专利名称：跨膜型和分泌型HIV Gag 抗原编码基因及包含其的艾滋病疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及跨膜型和分泌型HIV Gag抗原编码基因，包含其的艾滋病疫苗及免疫试剂盒。本发明的DNA疫苗能够诱导高水平的抗人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)的体液和细胞免疫应答。
背景技术：
尽管人类与艾滋病的斗争已经持续了20多年，但艾滋病仍然在全世界，尤其是发展中国家蔓延，对社会和经济产生了很大的负面影响。艾滋病是非洲的首要死因，也是全世界的第四大死因。WHO估计全世界每天会增加16000个新病例，未来10年将会有1亿人感染HIV(AIDS epidemic update.GenevaUNAIDS，December 2002.Http//www.unaids.org/epidemic_update/)。
虽然鸡尾酒疗法在发达国家取得了较好的效果，但其副作用很大，且价格昂贵，无法在发展中国家普及。控制艾滋病流行的最好策略仍然是研制出安全有效廉价的疫苗。
尽管在1981年第一例艾滋病报告以后的4年内，人们就成功地对其进行了组织培养(Barre-Sinoussi，F.et al.Science 220，868-871，1983；Popovic，M.et al.Science 224，497-500，1984)和全基因测序(Ratner，L.et al.Nature 313，277-284，1985)，但是20多年来，艾滋病疫苗的研究却是进展迟缓。这是因为人类免疫缺陷病毒(HIV)的一些不利于疫苗研制的特点，给疫苗研制提出了新的挑战。这些特点包括机体难以产生针对HIV的具有广泛交叉反应的有效中和抗体(Kwong，P.D.etal.Nature 393，648-659，1998；Parren，P.W.et al.AIDS 13，S137-S162，1999)；HIV可以在感染早期形成前病毒DNA而逃避免疫系统；HIV具有高变异性(Finzi，D.et al.Cell 93，665-671，1998；McCutchan，F.E.AIDS 14，S31-S44，2000)等。而且到目前为止，对HIV感染的免疫保护机理仍不是太清楚，也阻碍了对艾滋病疫苗的合理设计。
HIV虽然不在B细胞内进行复制，却可以通过病毒蛋白的毒性和细胞因子失调而使B细胞功能紊乱(Patke CL，et al.J Allergy ClinImmunol，105975-82，2000)，降低B细胞的数量，多克隆激活B细胞，增加非特异性免疫球蛋白G、A和M的产生，丧失特异性抗体反应功能(Shirai A，et al.J Clin Invest，89561-6，1992；Yarchoan R，et al.JClin Inv，78439-47，1986)。
尽管减毒活疫苗可以诱导高水平的细胞免疫和体液免疫应答，是过去最成功的疫苗形式，但减毒HIV疫苗安全性问题尚未解决，所以目前的研究主要集中在寻找其他形式的替代疫苗。病毒活载体疫苗和DNA疫苗都既可以诱导细胞免疫，又可以诱导体液免疫反应，成为近年来研究的焦点。而DNA疫苗由于具有更好的安全性、构建周期更短、生产更简单、成本更低、无载体免疫原性、储存更简单、无需冷链等诸多优点而更被人们看好(Lai WC，et al.Crit Rev Immunol，18449-84，1998)。
虽然DNA疫苗具备了优秀的潜质，但目前大多数DNA疫苗诱导免疫反应(尤其在人类和灵长类动物)的能力较低，限制了它发挥更大的作用。所以，对DNA疫苗进行优化，使其能够诱导足够强大的免疫反应，是尤为迫切的重要课题。
HIV-1 Gag是最保守的病毒蛋白之一。在HIV-1感染者身上检测到了识别Gag表位的广泛交叉反应性的CTL反应(Durali，D.et al.J.Virol.723547-3553，1998.McAdam，S.et al AIDS 12571-579，1998.)，而研制安全有效的疫苗也有赖于诱导出针对象Gag一样保守的HIV-1蛋白的CTL反应和/或T辅助细胞反应。所以针对性的优化表达Gag的疫苗就显得非常重要。本发明人从抗原基因修饰和免疫策略两个方面对HIVgag DNA疫苗进行了系统优化，通过在天然Gag N端融合信号肽，使Gag蛋白得以分泌表达；再以分泌型Gag为基�。谄銫端融合膜锚肽，使其以跨膜形式表达，经测试本发明取得了很好的结果。
发明内容
根据本发明的一个方面，本发明涉及一种经修饰的编码跨膜型HIV Gag抗原的基因，所述的基因由HIV gag基因和融合在其5’末端的信号肽编码序列以及融合在其3’末端的膜锚编码序列组成。在本发明的一个特别优选实施方案中，所述的修饰基因具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
根据本发明的另一个方面，本发明涉及一种经修饰的编码分泌型HIV Gag抗原的基因，所述的基因由HIV gag基因和在其5’末端融合的信号肽编码序列组成。在本发明的一个特别优选实施方案中，所述的修饰基因具有SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。
