专利名称：不含朊病毒的纳米颗粒组合物和方法
技术领域：
本发明涉及包括纳米颗粒的不含朊病毒的组合物、制造所述组合物的方法和使用所述组合物的方法，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药物。
背景技术：
朊病毒�。脖怀莆拘院Ｃ嘧茨圆�(TSE)，是一组致死性、传播性的神经退化性疾病。TSE的具体例子包括影响绵羊和山羊的瘙痒病、牛海绵状脑病(BSE)、传染性的水貂脑病、猫海绵状脑病和慢性消耗性疾病(CWD)。在人类中，TSE疾病本身可以作为库鲁病(kuru)、库贾氏症(Creutzfeldt-Jekobdisease) (CJD)、格斯特曼-施特劳斯纳 (Gerstmann-Straussler-Scheinker)综合征(GSS)、致死性失眠症和库贾氏症变种(vCJD) 存在。作为在英国BSE流行病的结果在人类中出现的vCJD最可能是由于消费源于感染BSE 或“疯牛病”的牛的食品所造成的。(Will等(1996)Lancet 347 =921-925)由于在人类中该经口感染的疾病的潜伏期可能超过20年，因此许多年来vCJD的真正发病率并不明显。除了摄入感染的牛源产品，输血和器官移植代表人类之间vCJD传播的另一种模式(Brown等(1998)Transfusion 38 :810-816 ；Diringer等(1984)Archives of Virology 82 :105-109 ；ManueIidis 等(1978)Nature271 :778-779)。自从 20 世纪 90 年代中期，提出了主要关注vCJD可通过输血或来自感染TSE个体的其他血制品传播。这些个体在vCJD长时间的临床前和潜伏期期间可以是无症状的，来自这些捐赠人的血液可以能够传播该疾病到接受源于该捐赠人的血液或血制品的人。迄今，在英国至少报道了 4例人类输血获得vCJD的病例。接受来自22个捐赠人全血的64个人，4个人发展为vCJD。在第一个事件中，接受者在接受来自仍然无症状的捐赠人的红细胞7年后发病，而捐赠人直到捐赠3年后才出现vCJD的迹象(Llewely等Q004) Lancet363 :417-421)。在第二个事件中，捐赠人在捐赠后2年死于vCJD，而接受者在捐赠后 5年死于动脉瘤(不是vCJD) (Peden等(2004) Lancet364 :527-529)。在接受者的尸检中， PrPsc存在于淋巴结和脾中，但脑中没有。在第三个事件中，接受者从捐赠者输血后7年半死于vCJD，捐赠者捐赠后20个月发展为vCJD(Wroe等Q006) Lancet368 :2061-2067)。第四个事件出现在接受者从在第三个病例中的相同捐赠者输血8年半之后(Health Protection Agency-Health Protection Report, (2007) Vol 1, No 3, 26.可得自http://www. hpa. org. uk/hpr/archives/2007/news2007/news 0307. htm)。所有朊病毒病的共同特征是正常的细胞朊病毒蛋白(PrPc)转变为异常的同种型 (PrPsc)。IM3c和IM3sc之间的差异被认为是纯粹构象上的，PrPc主要具有α螺旋结构而PrPsc主要具有通常组装形成聚集体的β折叠。PrPsc作为模板诱导正常的蛋白质分子转化为相同的异常同种型，其接着又使更多的IM3C转化为IM3Sc O^rus iner等(1998)ft~OC. Natl. Acad. Sci. USA 95 :13363-13383)。该自身催化过程导致神经毒PrPsc聚集体的指数形成(Aguzzi等Q007)Nat Rev Mol. Cell Biol. 8 :552-561)。朊病毒蛋白配体及其使用描述在 W004/050851、W006/010915、W004/090102 和 W006/044459 中。研究已经显示，在血液中最早的朊病毒传染性的出现可能发生在疾病潜伏期的早期阶段期间(Brown 等(2006)Blood infectivity in the transmissible spongiform enc印halopathies (在传染性海绵状脑病中的血液传染性)在TurnerML，ed. 95-118第4 章)。由于在疾病症状开始之前可能要很长时间，隐性感染的个体可能仍被认为是健康的有效血液捐赠者。而且，一些个体可永久地感染或短时间感染而不形成疾病。因此，确保血液源产品的血液源不含朊病毒是困难的——如果可能的话。