查所述田地中的待测种群的物种种类及每个物种种类的个体数量，得出调查数据，根据调查数据，统计分析，得到所述田地中待测种群的群落多样性；上述另一种检测方法中，所述调查方法为如下1)和/或2、所示1)包括如下步骤捕获所述田地中的待测种群，再统计捕获的待测种群的物种种类及每个物种种类的个体数量；2)包括如下步骤目测观察所述玉米的叶片、茎杆、玉米穗和花丝上着落过的所述待测种群的物种种类及每个物种种类的个体数量。上述任一种检测方法中，所述捕获所述田地中的待测种群的方法为如下I和/或 II所示a)包括如下步骤在每块所述田地的中心位置，放置捕获装置I，所述待测种群的昆虫被粘附到装置I中的洗涤剂水溶液中，从所述洗涤剂水溶液中分离所述待测种群的昆虫，得到所述待测种群的昆虫；所述捕获装置I由支撑杆I和设于其顶端的黄色盘子构成， 盘子内装有浓度为20% -30%的洗涤剂水溶液；b)包括如下步骤在每块所述田地中放置若干个捕获装置II，所述待测种群的昆虫被粘附到装置II中的虫胶上，将粘有所述昆虫的板冷冻，从中剥离所述昆虫，即得到所述待测种群的昆虫；所述捕获装置II由支撑杆II和设置于其顶端的黄色板构成，黄色板上涂有虫胶；上述任一种检测方法中，所述支撑杆I的高度和支撑杆II的高度均与所述田地中植物的高度满足如下条件所述支撑杆的高度占所述田地中植物高度的1/3-1/2 ；所述支撑杆的高度具体为1.2米。上述任一种检测方法中，所述具有刺吸式口器的昆虫为叶蝉科(Cicadellidae) 昆虫。上述任一种检测方法中，所述抗虫基因为Bt基因；和/或，所述Bt基因为CrylAc基因。本发明的最后一个目的是提供一种辅助检测转抗虫基因植物对非靶标生物是否安全的方法。本发明所提供的辅助检测转抗虫基因植物对非靶标生物是否安全的方法，包括如下步骤以非靶标生物中的具有刺吸式口器的昆虫作为待测种群，按照上述任一所述检测方法检测转抗虫基因植物对所述待测种群是否安全，若所述转抗虫基因植物对所述待测种群是安全的，则确定所述转抗虫基因植物为候选的对所述非靶标生物安全的转抗虫基因植物，若所述转抗虫基因植物对所述待测种群是不安全的，则确定所述转抗虫基因植物为候选的对所述非靶标生物不安全的转抗虫基因植物。在转基因玉米对非靶标生物影响的研究领域中，现有技术大都是以咀嚼式口器昆虫作为研究对象。但是刺吸式昆虫直接以植物汁液为食，直接接触杀虫蛋白，也可能被直接影响。本发明通过研究发现，种植转抗虫基因玉米的田地中，非靶标生物中刺吸式昆虫(如
6叶蝉科昆虫)是优势种群之一，通过检测种植转抗虫基因玉米对刺吸式昆虫(如叶蝉科昆虫，)的消长动态和多样性指数是否产生影响，便能确定种植转抗虫基因玉米对生态环境是否产生影响，即优势种群的消长和多样性不受影响的话，就说明转基因玉米对非靶标生物是安全的，证明转基因玉米对生态环境是安全的。本发明检测种植转抗虫基因玉米对非靶标生物是否安全的方法是可行的，且结果是可靠的，与咀嚼式口器昆虫相比，以叶蝉作为检验对象，可以直接反映转基因作物对直接接触杀虫蛋白的非靶标生物的影响，且叶蝉活动能力较弱，利于调查计数，对于转基因作物的影响可以做出快速和准确判断。近几年的实践研究证明，此方法是可行的，利用叶蝉作为研究结果是可靠的。只要有叶蝉发生，无论其是否是优势种群都可以将其作为研究对象来研究转基因作物对非靶标生物的安全。另外，本发明的捕获叶蝉科昆虫的方法操作简单、针对性强、捕获的数量多且易于统计，为研究其多样性提供了方便的条件。本发明弥补了转基因玉米对非靶标生物影响的研究领域中单独以咀嚼式口器昆虫为研究对象的不足，对完善转基因作物对非靶标生物的影响研究具有重要意义，对转基因植物的生物安全性的确定具有重要意义。