根据本发明的又一个方面，本发明涉及一种包含编码跨膜型HIVGag抗原的基因的DNA疫苗。在本发明这一方面的一个优选实施方案中，所述的DNA疫苗是质粒形式的pDRVISV1.0-gagtm，其于2003年9月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号CGMCC No.1002。
根据本发明的再一方面，本发明涉及包含编码分泌型HIV Gag抗原的基因的DNA疫苗。在本发明这一方面的一个优选实施方案中，所述的DNA疫苗是如图2所示的质粒形式的pDRVISV1.0-gags，其编码序列也可以从保藏号CGMCC No.1002的培养物中得到。
根据本发明的再一方面，本发明涉及包含本发明的编码跨膜型或分泌型HIV Gag抗原的基因的活病毒载体疫苗，所述的活病毒载体疫苗基于痘苗病毒、腺病毒或腺相关病毒。
根据本发明的再一方面，本发明还涉及一种免疫试剂盒，所述试剂盒包含多个容器和指示免疫程序的说明书，其中一个容器含有本发明的DNA疫苗，另一个容器含有编码Gag抗原的痘苗病毒疫苗。
图1示出分泌/跨膜基因修饰载体pBS-SK-Sig-TM的构建图。TM表示编码流感病毒血凝素膜锚序列的DNA片段，Sig表示编码免疫球蛋白信号肽的DNA片段。
图2示出DNA疫苗载体pDRVISV1.0的结构和DNA疫苗pDRVISV1.0-gagwt、pDRVISV1.0-gags和pDRVISV1.0-gagtm的构建示意图。其中，SV40 ELS表示SV40增强子序列，CMV E/P表示人巨细胞病毒立刻早期基因增强子/启动子，Exon1表示人巨细胞病毒立刻早期基因第1外显子，Intron1表示人巨细胞病毒立刻早期基因第1内含子，MCS表示供外源基因插入的多克隆位点，BGH Poly A表示牛生长激素基因的多聚腺苷酸添加信号，colE1表示质粒的colE1复制起始位点，Kan表示卡那霉素抗性基因。
图3示出实施例1制备的四种DNA疫苗的酶切确认分析结果，图中泳道1为pDRVISV1.0-gagtm(NdeI)；泳道2为pDRVISV1.0-gags(NdeI)；泳道5为pDRVISV1.0-gagwt(EcoRI)。
图4示出pDRVISV1.0-gagwt双酶切鉴定分析，其中泳道1分子量标记DL15000(购自大连宝生物工程有限公司)，泳道2pDRVISV1.0-gagwt(EcoRV+SalI)。
图5示出pDRVISV1.0-gags双酶切鉴定分析，其中泳道1分子量标记DL15000+DGL2000(购自大连宝生物工程有限公司)；泳道2pDRVISV1.0-gags(EcoRV+SalI)。
图6示出示出pDRVISV1.0-gagtm双酶切鉴定分析，其中泳道1分子量标记DL15000(购自大连宝生物工程有限公司)，泳道2pDRVISV1.0-gagtm(EcoRV+SalI)。
图7示出流式细胞仪检测跨膜型DNA疫苗抗原表达的结果。
图8示出pDRVISV1.0-gagwt、pDRVISV1.0-gags和pDRVISV1.0-gagtm所诱导的小鼠血清中Gag特异性IgG抗体水平。
图9示出痘苗病毒疫苗加强前后小鼠血清Gag特异性抗体滴度比较分析。
图10示出DNA疫苗免疫后小鼠脾淋巴细胞细胞因子分泌水平。
图11示出重组痘苗病毒加强免疫前后小鼠脾淋巴细胞细胞因子分泌水平。
图12示出流式细胞仪检测得到的本发明DNA疫苗免疫后分离小鼠脾脏T淋巴细胞，在体外经Gag表位肽刺激后，分泌IFN-γ的CD8+T淋巴细胞占脾脏总CD8+T淋巴细胞的比例。
具体实施例方式
为了更清楚地理解本发明，说明书中所使用的一些术语定义如下分泌型本发明所称的分泌型HIV Gag抗原蛋白及其编码基因是指该基因在天然HIV Gag抗原编码区的上游有一段信号肽编码序列，该信号肽序列可以引导Gag抗原分泌到胞外。
跨膜型本发明所称的跨膜型HIV Gag抗原蛋白及其编码基因是指该基因在天然Gag抗原编码区的上游有一段信号肽编码序列，在天然Gag抗原编码区的下游有一段膜锚编码序列，该信号肽序列和膜锚序列可以引导Gag抗原以跨膜蛋白的形式锚定于细胞膜表面。
DNA疫苗DNA疫苗又称DNA免疫、基因疫苗、核酸疫苗或裸露的DNA，是指把携带抗原基因的DNA分子导入体内，通过抗原基因体内表达产物诱导抗原特异性免疫反应的一类疫苗的总称。
膜锚序列主要由疏水性氨基酸组成的跨膜蛋白特有的特征性序列，该序列与细胞膜通过疏水性相互作用，把含有该序列的膜蛋白锚定于细胞膜上。
根据本发明的一个方面，本发明特别涉及一种编码跨膜型HIVGag抗原的基因，所述的基因由HIV gag基因和融合在其5’末端的信号肽编码序列以及融合在其3’末端的膜锚编码序列组成。
根据本发明的另一个方面，本发明特别涉及一种编码分泌型HIVGag抗原的基因，所述的基因由HIV gag基因和在其5’末端融合的信号肽编码序列组成。
根据本发明的另一个方面，本发明特别涉及一种包含本发明的编码跨膜型HIV Gag抗原的基因的DNA疫苗。
根据本发明的再一个方面，本发明特别涉及一种包含本发明的编码分泌型HIV Gag抗原的基因的DNA疫苗。
本发明的DNA疫苗中包含的gag基因可以是天然gag基因，但优选地是一种合成基因，其蛋白质产物的氨基酸序列与在中国很多地区流行的B’/C重组毒株CN54的Gag氨基酸序列一致，但是该gag基因序列根据哺乳动物遗传密码使用频率的偏爱性进行优化，并且在其起始密码子前引入优化的Cozak序列，使其在真核细胞内的翻译表达效率大大提高，所述合成gag基因序列可在保藏克隆CGMCCNo.1003中获得。
