专利名称：基于荧光图像的抗肿瘤转移药物的筛选方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于抗肿瘤药物筛选与评价方法领域，涉及应用荧光探针特异性标记细 胞、细胞显微图像自动获取、荧光图像识别及数据生成，通过分析图像信息来获取药物抑制 肿瘤细胞迁移的相关指标并用于药物(化学合成药物和天然产物)抗肿瘤细胞迁移作用的 筛选和评价，对于新的抗肿瘤转移药物的发现具有重要意义。
背景技术：
肿瘤已成为人类面临的一大杀手，死亡率仅次于心血管疾�。页手鹉晟仙� 趋势。目前肿瘤治疗主要以抑制肿瘤细胞的增值为靶点，但有相当一部分肿瘤细胞对于这 种类型的化疗药物并不敏感，并且这些活性化合物多数是作用于核酸的合成和功能，对正 常组织有较大损伤，易出现恶心，呕吐等副作用。侵袭和转移是肿瘤最基本的生物学特征， 也是引起肿瘤患者死亡的主要原因，因肿瘤死亡的患者中约有90%是肿瘤转移引起的。肿 瘤细胞的定向迁移是肿瘤转移过程中的关键步骤。因此，寻找有效的抗肿瘤细胞迁移活性 物质对于发现新的抗肿瘤药物至关重要。近年来，基于荧光染色技术的检测分析方法是应用于药物高通量、高内涵筛选的 重要方法之一。荧光显微系统的应用解决了普通显微镜对细胞、细胞器的形态和活力方面 相对微弱的改变难以观察的问题，被应用于药物研究的多个方面，如药物细胞毒测定和药 物相互作用研究等。但目前基于荧光成像技术，以肿瘤细胞迁移，侵袭为靶点的抗肿瘤转移 药物高通量筛选还未见报道。目前，体外测定药物抗肿瘤细胞迁移能力常用的方法有两种一种是划痕法，另 一种是Boyden Chamber或Transwel 1小室法。划痕法是通过测量创伤边界的缩窄率和 计数迁移经过初始创伤边界的细胞，从而对细胞迁移进行量化表征；Boyden Chamber或 Transwell小室法是通过计数穿过微孔膜的细胞数量来量化表征细胞迁移。这些方法都是 以细胞计数作为细胞迁移能力的判断指标，将所有区域的细胞进行计数是非常费时的，但 若仅对一些随机视野的细胞进行计数，又会导致结果不可靠。因此，这些方法都存在通量低 (一块板只有12个小室)，试剂和药物消耗量大，实验结果易受主观因素影响的缺点。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于荧光图像的抗肿瘤转移药物评价和筛选方法，是运 用一套筛选和评价硬件系统、图像采集控制系统和图像拼接识别系统，通过荧光染料标记 发生迁移的肿瘤细胞，测量各药物作用下迁移细胞数变化来实现对抗肿瘤转移药物的评价 和筛选。该筛选和评价系统主要由控制系统控制高精度可控电动平台按预设参数精确走 位，由相应滤光片过滤得到的激发光对荧光染料标记后的细胞进行激发产生荧光，再通过 内制冷高分辨率CXD实时采集图像并同步上传至电脑，所得图像通过拼接和识别系统处理 后，将生物信息可视化，并提供相应荧光参数用于抗肿瘤转移药物的评价。硬件系统由荧光 成像系统(包括荧光倒置显微镜、包括汞灯控制器、手动操纵杆和调节螺旋)、高精度可控电动平台(包括高精度可控电动平台和平台控制器)、高分辨率CCD和电脑组成。具体通过以下步骤实现(I)Hoechst 33342染色法定量细胞数Hoechst 33342是一种DNA特异性荧光染料，能穿透细胞膜并对细胞没有太大毒 性，它在细胞中与DNA中的A-T序列富集区结合，结合后能发出蓝色荧光。Hoechst 33342 常用于细胞凋亡检测和普通的细胞核染色。因此可以通过Hoechst 33342标记细胞来计数 细胞数。