已经开发了基于白蛋白的纳米颗粒组合物作为药物递送系统，用于输送基本上不溶于水的药物。见，例如美国专利号5，916，596 ；6, 506，405 ；6, 749，868和6，537，579以及还在美国专利公开号2005/0004002和2007/00拟838。基于白蛋白的纳米颗粒技术利用蛋白质白蛋白独特的天然性质，以运输和递送基本上不溶于水的药物到疾病部位。这些纳米颗粒容易并入机体自身的运输过程并能够利用肿瘤对白蛋白的吸引，使更高浓度的活性药物能够递送到目标部位。另外，基于白蛋白的纳米颗粒技术在给药过程中通过避免对毒性化学品比如溶剂的需要提供改善药物溶解性的能力，从而潜在地通过消除溶剂相关的副作用改善安全性。本文提到的所有出版物、专利、专利申请和公开的专利申请的公开内容在此通过引用以它们的整体并入本文。发明简述在一方面，本发明提供了不含朊病毒的纳米颗粒组合物(比如药学组合物)。在一些实施方式中，提供了包含纳米颗粒的组合物，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，其中组合物基本上不含朊病毒蛋白。在一些实施方式中，组合物是无菌的。在一些实施方式中，组合物是可无菌过滤的。在一些实施方式中，组合物进一步包括药学上可接受的载体。在一些实施方式中，组合物具有小于大约100fg/ml的朊病毒蛋白。在一些实施方式中，组合物具有小于大约lOIU-ic/ml的朊病毒传染性。在一些实施方式中，组合物具有小于大约lLD5(l/ml的朊病毒传染性。在一些实施方式中，基于蛋白质错误折叠循环扩增(PMCA)试验，组合物显示不存在朊病毒蛋白。在一些实施方式中，基于IPCR试验，组合物显示不存在朊病毒蛋白。在一些实施方式中，组合物具有小于大约lOIU-ic/ml的朊病毒传染性，并基于PMCA试验显示不存在朊病毒蛋白。在一些实施方式中，组合物具有小于大约lOIU-ic/ml的朊病毒传染性， 并基于IPRC试验显示不存在朊病毒蛋白。本文描述的组合物一般基本上不含ft^sc。在一些实施方式中，组合物也基本上不含I^rPc。在一些实施方式中，在组合物中PrPsc和I^rPc的摩尔比不大于大约1 1，比如不大于大约 1 10、1 100、1 1000、1 10000 或 1 100000 的任何一个。在一些实施方式中，本文描述的组合物包含一定量(例如痕量)的在朊病毒除去
5过程中引入的物质。例如，在一些实施方式中，提供了包含纳米颗粒的组合物，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，其中组合物基本上不含朊病毒蛋白，和其中组合物包含一定量(例如痕量)的能够结合朊病毒蛋白的配体。在一些实施方式中，提供了包含纳米颗粒的组合物，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，其中组合物基本上不含朊病毒蛋白，和其中组合物包含一定量(例如痕量)的支持材料(比如本文描述的支持材料，包括树脂)。在一些实施方式中，提供了包含纳米颗粒的组合物，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，其中组合物基本上不含朊病毒蛋白，和其中组合物包含一定量的PRDT树脂(例如痕量PRDT树脂)。在一些实施方式中，提供了包含纳米颗粒的组合物，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂， 其中组合物基本上不含朊病毒蛋白，和其中组合物包含一定量的DVR树脂(例如痕量DVR 树脂)。在一些实施方式中，在组合物中白蛋白稳定剂的水平小于其中白蛋白没有通过朊病毒除去过程被净化的组合物的白蛋白稳定剂水平。这些白蛋白稳定剂包括，例如N-乙酰色氨酸酯和辛酸钠。在一些实施方式中，组合物与其中白蛋白没有通过朊病毒除去过程被净化的组合物生物等价。在一些实施方式中，提供了包含纳米颗粒的组合物，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，其中在组合物中的白蛋白通过包含朊病毒除去过程的方法获得，所述朊病毒除去过程包括使初始白蛋白组合物与能够与朊病毒蛋白结合的配体接触。在一些实施方式中，朊病毒除去过程进一步包括从所述白蛋白组合物中除去所述配体和与其结合的蛋白质。