本发明DNA疫苗中包含的如上所述信号肽编码序列可以是本领域已知的任何合适的信号肽编码序列，包括例如但不限于免疫球蛋白基因家族、细胞因子基因家族、人组织相容性复合物基因家族、白细胞分化抗原基因家族和病毒膜蛋白基因的信号肽。优选地，所述信号肽编码序列是全长免疫球蛋白信号肽编码序列(氨基酸序列为MVLQTQVFISLLLWISGAYG(SEQ ID NO12)。
根据本发明，本发明DNA疫苗中包含的编码跨膜型Gag抗原的基因中的膜锚序列可以是本领域已知的任何合适的膜锚编码序列，包括例如但不限于流感病毒血凝素基因、免疫球蛋白基因家族、人组织相容性复合物基因家族、白细胞分化抗原基因家族和其它病毒膜蛋白基因的膜锚编码序列。优选地，所述膜锚编码序列是流感病毒血凝素蛋白的膜锚编码序列(氨基酸序列为ILWSFAISCFLLCVVLLGFIMWACQRGNIRCNICI(SEQ ID NO13))。
在本发明的一个特别优选实施方案中，本发明的编码跨膜型Gag抗原的基因由合成的gag基因和在其5’末端融合的免疫球蛋白信号肽编码序列以及在其3’末端融合的流感病毒血凝素膜锚编码序列组成，称为gagtm，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。
在本发明的另一个特别优选实施方案中，本发明的编码分泌型Gag抗原的基因由合成的gag基因和在其5’末端融合的免疫球蛋白信号肽编码序列组成，称为gags，其核苷酸序列如SEQ ID NO2所示。
本发明的DNA疫苗可以基于本领域已知的任何合适的DNA疫苗载体而构建。所述的载体包括但不限于pcDNA系列(Invitrogen)、pVAX系列(Invitrogen)优选地，所述载体为本发明人构建的pDRVISV1.0，其结构示意图如图2中所示。
根据本发明的一个特别优选的DNA疫苗为pDRVISV1.0-gagtm，其以在大肠埃希氏菌菌株Top10中的形式于2003年9月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.1002。经测试，其诱导细胞和体液免疫应答的能力较包含天然形式gag基因的DNA疫苗大大增强。另外，本发明的DNA疫苗pDRVISV1.0-gagtm免疫的小鼠的脾细胞经Gag P55抗原体外刺激后分泌γ-干扰素的水平也显著高于pDRVISV1.0-gagwt。如下文实施例中所证实的，在用痘苗病毒加强免疫后，DNA疫苗pDRVISV1.0-gagtm免疫的小鼠的脾脏CD8+T细胞中产生γ-干扰素的细胞的比例显著高于DNA疫苗pDRVISV1.0-gagwt所免疫的小鼠。pDRVISV1.0-gagtm所诱导的Gag特异的IgG滴度显著高于pDRVISV1.0-gagwt所诱导的Gag特异的IgG滴度。
根据本发明的另一个特别优选的DNA疫苗为pDRVISV1.0-gags，如图2所示。经测试，其诱导体液免疫应答的能力较包含天然形式gag基因gagwt的DNA疫苗大大增强，pDRVISV1.0-gags所诱导的Gag特异的IgG滴度显著高于pDRVISV1.0-gagwt所诱导的Gag特异的IgG滴度。
本发明的DNA疫苗可以配制成适于各种免疫接种方式的免疫组合物形式，包括适于比较传统的注射免疫(肌肉注射、皮内注射)、粘膜免疫(口服或鼻内接种)等的免疫组合物；以及适于比较新的接种方式有肌肉注射加瞬时电击、基因枪粒子轰击等的免疫组合物。
还应理解的是，本发明的分泌型或跨膜型HIV Gag抗原基因可以不仅包含在DNA疫苗中，它们也能够被应用于任何合适的活病毒载体疫苗，例如包括但不限于痘苗病毒、腺病毒或腺相关病毒中。这种应用方式属于本领域技术人员的技术范畴。
另外，如下文实施例所证实的，本发明的DNA疫苗可以与表达Gag抗原的重组痘苗病毒联合用于所谓的初始免疫—加强策略(prime-boost)中，即本发明的DNA疫苗用于初始免疫，之后用所述重组痘苗病毒进行加强，如此免疫后获得了更为优异的效果。因此，本发明还包括一种免疫试剂盒，其包含本发明的DNA疫苗和重组痘苗病毒，以及免疫程序说明书。
以下将参照实施例对本发明进行更详细的描述，应理解的是所述实施例仅仅是举例示出本发明，并非限制本发明。
实施例1编码野生型、分泌型和跨膜型Gag抗原的DNA疫苗pDRVISV1.0-gagwt、pDRVISV1.0-gags和pDRVISV1.0-gagtm的构建题述DNA疫苗的构建示意图如图2所示，以下详细阐明了构建步骤。
1、免疫球蛋白信号肽序列的获得设计合成一条全长负链引物和一条正向引物，延伸得到全长免疫球蛋白信号肽编码序列。所述全长负链引物为synIgSigPep，其序列为5’-ACGTGATATCATGGAATTCCATATGCTCCGGAGATCCACAGCAGGAGGCTGATGAACACCTGGGTCTGGAGCACCATGGTGGCGGCGTCGACGCGTAC-3’(第一处下划线表示限制性内切酶EcoRV识别位点，第二处下划线表示限制性内切酶NdeI识别位点)(SEQ IDNO4)；所述正向引物为Ig-sigpep5，其序列为5’-GTACGCGTCGACGCCGCCACCATG-3’(下划线处表示限制性内切酶SalI识别位点)(SEQ ID NO5)。