(a)准确称取Hoechst 333421mg溶于0. Iml的二甲亚砜(DMSO)中配成浓度为 10mg/ml的储备液，分装于0. 5ml离心管中，置于_20°C储存。临用前，用PBS稀释储备液至 所需浓度。(b)Hoechst 33342染色定量细胞数法线性范围取对数生长期的EAhy926细胞，0. 25%胰酶消化，离心收集细胞，按40000，30000， 20000，10000，5000，3000，1000个/孔(η = 3)的密度梯度接种于96孔细胞培养板中。置于
细胞培养箱中常规培养24h使贴壁，取出后用H0echst33342溶液(10 μ g/ml溶于PBS中) 对肿瘤细胞进行荧光标记，ΙΟΟμ 1/孔，37°C孵育15min。PBS洗两遍，吸净残余液体。用筛 选系统采集荧光图片，拍摄参数为蓝色荧光滤光片，曝光时间1200ms，物镜放大倍数2.5 倍，每孔摄取6幅图像。所得图像经荧光图像拼接、识别系统处理并统计荧光强度等参数。 以每孔统计得到的荧光强度等指标间接反映每孔的细胞数，并绘制细胞数与荧光强度的量 效曲线来确定本方法的线性范围。(2)基于荧光图像筛选具有抗肿瘤转移作用的药物取对数生长期的EAhy926细胞，0. 25%胰酶消化后，离心收集细胞，悬浮于无血清 培养基(4 XlOVml)中，接种于96孔Transwell板的上室，50μ 1/孔，下室均加入150μ 1完 全培养基，常规培养一定时间，这个时间可以根据所用细胞系和接种细胞数的不同进行选 择。待筛选组分及阳性药物在种板同时按实验设计终浓度加入上室细胞悬液中。迁移完成 后，弃去孔内培养液，用H0echst33342溶液(10 μ g/ml溶于PBS中)对肿瘤细胞进行荧光标 记，150 μ 1/孔，37°C孵育15min。小心擦除微孔膜上层的细胞，上下室均用PBS洗两遍，吸 净残余液体。用筛选系统采集荧光图片，拍摄参数为蓝色荧光滤光片，曝光时间1200ms， 物镜放大倍数2. 5倍。然后使用荧光图像拼接、识别系统处理图片并统计荧光强度等参数 以确定每孔的迁移细胞数。以药物的迁移抑制率对药物浓度作线性回归，得直线方程，从中 求出抑制半数肿瘤细胞迁移的化合物浓度(IC5tl)，对肿瘤细胞的迁移抑制率大于50%的药 物，进一步进行量效关系研究，计算其抑制肿瘤细胞迁移的IC5tl值，并与阳性对照做比较从 而评估其抑制肿瘤转移的活性。计算公式为药物对肿瘤细胞的迁移抑制率(％ ) = (1-Fm/Fc) X 100其中Fm为加药组的荧光强度，Fc为对照组的荧光强度。本发明的筛选和评价硬件系统主要由荧光成像系统(包括荧光倒置显微镜、包括 汞灯控制器、手动操纵杆和调节螺旋)、高精度可控电动平台(包括高精度可控电动平台和 平台控制器)、高分辨率CCD和电脑组成，其各部分的主要功能分别为(1)荧光成像系统主要部分为荧光倒置显微镜，用于放大经荧光标记的细胞，达到观测和成像要求；(2)高精度可控电动平台能在X-Y两个方向内精确移动，将测定样本送至显微镜 观测处，并按预设程序精确走位；(3)高分辨率CXD用于获得待测样本的显微荧光图像，并传送至电脑；(4)电脑用于存储荧光图片。本发明的图像采集控制系统和图像拼接识别系统的功能分别为(1)图像采集控制系统能控制高精度电动平台按照预设参数进行精确走位；(2)图像拼接识别系统能够对采集到的荧光图像进行拼接以得到整孔细胞图像， 进而识别、统计荧光强度等荧光参数，输出报表。本发明的另一个目的是提供所述方法在基于荧光图像的抗肿瘤转移药物的筛选 中应用。