图1为转Bt基因玉米和对照田中叶蝉种群消长动态O009)。图2为转Bt基因玉米和对照田中叶蝉种群消长动态O010)。图3为转Bt基因玉米田与对照田多样性指数动态变化O009)。图4为转Bt基因玉米田与对照田多样性指数动态变化O010)。图5为转Bt基因玉米和对照田中龟纹瓢虫种群消长动态O009)。图6为转Bt基因玉米和对照田中龟纹瓢虫种群消长动态O010)。图7为转Bt基因玉米和对照田中蜘蛛种群消长动态O009)。图8为转Bt基因玉米和对照田中蜘蛛种群消长动态O010)。图9为转Bt基因玉米对异色瓢虫生长发育的影响。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。郑单58、先玉335、转CryIAc基因的郑单58均由国家玉米工程中心(或国家玉米工程技术研究中心)提供。下述实施例中使用的转基因玉米为将CrylAc基因转入郑单58中，得到的转基因玉米，该转基因玉米表达抗虫Bt蛋白，具有抗虫功能。对该转基因玉米来讲，靶标动物为玉米螟和棉铃虫，非靶标动物为靶标生物以外的生物。下述实施例中所使用的上述转基因玉米均标记为“转基因”。下述实施例中所使用的亲本玉米为郑单58，均标记为“亲本”。一般情况下，选择转基因品种的亲本作对照比较研究可以监测转基因品种对非靶标生物的影响。
下述实施例中所使用的常规杂交品种均标记为“先玉”。先玉是目前我国较大面积种植的常规杂交品种，所以选择其作为比较品种之一。实施例1、转Bt基因玉米对非靶标生物是否安全的检测2009年和2010年，在北京中国农业大学转基因作物试验基地使用叶蝉开展了转 CrylAc基因玉米对非靶标生物的影响研究。一、方法1、材料选择2009年(1)转基因玉米组(记作转基因)；(2)亲本对照组(记作亲本)。2010年(1)转基因玉米组(记作转基因)；(2)亲本对照组(记作亲本)；(3)常规杂交品种(记作先玉)。2、地点选择试验地点离其它玉米地500米以上，测试地块肥力条件基本一致。每块地大约 25 X 30米，分15个小区，每个品种5个重复。每个小区的面积定为45m2 (5mX 9m)，每个小区内种植15行，每行20株(株距为25cm，行距为60cm)。另夕卜，在营养钵中种植300 (60 X 5) 株，置于大田培养，用于补苗。3、区组设计方法随机区组设计。为了避免虫迁飞造成的影响和边际效应，设置宽5米的保护行或高1.5米的防护网。4、调查方法(1)直接调查法即目测法。为了避免虫迁飞造成的影响和边际效应，取样行为中间3行，每小区随机取25样株，五点取样法。样株挂牌标记，每次调查时记录天气和玉米生育状态(即生育期)。为了减少温度的影响，在试验中要严格地控制时间。每次调查时间为 8:00am 10:00am左右，不同调查人员的速度最好也要保持一致。观察和统计玉米植株上着落过的节肢动物数量和种类。调查植株的部位包括叶片、茎秆、玉米棒(即玉米穗)和穗子(即花丝)。依据叶蝉的行为和栖境来判定叶蝉种类，不管叶蝉的生育期。(2)陷阱调查法a)洗涤剂法在每个小区的中心位置，放置捕获装置I，放置3天，叶蝉被黄色塑料盘吸引掉进洗涤剂水溶液中淹死，从洗涤剂水溶液中分离出叶蝉科昆虫，被分离的叶蝉立即转移到带盖的玻璃管中，贮存到70%的酒精中，直至在解剖镜下被分类和鉴定和计数。捕获装置I由木杆(1. 2米长)和设于其顶端的黄色塑料盘子(34cmX^cm)构成， 盘子内装有20% -30%洗涤剂水溶液(即将洗涤剂溶于水中，洗涤剂在混合溶液中的体积浓度为20% -30% )。b)虫胶法在每个小区中每隔5米放置一个捕获装置II，放置3天，叶蝉科昆虫被粘附在虫胶上，将粘有叶蝉的粘板放入冰柜中冷冻，用针挑出叶蝉，被分离的叶蝉立即转移到带盖的玻璃管中，贮存到70%的酒精中，直至在解剖镜下被分类和鉴定和计数。所述捕获装置II由竹竿(1. 2米长)和设置于其顶端的黄色板(30cmXMcm)构成，黄色板上涂有虫胶。(3)调查时间
8
2009 年于 7. 18,7. 21,7. 24,7. 27,7. 30,8. 2,8. 5,8. 9,8. 13,8. 21,8. 28,9. 11、
9.沈，调查了 13次。第1-7次(7. 18-8. 5)使用的是直接调查法和洗涤剂法；第8_13次使用的是直接调查法和虫胶法。2010 年7. 23,7. 29,8. 5,9. 10,9. 25，调查了 5 次。第 1-3 次(7. 23-8. 5)使用的