PCR反应采用大连宝生物工程有限公司的试剂盒，反应体系如下synIgSigPep(50μM) 10μlIg-sigpep5 (50μM) 10μl10×Pyrobest缓冲液 5μldNTP混合物(各2.5mM) 5μlPyrobest DNA聚合酶(5U/ml) 0.5μlddH2O 19.5μlPCR反应条件94℃预变性2min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，共10个循环；72℃7min；4℃。
延伸产物用Omega公司的E.Z.N.A Cycle-Pure Kit进行纯化回收，回收产物用Takara公司EcoR V+SalI共酶切。用Omega公司E.Z.N.A.Gel Extraction Kit进行电泳纯化回收，-20℃保存待用。
2、流感病毒血凝素膜锚编码序列的获得从质粒pcDNA3-VP7TM(刘勇等，白求恩医科大学学报，26(4)440-4，2000)通过PCR获取流感病毒血凝素蛋白的膜锚编码序列。PCR所用引物如下正向引物HATM55’-CGGGATCCgccatcctgtggatatccttcgc-3’(下划线表示限制性内切酶BamHI识别位点)(SEQ ID NO6)反向引物HATM3；5’-gctctagaAtcagatgcagatattacagcggatg-3’(下划线表示限制性内切酶XbaI识别位点)(SEQ ID NO7)PCR反应体系10×Pyrobest缓冲液 5μldNTP混合物(各2.5mM) 5μlHATM5(50μM) 0.5μlHATM3(50μM) 0.5μlpcDNA3-VP7TM 0.5μlPyrobest DNA聚合酶(5U/ml)0.5μlddH2O38μlPCR反应条件94℃预变性2min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，共4个循环；94℃30s，68℃30s，共35个循环；72℃7min；4℃。
延伸产物用Omega公司的E.Z.N.A Cycle-Pure Kit进行纯化回收，回收产物用Takara公司XbaI+BamHI共酶切。用Omega公司E.Z.N.A.Gel Extraction Kit进行电泳纯化回收，-20℃保存待用。
3、分泌/跨膜基因修饰载体pBS-SK-Sig-TM的构建将上述1和2节获得的免疫球蛋白信号肽编码序列和流感病毒血凝素膜锚编码序列分别以SalI-EcoRV和BamHI-XbaI片段的形式插入克隆载体pBluescript-SK(Stratagene公司产品)的相应酶切位点，得到分泌/跨膜基因修饰载体pBS-SK-Sig-TM(图1)。
4、gag基因的克隆和修饰以HIV-1 B’/C重组亚型中国流行毒株的全基因合成克隆pCRScript-gpnef(CGMCC保藏克隆No.1003)为模板，从中直接扩增gag基因。pCRScript-gpnef由本发明人与德国雷根斯堡大学微生物研究所共同构建，其遗传密码根据哺乳动物的偏爱密码进行了优化。PCR扩增所用引物为gagwt5SalI5’-ACGCGTCGACGCCGCCACCATGGCCGCCAGGGCCAGCATC-3’(SEQ ID NO8)(下划线为限制性内切酶SalI识别位点)gag5-Igsigpep5’-GGAATTCCATATGGAGCCGCCAGGGCCAGCATCCTG-3’(SEQ ID NO9)(下划线为限制性内切酶NdeI识别位点)gags3 EcoRV5’-ACGTGATATCTCACTGGCTGCTGGGGTCGTTGCC-3’(SEQ ID NO10)(下划线为限制性内切酶EcoRV识别位点)gagtm3BamHI5’-CGGGATCCCTGGCTGCTGGGGTCGTTGCC-3’(SEQ IDNO11)(下划线为限制性内切酶BamHI识别位点)5、野生型Gag蛋白编码基因gagwt的PCR扩增以pCRScript-gpnef为模板，上述gagwt5SalI和gags3EcoRV为引物PCR扩增野生型Gag蛋白编码基因gagwt。用Omega公司的E.Z.N.A Cycle-Pure Kit进行纯化回收，EcoRV和SalI进行共酶切，酶切产物用OMEGA公司E.Z.N.A.GEL EXTRACTION KIT进行电泳纯化回收，-20℃保存待用。
6、跨膜型Gag的编码基因gagtm的构建以pCRScript-gpnef为模板，上述gag5-Igsigpep和gagtm3BamHI为引物PCR扩增gag-NdeI-BamHI。
PCR反应体系10×Pyrobest缓冲液5μldNTP混合物(各2.5mM) 5μlgag5-Igsigpep(50μM) 0.5μlgagtm3BamHI(50μM)0.5μlpCRScript-gpnef 0.5μlPyrobest DNA聚合酶(5U/ml) 0.5μlddH2O 38μlPCR反应条件94℃预变性5min；94℃30s，60℃30s，72℃2min，共4个循环；94℃30s，68℃2min，共35个循环；72℃7min；4℃。
PCR扩增所得目的片段gag-NdeI-BamHI，用Omega公司的E.Z.N.A Cycle-Pure Kit进行纯化回收，BamHI和NdeI进行共酶切。酶切产物用OMEGA公司E.Z.N.A.GEL EXTRACTION KIT进行电泳纯化回收，-20℃保存待用。