本发明的方法中，使得至少一种具有靶细胞器的肿瘤细胞的至少一种细胞参数在 药物存在或不存在时得以通过荧光测量结果的差异来表征。这些方法可以用于细胞系或原 代细胞。本发明的有益之处是本发明能够在活细胞内通过标记靶标或靶细胞器来定量迁 移的细胞数从而对药物对肿瘤细胞的迁移抑制作用进行评价。本发明提供的筛选方法对全 孔细胞进行拍照和统计，克服了传统方法(依赖于人工计数)通量低(一块板只有12个小 室)、试剂和药物消耗量大、实验结果易受主观因素影响的缺点。显著提高了筛选效率、缩短 了筛选时间，同时具有准确、重现性好和自动化程度高的特点。本发明设计合理，提供的筛选和评价系统效率高、结构完善，具有很高的应用价 值，能够用于大规模组合化学库或天然产物库的筛�。畈沽斯谕嗌璞傅募际蹩瞻祝� 且设备简单、经济，适合于国内在早期开展对于肿瘤转移治疗药物(包括化学合成药以及 天然产物)的筛选和先导化合物的发现，为肿瘤治疗药物的开发奠定基础。
图1基于荧光图像的药物筛选系统整体构架示意图。图2线性范围。图3阳性组与对照组荧光图片及灰度图。图4紫杉醇抗肿瘤细胞迁移量效关系。
具体实施例方式结合附图和实施例进一步说明本发明的实质内容及效果，该实施例仅用于说明本 发明而非对本发明的限制。试剂DMEM基础培养基；胎牛血清(FBS)；硫酸链霉素，青霉素钠；紫杉醇(Paclitaxel)；Hoechst 33342 ；
二甲基亚砜(DMSO)；其它试剂均为国产分析纯。仪器Leica DMI 6000B 荧光倒置显微镜、DFC 3IOFX CCD 德国 Leica 公司；二氧化碳培养箱Thermo Forma Series II Water Jacketed C02Incubator ；SB-840-2型单人双面超净工作台上海博迅实业有限公司医疗设备厂。实施例1 Hoechst 33342染色定量细胞数法a)筛选硬件系统本发明的筛选体系的硬件系统参见图1，主要包括荧光倒置显微镜(包括荧光倒 置显微镜、包括汞灯控制器、手动操纵杆和调节螺旋)、高精度可控电动平台(包括高精度 可控电动平台和平台控制器)、高分辨率CCD和电脑；b)Hoechst 33342染色定量细胞数法线性范围取对数生长期的EAhy926细胞，0. 25%胰酶消化，离心收集细胞，按40000，30000， 20000，10000，5000，3000，1000个/孔(η = 3)的密度梯度接种于96孔细胞培养板中。置于 细胞培养箱中常规培养24h使贴壁，取出后用H0echst33342溶液(10 μ g/ml溶于PBS中) 对肿瘤细胞进行荧光标记，100μ 1/孔，37°C孵育15min。PBS洗两遍，吸净残余液体。用筛 选系统采集荧光图片，拍摄参数为蓝色荧光滤光片，曝光时间1200ms，物镜放大倍数2.5 倍，每孔摄取6幅图像。所得图像经荧光图像拼接、识别系统处理并统计荧光强度等参数。 通过绘制细胞数与荧光强度的量效曲线确定本方法的线性范围。c)结果在荧光显微镜下摄取不同细胞密度的孔的图像(每孔6张)。使用荧光图像拼接 系统将每孔摄取的6张局部视野图片拼接成全孔图片，再用荧光图像识别系统统计其荧光 强度。参见图2，当接种细胞密度在0 6X IO4个/孔的范围内时，荧光强度与每孔接种细 胞数线性相关，相关系数r = 0. 9756。实施例2基于荧光图像筛选具有抗肿瘤转移作用的药物(1)试验方法取对数生长期的EAhy926细胞，0. 25%胰酶消化，离心收集细胞，悬浮于无血清培 养基(4 X105/ml)中，接种于96孔Transwell板的上室，50μ 1/孔，下室加入150μ 1含10% FBS的培养基，37°C，5% CO2，常规培养16h。