是直接调查法和洗涤剂法；第4-5次(9. 10-9. 25)使用的是直接调查法和虫胶法。(4)根据以上调查得到的数据，统计种群内个体数量，进而统计种群数量消长动态；统计种群内物种种类及每个物种种类的个体数量，进而统计种群的群落多样性。5、数据分析方法及是否安全的判定方法(1)判断哪种非靶标动物是非靶标动物中的优势种群的方法一般认为数量较多、危害较重、在生态系统中地位重要的种群为优势种群。(2)通过比较种群数量消长分析转基因玉米对非靶标叶蝉种群数量的影响根据调查得到的数据，分别统计转基因玉米样区内不同调查时间点上的各种节肢动物的种群数量(即100株植株上同种群的个体数量)，分别统计亲本玉米样区内不同调查时间点上的各种节肢动物的种群数量，分别统计常规杂交种样区内不同调查时间点上的各种节肢动物的种群数量，从而统计每种植物样区内每种节肢动物的种群数量消长动态。(3)根据多样性指数，分析比较转抗虫基因玉米对非靶标生物群落稳定性的影响。根据调查得到的数据，分别统计转基因玉米样区内不同调查时间点上的各种节肢动物的种类数目(也即物种数，统计范围为100株植株)及每个种类的个体数目(即物种内的个体数，统计范围为100株植株)；对于亲本玉米样区、常规杂交种样区也按照相同的方法进行统计。根据物种数及物种的个体数，分别统计转基因玉米样区内各种节肢动物在不同时间点的多样性指数，对于亲本玉米样区、常规杂交种样区也按照相同的方法进行多样性指数统计。根据如下公式计算各个物种的生物多样性指数。
权利要求
1.一种检测转抗虫基因植物对具有刺吸式口器的昆虫是否安全的方法，包括如下步骤以具有刺吸式口器的昆虫为待测种群，分别检测种植转抗虫基因植物的田地中和种植非转基因亲本植物的田地中所述待测种群的种群消长动态，再将两种田地中所述待测种群的种群消长动态进行比较，若两种田地中所述待测种群的种群消长动态无显著差异，则确定所述转抗虫基因植物为候选的对所述待测种群安全的转抗虫基因植物，即确定所述转抗虫基因植物为候选的对所述具有刺吸式口器的昆虫安全的转抗虫基因植物；若两种田地中所述待测种群的种群消长动态有显著差异，则确定所述转抗虫基因植物为候选的对所述待测种群不安全的转抗虫基因植物，即确定所述转抗虫基因植物为候选的对所述具有刺吸式口器的昆虫不安全的转抗虫基因植物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述种群消长动态为种群数量消长动态； 所述植物为玉米。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述检测种群消长动态的方法包括如下步骤调查所述田地中的待测种群的个体数量，得出调查数据，根据调查数据，统计分析，得到所述田地中待测种群的种群消长动态；所述调查方法为如下1)和/或2、所示1)包括如下步骤捕获所述田地中的待测种群，再统计捕获的待测种群的个体数量；2)包括如下步骤目测观察所述玉米的叶片、茎杆、玉米穗和花丝上着落过的所述待测种群的个体数量。
4.一种检测转抗虫基因植物对具有刺吸式口器的昆虫是否安全的方法，包括如下步骤1)以具有刺吸式口器的昆虫为待测种群；2)分别检测种植转抗虫基因植物的田地中和种植非转基因亲本植物的田地中所述待测种群的种群消长动态，再将两种田地中所述待测种群的种群消长动态进行比较；3)分别检测种植所述转抗虫基因植物的田地中和种植非转基因亲本植物的田地中所述待测种群的群落多样性，再将两种田地中所述待测种群的群落多样性进行比较；4)若两种田地中所述待测种群的种群消长动态无显著差异，且两种田地中所述待测种群的群落多样性无显著差异，则确定所述转抗虫基因植物为候选的对所述待测种群安全的转抗虫基因植物，即确定所述转抗虫基因植物为候选的对所述具有刺吸式口器的昆虫安全的转抗虫基因植物。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述种群消长动态为种群数量消长动态；所述待测种群的群落多样性用所述待测种群的多样性指数表示； 所述植物为玉米。