用BamHI+NdeI酶切质粒pBS-SK-Sig-TM，回收以后与上述酶切回收产物gag-NdeI-BamHI连接，转化大肠杆菌Top10(Invitrogen公司)，涂布于含氨苄青霉素的LB平板筛选获得阳性克�。孟拗菩阅谇忻窷deI+NotI酶切分析鉴定。该阳性克隆命名为pBS-SK-Sig-TM-gag-NdeI-BamHI。XbaI+SalI酶切质粒pBS-SK-Sig-TM-gag-NdeI-BamHI，回收小片段得到gagtm基因，-20℃保存待用。
7、分泌型Gag的编码基因gags的构建以pCRScript-gpnef为模板，以上述gag5-Igsigpep和gags3EcoRV为引物扩增得到gag-NdeI-EcoRV。
PCR反应体系10×Pyrobest缓冲液 5μldNTP混合物(各2.5mM) 5μlgag5-Igsigpep(50μM)0.5μlgags3EcoRV(50μM) 0.5μlpCRScript-gpnef 0.5μlPyrobest DNA聚合酶(5U/ml) 0.5μlddH2O 38μlPCR反应条件94℃预变性5min；94℃30s，60℃30s，72℃2min，共4个循环；94℃30s，68℃2min，共35个循环；72℃7min；4℃。
扩增产物用Omega公司的E.Z.N.A Cycle-Pure K进行纯化回收，-20℃保存待用。
分别用NdeI单酶切gag-NdeI-EcoRV和pBS-SK-Sig-TM，经E.Z.N.A Cycle-Pure Kit进行纯化回收。将回收产物gag-NdeI-EcoRV和pBS-SK-Sig-TM用T4 DNA连接酶(New England Biolabs公司)连接过夜。之后以Ig-sigpep5和gags3EcoRV为引物，以连接产物为模板PCR扩增得到gags基因。用OMEGA公司E.Z.N.A.GELEXTRACTION KIT进行电泳纯化回收扩增产物后，用EcoRV+SalI酶切，纯化回收后-20℃保存待用。
8、DNA疫苗质粒pDRVISV1.0-gagwt、pDRVISV1.0-gags和pDRVISV1.0-gagtm的获得对真核表达质粒载体pDRVISV1.0做如下酶切pDRVISV1.0 EcoRV+SalI
pDRVISV1.0 XbaI+SalI电泳纯化回收酶切产物，-20℃保存待用。
用New England Biolabs公司的T4 DNA连接酶对上面得到的酶切片段做如下连接pDRVISV1.0+gagwtpDRVISV1.0+gagspDRVISV1.0+gagtm连接产物分别转化感受态大肠杆菌Top10，涂含氨苄青霉素的LB平板，37℃培养12-16小时。提取质粒，用相应限制性内切酶酶切分析鉴定，阳性克隆分别命名为pDRVISV1.0-gagwt，pDRVISV1.0-gagtm，pDRVISV1.0-gags，酶切鉴定结果分别参见图3至图6。测序证实所述DNA疫苗相应含有基因gagwt、gagtm或gags，没有引入突变。这三个基因的序列分别如SEQ ID NO1(gagtm基因)、SEQ ID NO2(gags基因)和SEQ ID NO3(gagwt基因)所示。
实施例2 DNA疫苗pDRVISV1.0-gagwt、pDRVISV1.0-gags和pDRVISV1.0-gagtm在哺乳动物细胞中表达Gag抗原的检测1、在293T细胞中的瞬时表达和检测所用方法参见分子克隆实验手册第2版所述，具体地，用所述四种DNA疫苗质粒转染(转染试剂为Invitrogen公司的Lipofectamine2000，转染方法参照试剂盒说明书)哺乳动物细胞293T(美国典型培养物中心，ATCC)，48小时后收获细胞和上清，用抗Gag蛋白的鼠源单抗AG3.0(美国国立卫生研究院艾滋病研究和参比试剂项目提供)进行Western Blot分析，在P55的分子量处出现了特异的反应条带，说明所构建的DNA疫苗质粒都可以在哺乳动物细胞内正确的表达目的基因。另外，pDRVISV1.0-gagtm在细胞沉淀检测到了大量的目的蛋白，而在上清中没有检测到；而pDRVISV1.0-gags只在上清中检测到了目的蛋白，在细胞沉淀中没有检测到，说明对它们进行的分泌修饰是成功的。
2、跨膜表达形式质粒pDRVISV1.0-gagtm在Hela细胞中的瞬时表达、细胞表面Gag特异性染色和流式细胞仪检测为了进一步验证跨膜表达方式的DNA疫苗质粒在哺乳动物细胞中表达的正确性，我们将DNA疫苗质粒瞬时转染Hela细胞，48小时后进行细胞表面Gag特异性荧光染色，并用流式细胞仪进行了检测，结果没有转染质粒的细胞检测阳性率基本为0，而转染了跨膜表达方式DNA疫苗质粒的细胞阳性率为15.6％，说明跨膜表达方式DNA疫苗质粒也在哺乳动物细胞中得到了正确表达。如图7所示。实施例3动物免疫检测DNA疫苗及DNA疫苗初始免疫与重组痘苗病毒加强免疫的效力本例中使用无菌饲养的6-8周龄BALB/c(H-2d)雌性小鼠(体重19-25克，购自中国药品生物制品检定所)检测本发明DNA疫苗的效力。实施例1制备的各DNA疫苗用1×PBS制备成1mg/ml的注射液。每种免疫组含10只小鼠。免疫前24小时每只小鼠左右后肢胫骨前肌各注射50ul 25％(w/v)蔗糖高渗溶液以增加肌肉细胞的通透性，提高摄取质粒效率，同时，蔗糖还有一定的佐剂的作用。蔗糖处理24小时后，胫骨前肌注射DNA 100ug/只(每后肢50ug)。每间隔2周以同样剂量加强免疫3次。第8周时每组取5只鼠，取血清及脾淋巴细胞检测抗体以及细胞因子。每组剩下的5只小鼠用表达Gag的重组痘苗病毒rVV-RL42gag(刘锦彦等，病毒学报，18(1)9-14，2002)加强，107pfu/鼠。在第12周时取血清及脾淋巴细胞检测抗体以及细胞因子。对照使用pDRVISV1.0空载体、不插入目的基因的痘苗病毒天坛株(天花疫苗，由北京生物制品所惠赠)以及空白鼠对照。