阳性药物(紫杉醇)在种板同时按实验设计终 浓度加入上室细胞悬液中，并以未加药的细胞悬液作为阴性对照。迁移完成后，用Hoechst 33342溶液(10 μ g/ml溶于PBS中)替换下室的培养液对细胞进行荧光标记，150 μ 1/孔， 37°C孵育15min。小心擦除微孔膜上层的细胞，上下室均用PBS洗两遍，吸净残余液体后立 即在显微镜下扫描。荧光拍摄参数为蓝色荧光滤光片(激发光320-400nm、发射光400nm)， 曝光时间1200ms，物镜放大倍数2. 5倍。扫描所得图像经荧光图像拼接、识别处理并统计荧 光强度。按照以下公式计算药物对肿瘤细胞的迁移抑制率药物对肿瘤细胞的迁移抑制率(％ ) = (1-Fm/Fc) X 100其中Fm为加药组的荧光强度，Fc为对照组的荧光强度。(2)结果在荧光显微镜下分别摄取阴性对照孔和阳性对照孔的图像(每孔6张)。使用荧光图像拼接系统将每孔摄取的6张局部视野图片拼接成全孔图片参见图3，再用荧光图像 识别系统统计其荧光强度，其中阴性对照孔荧光强度为10002362，阳性对照孔荧光强度为 3700639。计算所得加药孔药物对EAhy926细胞的迁移抑制率为63. 0%。实施例3筛选系统用于紫杉醇抗肿瘤细胞迁移作用的评价(1)实验方法取对数生长期的EAhy926细胞，0. 25%胰酶消化，离心收集细胞，重悬在无血清培 养基(4X105/ml)中，接种于96孔Transwell板上室，50μ1/孔(η = 3)。用已知具有抗 肿瘤细胞迁移活性的化合物紫杉醇为阳性对照，种板同时加入上室细胞悬液中，浓度分别 取1、0. 5,0. 25,0. 125以及0. 0625ηΜ,同时以不加紫杉醇的细胞悬液为阴性对照，下室均加 入150 μ 1完全培养基。置于细胞培养箱中常规培养16h。迁移结束后用Hoechst 33342溶 液(10 μ g/ml溶于PBS中)替换下室的培养液对细胞进行荧光标记，150 μ 1/孔，37°C孵育 15min。小心擦除膜上层的细胞，上下室均用PBS洗两遍，吸净残余液体后立即在显微镜下 扫描。所得图像经过荧光图像拼接、识别系统处理并进行统计。以迁移抑制率对紫杉醇浓 度作线性回归，得直线方程，从中求出抑制半数肿瘤细胞迁移的化合物浓度(IC5tl)。计算公 式为紫杉醇对肿瘤细胞的迁移抑制率(％ ) = (1-Fm/Fc) X 100其中Fm为加药组的荧光强度，Fc为对照组的荧光强度。(2)结果参见图4，临床使用的抗肿瘤药紫杉醇对于肿瘤细胞EAhy926的迁移有抑制作用， 在0.0625 InM范围内抑制作用呈浓度依赖性。以迁移抑制率对紫杉醇浓度作线性回归， 得直线方程，计算得到IC5tl为0. 717nM。实验结果表明，应用本方法够准确定量待筛选药物的迁移抑制率，从而预测和评 价药物的抗肿瘤转移作用，为肿瘤转移治疗药物的发现奠定基础。
权利要求
一种基于荧光图像的抗肿瘤转移药物评价和筛选方法，其特征在于，包括由荧光成像系统、高精度可控电动平台、高分辨率CCD和电脑组成的硬件系统，通过荧光染料标记发生迁移的肿瘤细胞，测量各药物作用下迁移细胞数变化来实现，具体通过以下步骤实现(1)Hoechst 33342染色法定量细胞数(a)准确称取Hoechst 333421mg溶于0.1ml的二甲亚砜中配成浓度为10mg/ml的储备液，分装于0.5ml离心管中，置于 20℃储存，临用前，用PBS稀释储备液至所需浓度，(b)Hoechst 