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于所述检测种群消长动态的方法包括如下步骤调查所述田地中的待测种群的个体数量，得出调查数据，根据调查数据，统计分析，得到所述田地中待测种群的种群消长动态； 所述调查方法为如下1)和/或2、所示1)包括如下步骤捕获所述田地中的待测种群，再统计捕获的待测种群的个体数量；2)包括如下步骤目测观察所述玉米的叶片、茎杆、玉米穗和花丝上着落过的所述待测种群的个体数量；所述检测群落多样性的方法包括如下步骤调查所述田地中的待测种群的物种种类及每个物种种类的个体数量，得出调查数据，根据调查数据，统计分析，得到所述田地中待测种群的群落多样性；所述调查方法为如下1)和/或2)所示1)包括如下步骤捕获所述田地中的待测种群，再统计捕获的待测种群的物种种类及每个物种种类的个体数量；2)包括如下步骤目测观察所述玉米的叶片、茎杆、玉米穗和花丝上着落过的所述待测种群的物种种类及每个物种种类的个体数量。
7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于所述捕获所述田地中的待测种群的方法为如下I和/或II所示a)包括如下步骤在每块所述田地的中心位置，放置捕获装置I，所述待测种群的昆虫被粘附到装置I中的洗涤剂水溶液中，从所述洗涤剂水溶液中分离所述待测种群的昆虫， 得到所述待测种群的昆虫；所述捕获装置I由支撑杆I和设于其顶端的黄色盘子构成，盘子内装有浓度为20% -30%的洗涤剂水溶液；b)包括如下步骤在每块所述田地中放置若干个捕获装置II，所述待测种群的昆虫被粘附到装置II中的虫胶上，将粘有所述昆虫的板冷冻，从中剥离所述昆虫，即得到所述待测种群的昆虫；所述捕获装置II由支撑杆II和设置于其顶端的黄色板构成，黄色板上涂有虫胶；和/或，所述支撑杆I的高度和支撑杆II的高度均与所述田地中植物的高度满足如下条件所述支撑杆的高度占所述田地中植物高度的1/3-1/2 ；所述支撑杆的高度具体为1. 2米。
8.根据权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于所述具有刺吸式口器的昆虫为叶蝉科(Cicadellidae)昆虫。
9.根据权利要求1-8中任一所述的方法，其特征在于所述抗虫基因为Bt基因；和/ 或，所述Bt基因为CrylAc基因。
10.一种辅助检测转抗虫基因植物对非靶标生物是否安全的方法，包括如下步骤以非靶标生物中的具有刺吸式口器的昆虫作为待测种群，按照权利要求1-9中任一所述方法检测转抗虫基因植物对所述待测种群是否安全，若所述转抗虫基因植物对所述待测种群是安全的，则确定所述转抗虫基因植物为候选的对所述非靶标生物安全的转抗虫基因植物， 若所述转抗虫基因植物对所述待测种群是不安全的，则确定所述转抗虫基因植物为候选的对所述非靶标生物不安全的转抗虫基因植物。
全文摘要
本发明公开了一种检测转抗虫基因玉米对非靶标生物是否安全的方法。本发明的检测转抗虫基因玉米对非靶标生物是否安全的方法包括如下步骤以非靶标生物中的具有刺吸式口器的昆虫作为待测种群，检测转抗虫基因植物对所述待测种群是否安全，若所述转抗虫基因植物对所述待测种群是安全的，则候选确定所述转抗虫基因植物对所述非靶标生物是安全的，若所述转抗虫基因植物对所述待测种群是不安全的，则候选确定所述转抗虫基因植物对所述非靶标生物是不安全。本发明弥补了转基因玉米对非靶标生物影响的研究领域中单独以咀嚼式口器昆虫为研究对象的不足，对完善转基因作物对非靶标生物的影响研究具有重要意义，对转基因植物的生物安全性的确定具有重要意义。
文档编号G01N33/48GK102156187SQ201010595170
公开日2011年8月17日 申请日期2010年12月10日 优先权日2010年12月10日
发明者石旺鹏, 董学会, 赵可, 郭艳艳 申请人:中国农业大学
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