相关实验及结果如下1、血清Gag特异性抗体IgG水平的检测为检测不同DNA疫苗单独免疫及重组痘苗病毒加强免疫所诱导的特异性体液免疫水平，在第四次DNA加强免疫后两周及重组痘苗病毒加强免取小鼠血清，用Gag P55抗原(美国国立卫生研究院艾滋病研究和参比试剂项目惠赠)包被酶标板，间接ELISA法进行Gag特异性IgG抗体水平的检测。各免疫组Gag特异性IgG抗体滴度列于表1。
表1各免疫组Gag特异性IgG抗体滴度
*表中数值均为几何均值在上述pDRVISV1.0-gagwt、pDRVISV1.0-gags和pDRVISV1.0-gagtm的比较分析中，这三种DNA疫苗所诱导的IgG的抗体滴度从高至低依次为pDRVISV1.0-gags，pDRVISV1.0-gagtm和pDRVISV1.0-gagwt，其中pDRVISV1.0-gags所诱导的IgG的抗体滴度约为后两者的3-4倍(P＜0.05)，说明Gag蛋白分泌表达使其诱导体液免疫应答的能力大大增强，跨膜表达形式也增强了体液免疫应答，但增强幅度较分泌表达形式小，详见图8。
为了确定痘苗加强对不同DNA疫苗的体液免疫应答所产生的影响，检测了免疫小鼠血清总IgG抗体水平。在痘苗加强免疫后4周取小鼠血清，用Gag P55抗原(美国国立卫生研究院艾滋病研究和参比试剂项目惠赠)包被酶标板，间接ELISA法进行检测。实验结果表明痘苗加强后对所有的DNA疫苗的体液免疫应答都有明显的增强作用，尤以跨膜型表达方式最为显著，抗体滴度大约增强了5倍，如图9所示。
2、血清Gag特异性IgG1、IgG2a亚类抗体水平的检测为了确定所诱发的免疫应答的类型，检测了免疫小鼠血清中的Gag特异性IgG1和IgG2a亚类抗体的水平。在第四次DNA加强免疫后两周及重组痘苗病毒加强后两周取小鼠血清，用Gag P55抗原(美国国立卫生研究院艾滋病研究和参比试剂项目惠赠)包被酶标板，间接ELISA法进行Gag特异性IgG1和IgG2a抗体水平的检测。
在pDRVISV1.0-gagwt、pDRVISV1.0-gags和pDRVISV1.0-gagtm的比较分析中，分泌型表达方式(pDRVISV1.0-gags)诱导产生的IgG1、IgG2a水平相当，IgG1稍高于IgG2a，说明分泌表达诱导的Th1型细胞免疫应答和Th2型体液免疫应答水平大体相当；跨膜表达方式(pDRVISV1.0-gagtm)诱导产生的IgG2a远高于IgG1，IgG2a约为IgG1的4倍，说明跨膜表达方式诱导的免疫应答明显倾向于Th1型细胞免疫应答；未加修饰的Gag基因形成假病毒颗粒，诱导的IgG2a高于IgG1，IgG2a约为IgG1的2倍，说明其诱导的免疫应答倾向于Th1型细胞免疫应答，但不如跨膜表达方式的倾向性强，见表2。
表2pDRVISV1.0-gags、pDRVISV1.0-gags和pDRVISV1.0-gags血清Gag特异性IgG亚类抗体水平及比值pDRVISV1.0-gagspDRVISV1.0-gagtmpDRVISV1.0-gagwtIgG1 1∶111430.5 1∶9189.6 1∶13928.8IgG2a 1∶97005.81∶42224.3 1∶21112.1IgG2a/IgG10.8 4.61.5另外，重组痘苗病毒加强免疫对分泌表达方式DNA疫苗的免疫应答类型有较明显的影响，IgG2a/IgG1由大约为1变为大约为2，既由Th1型细胞免疫应答和Th2型体液免疫应答大体相当，转变为倾向于Th1型细胞免疫应答，除此之外，对其它DNA疫苗的IgG2a和IgG1的比值，即免疫应答类型没有明显的影响，见表3。
表3重组痘苗加强后血清Gag特异性IgG亚类抗体水平及比值pDRVISV1.0-pDRVISV1.0-gagtmpDRVISV1.0-gagwt/RVV /RVV/RVVIgG1 1∶84448.51∶55715.2 1∶32000IgG2a 1∶168897 1∶222860.9 1∶64000IgG2a/IgG12(0.8)4(4.6) 2(1.7)注表3括号内数据表示痘苗病毒加强免疫之前的数据3、细胞因子的检测为了确定所诱发的免疫应答的类型，还对免疫小鼠脾淋巴细胞所分泌产生的细胞因子IFN-γ和IL-4进行了检测。在第四次DNA加强免疫后两周取小鼠脾淋巴细胞，用Gag P55抗原(美国国立卫生研究院艾滋病研究和参比试剂项目惠赠)(10μg/ml)刺激脾淋巴细胞，72小时后取细胞培养上清，用ELISA试剂盒检测细胞因子分泌水平。