33342染色定量细胞数法线性范围取对数生长期的EAhy926细胞，0.25％胰酶消化，离心收集细胞，按40000，30000，20000，10000，5000，3000，1000个/孔(n＝3)的密度梯度接种于96孔细胞培养板中，置于细胞培养箱中常规培养24h使贴壁，取出后用Hoechst33342溶液(10μg/ml PBS中)对肿瘤细胞进行荧光标记，100μl/孔，37℃孵育15min，PBS洗两遍，吸净残余液体，用评价和筛选的硬件系统采集荧光图片，拍摄参数为蓝色荧光滤光片，曝光时间1200ms，物镜放大倍数2.5倍，每孔摄取6幅图像，所得图像经荧光图像拼接、识别软件处理并统计荧光强度等参数，以每孔统计得到的荧光强度等指标间接反映每孔的细胞数，通过绘制细胞数与荧光强度的量效曲线确定线性范围；(2)基于荧光图像筛选具有抗肿瘤转移作用的药物取对数生长期的EAhy926细胞，0.25％胰酶消化后，离心收集细胞，悬浮于4×105/ml的无血清培养基中，接种于96孔Transwell板的上室，50μl/孔，下室均加入150μl完全培养基，常规培养，待筛选组分及阳性药物在种板同时按实验设计终浓度加入上室细胞悬液中，迁移完成后，弃去孔内培养液，用Hoechst 33342溶液(10μg/ml溶于PBS中)对肿瘤细胞进行荧光标记，150μl/孔，37℃孵育15min，小心擦除微孔膜上层的细胞，上下室均用PBS洗两遍，吸净残余液体，用评价和筛选的硬件系统采集荧光图片，拍摄参数为蓝色荧光滤光片，曝光时间1200ms，物镜放大倍数2.5倍，然后使用荧光图像拼接、识别软件处理图片并统计荧光强度等参数，以药物的迁移抑制率对药物浓度作线性回归，得直线方程，从中求出抑制半数肿瘤细胞迁移的化合物浓度(IC50)，对肿瘤细胞的迁移抑制率大于50％的药物，计算其抑制肿瘤细胞迁移的IC50值，并与阳性对照做比较从而评估其抑制肿瘤转移的活性，计算公式为药物对肿瘤细胞的迁移抑制率(％)＝(1 Fm/Fc)×100其中Fm为加药组的荧光强度，Fc为对照组的荧光强度。
2.根据权利要求1所述的一种基于荧光图像的抗肿瘤转移药物评价和筛选方法，其特 征在于，荧光成像系统主要部分为具有放大经荧光标记的细胞的荧光倒置显微镜。
3.根据权利要求1所述的一种基于荧光图像的抗肿瘤转移药物评价和筛选方法，其特 征在于，步骤(b)所用的是10 μ g/ml PBS的Hoechst 33342溶液。
4.根据权利要求1所述的一种基于荧光图像的抗肿瘤转移药物评价和筛选方法在抗 肿瘤转移药物筛选中的应用。
全文摘要
本发明提供一种基于荧光图像的抗肿瘤转移药物评价和筛选方法，是运用一套筛选和评价硬件系统、图像采集控制系统和图像拼接识别系统，通过荧光染料标记发生迁移的肿瘤细胞，测量各药物作用下迁移细胞数变化来实现对抗肿瘤转移药物的评价和筛选。该筛选和评价系统主要由控制系统控制高精度可控电动平台按预设参数精确走位，由相应滤光片过滤得到的激发光对荧光染料标记后的细胞进行激发产生荧光，再通过内制冷高分辨率CCD实时采集图像并同步上传至电脑，所得图像通过拼接和识别系统处理后，将生物信息可视化，并提供相应荧光参数用于抗肿瘤转移药物的评价和筛�。哂猩秆⌒矢�、时间短、准确、重现性好和自动化程度高的特点。
文档编号G01N15/10GK101923037SQ20101023789
公开日2010年12月22日 申请日期2010年7月27日 优先权日2010年7月27日
发明者王毅, 程翼宇, 赵筱萍 申请人:浙江大学
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