IL-4均低于检测水平(10pg/ml)，对IFN-γ的检测结果进行分析表明DNA疫苗中，HIV gag基因不同表达方式诱导Th1型细胞因子的能力有很大的差异，跨膜表达方式(pDRVISV1.0-gagtm)诱导了最高水平的IFN-γ(518.9pg/ml)，野生型基因(pDRVISV1.0-gagwt)稍弱(375.6pg/ml)，分泌表达方式(pDRVISV1.0-gags)最弱(98.9pg/ml)，与预期结果一致(两两比较均有显著性差异，P＜0.05)，如图10所示。
在重组痘苗病毒加强免疫组中，IL-4仍然低于试剂盒检测水平(10pg/ml)，对IFN-γ的检测结果进行分析表明痘苗疫苗对DNA疫苗Th1型细胞免疫应答都有明显的增强作用，但各组DNA疫苗间强度的比较没有明显的改变。分泌水平分别为pDRVISV1.0-gags(663.5pg/ml)；pDRVISV1.0-gagtm(1358.4pg/ml)；pDRVISV1.0-gagwt(1022.8pg/ml)，见图11所示。
4、流式细胞仪检测体外抗原表位肽刺激后分泌IFN-γ的CD8+T淋巴细胞CD8+T淋巴细胞是一种最重要的抗病毒效应细胞，所以检测了加强免疫后脾淋巴细胞中分泌IFN-γ的HIV-1 Gag特异性CD8+T淋巴细胞。脾淋巴细胞用MHC-I限制性HIV P55表位多肽(AMQILKDTI，由北京赛百盛公司合成)刺激12小时后，对细胞内IFN-γ和CD8，CD3分子进行染色，流式细胞仪(贝克曼·库尔特公司产品)进行分析。在用重组痘苗病毒加强免疫后，各组均检测到了分泌IFN-γ的HIV-1 Gag特异性CD8+T淋巴细胞。在pDRVISV1.0-gagwt、pDRVISV1.0-gags和pDRVISV1.0-gagtm的比较分析中，pDRVISV1.0-gagtm初免组小鼠检测到了最高水平的Gag特异性CD8+T淋巴细胞，pDRVISV1.0-gagwt初免组次之，而pDRVISV1.0-gags初免组最低，说明跨膜表达形式诱导了最强的CTL反应，而分泌表达方式诱导的CTL反应最弱，如图12所示。
序列表<110>中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心<120>分泌型和跨膜型HIV Gag抗原编码基因及包含其的艾滋病疫苗<130>I20031333CB<160>13<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1670<212>DNA<213>人工序列<400>1atggtgctgc agacccaggt gttcatcagc ctcctgctgt ggatctccgg agcatatgga 60gccgccaggg ccagcatcct gaggggcggc aagctggaca agtgggagaa gatcaggctg 120aggcccggcg gcaagaagca ctacatgctg aagcacctgg tgtgggccag cagggagctg 180gagaggttcg ccctgaaccc cggcctgctg gagaccagcg agggctgcaa gcagatcatg 240aagcagctgc agagcgccct gcagaccggc accgaggagc tgaggagcct gttcaacacc 300gtggccaccc cctactgcgt gcacaccgag atcgacgtga gggacaccag ggaggccctg 360gacaagatcg aggaggagca gaacaagatc cagcagaaga cccagcaggc caaggaggcc 420gacggcaagg tgagccagaa ctaccccatc gtgcagaacc tgcagggcca gatggtgcac 480cagcccatca gccccaggac cctgaatgca tgggtgaagg tggtggagga gaaggccttc 540agccccgagg tgatccccat gttcagcgcc ctgagcgagg gcgccacccc tcaggacctg 600aacaccatgc tgaacaccgt gggcggccac caggccgcca tgcagatcct gaaggacacc 660atcaacgagg aggccgccga gtgggacagg ctgcaccccg tgcacgccgg ccccatcgcc 720cccggccaga tgagggagcc caggggcagc gacatcgccg gcaccaccag caacctgcag 780gagcagatcg cctggatgac cagcaaccca cccgtgcccg tgggcgacat ctacaagagg 840tggatcatcc tgggtttaaa caagatcgtg aggatgtaca gccccaccag catcctggac 900atcaagcagg gccccaagga gcccttcagg gactacgtgg acaggttctt caagaccctg 960agggccgagc aggccaccca gggcgtgaag aactggatga ccgacaccct gctggtgcag 1020aacgccaacc ccgactgcaa gaccatcctg agggccctgg gccccggcgc cagcatcgag 1080gagatgatga ccgcctgcca gggcgtgggc ggccccagcc acaaggccaa ggtgctggcc 1140gaggccatga gccagaccaa cagcgccatc ctgatgcaga ggagcaactt caagggcagc 1200aagaggatcg tgaagtgctt caactgcggc aaggagggcc acatcgccag gaatctcagg 1260gcccccagga agaagggctg ctggaagtgc ggcaaggagg gccaccagat gaaggactgc 1320
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ggaattccat atggagccgc cagggccagc atcctg 36<210>10<211>34<212>DNA<213>人工序列<400>10acgtgatatc tcactggctg ctggggtcgt tgcc34<210>11<211>29<212>DNA<213>人工序列<400>11cgggatccct ggctgctggg gtcgttgcc 29<210>12<211>20<212>PRT<213>Homo sapiens<400>12Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser1 5 10 15Gly Ala Tyr Gly20<210>13<211>35<212>PRT<213>流感病毒<400>13Ile Leu Trp Ser Phe Ala Ile Ser Cys Phe Leu Leu Cys Val Val Leu1 5 10 15Leu Gly Phe Ile Met Trp Ala Cys Gln Arg Gly Asn Ile Arg Cys Asn20 25 30Ile Cys Ile3权利要求
1.一种编码跨膜型HIV Gag抗原的基因，所述基因由gag基因和融合在其5’末端的信号肽编码序列和融合在其3’末端的膜锚编码序列组成。
2.如权利要求1所述的基因，其中所述的膜锚编码序列选自流感病毒血凝素基因、免疫球蛋白基因家族、人组织相容性复合物基因家族、白细胞分化抗原基因家族和其它病毒膜蛋白基因。
3.如权利要求1所述的基因，其中所述的信号肽编码序列选自免疫球蛋白基因家族、细胞因子基因家族、人组织相容性复合物基因家族、白细胞分化抗原基因家族和病毒膜蛋白基因。
4.如权利要求1所述的基因，其为具有如SEQ ID NO1所示核苷酸序列的基因gagtm。
5.一种艾滋病DNA疫苗，其包含权利要求1-4任一项所述的基因。
6.如权利要求5所述的艾滋病DNA疫苗，其为质粒形式的pDRVISV1.0-gagtm，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号CGMCC No.1002。
7.一种活病毒载体疫苗，其包含权利要求1-4任一项的基因。
8.权利要求7的活病毒载体疫苗，其基于腺病毒、痘苗病毒或腺相关病毒。
9.一种艾滋病疫苗配制品，其包含权利要求5或6的DNA疫苗或权利要求7或8的活病毒载体疫苗和合适的佐剂或载体。
10.一种艾滋病免疫试剂盒，所述试剂盒包含多个容器和指示免疫程序的说明书，其中一个容器含有权利要求5或6的DNA疫苗，另一个容器含有编码Gag抗原的重组痘苗病毒。
11.一种编码分泌型HIV Gag抗原的基因，所述基因由gag基因和融合在其5’末端的信号肽编码序列组成。
12.如权利要求11所述的基因，其中所述的信号肽编码序列选自免疫球蛋白基因家族、细胞因子基因家族、人组织相容性复合物基因家族、白细胞分化抗原基因家族和病毒膜蛋白基因。
13.如权利要求11所述的基因，其为具有如SEQ ID NO2所示核苷酸序列的基因gags。
14.一种艾滋病DNA疫苗，其包含权利要求11-13任一项所述的基因。
15.如权利要求14所述的艾滋病DNA疫苗，其为如图2所示的质粒形式的pDRVISV1.0-gags，其包含权利要求13所述的基因。
16.一种活病毒载体疫苗，其包含权利要求11-13任一项的基因。
17.权利要求16的活病毒载体疫苗，其基于腺病毒、痘苗病毒或腺相关病毒。
18.一种艾滋病疫苗配制品，其包含权利要求14或15的DNA疫苗或权利要求16或17的活病毒载体疫苗和合适的佐剂或载体。
19.一种艾滋病免疫试剂盒，所述试剂盒包含多个容器和指示免疫程序的说明书，其中一个容器含有权利要求14或15的DNA疫苗，另一个容器含有编码Gag抗原的重组痘苗病毒。
全文摘要
本发明涉及跨膜型和分泌型HIV Gag抗原编码基因，包含其的艾滋病疫苗及免疫试剂盒。本发明的DNA疫苗能够诱导高水平的抗人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)的体液和细胞免疫应答。
文档编号G01N33/569GK1597956SQ03158538
公开日2005年3月23日 申请日期2003年9月18日 优先权日2003年9月18日
发明者邵一鸣, 李海山, 刘勇 申请人:中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心
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