在一些实施方式中，提供了包含纳米颗粒的组合物，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，其中在组合物中的白蛋白通过如此方法获得，所述方法包括a)使初始白蛋白组合物和能够与朊病毒蛋白结合的配体接触以引起在配体和朊病毒蛋白之间形成复合物，和b)从初始组合物中除去复合物。在一些实施方式中，初始白蛋白组合物是血液源产品。在一些实施方式中，初始白蛋白组合物是从体液(比如血液)中制备的白蛋白组合物。在一些实施方式中，白蛋白是人血清白蛋白。在一些实施方式中，配体是肽(比如在表1中提供的任何肽)。在一些实施方式中，配体是识别朊病毒蛋白的抗体。在一些实施方式中，配体是化合物(比如基于三嗪的化合物)。在一些实施方式中，配体包含氨基，比如在氨基树脂上的氨基。配体可附着于支持材料，包括，例如柱、珠、基体、滤纸和膜。另一方面，提供了产生不含朊病毒的纳米颗粒组合物的方法。例如，在一些实施方式中，提供了产生包含纳米颗粒的组合物的方法，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，所述方法包括使包括白蛋白溶液和有机相的混合物经历高剪切条件， 所述有机相包括分散在有机溶剂中的所述基本上不溶于水的药学活性剂，其中白蛋白通过包括从初始白蛋白组合物中除去朊病毒蛋白的方法获得。在一些实施方式中，提供了产生包含纳米颗粒的组合物的方法，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性齐U，所述方法包括使包括白蛋白溶液和有机相的混合物经历高剪切条件，所述有机相包括
6分散在有机溶剂中的所述基本上不溶于水的药学活性剂，其中白蛋白通过包括使初始白蛋白组合物和能够与朊病毒蛋白结合的配体接触的方法获得。在一些实施方式中，提供了产生包含纳米颗粒的组合物的方法，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性齐U，所述方法包括使包括白蛋白溶液和有机相的混合物经历高剪切条件，所述有机相包括分散在有机溶剂中的所述基本上不溶于水的药学活性剂，其中白蛋白通过如此方法获得， 所述方法包括a)使初始白蛋白组合物和能够与朊病毒蛋白结合的配体接触，和b)从初始组合物中除去配体和与其结合的蛋白质。在一些实施方式中，提供了产生包含纳米颗粒的组合物的方法，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，所述方法包括a)从初始白蛋白组合物中除去朊病毒蛋白；b)使包括溶液和有机相的混合物经历高剪切条件，所述溶液包括除去朊病毒的白蛋白，所述有机相包括分散在有机溶剂中的所述基本上不溶于水的药学活性剂。在一些实施方式中，提供了产生包含纳米颗粒的组合物的方法，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，所述方法包括a)使初始白蛋白组合物和能够与朊病毒蛋白结合的配体接触以引起在配体和朊病毒蛋白之间形成复合物，b)从白蛋白初始组合物中除去复合物；和c)使包括溶液和有机相的混合物经历高剪切条件，所述溶液包括除去朊病毒的白蛋白，所述有机相包括分散在有机溶剂中的所述基本上不溶于水的药学活性剂。在一些实施方式中，提供了产生包含纳米颗粒的组合物的方法，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，所述方法包括a)使白蛋白溶液和能够与朊病毒蛋白结合的配体接触，b)从白蛋白溶液中除去配体和与其结合的蛋白质，和c)使包括所述白蛋白溶液和有机相的混合物经历高剪切条件，所述有机相包括分散在有机溶剂中的所述基本上不溶于水的药学活性剂。在一些实施方式中，混合物基本上不含表面活性剂。可在形成纳米颗粒期间除去朊病毒。例如，在一些实施方式中，提供了产生包含纳米颗粒的组合物的方法，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，所述方法包括a)使包括白蛋白溶液和有机相的混合物和能够与朊病毒蛋白结合的配体接触， 所述有机相包括分散在有机溶剂中的所述基本上不溶于水的药学活性剂。在一些实施方式中，方法进一步包括b)从混合物中除去配体和与其结合的蛋白质。在一些实施方式中，方法进一步包括C)使混合物经历高剪切条件。在一些实施方式中，混合物基本上不含表面活性剂。朊病毒蛋白还可在纳米颗粒组合物形成之后除去。例如，在一些实施方式中，提供了产生包含纳米颗粒的组合物的方法，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，所述方法包括使包括有机相和白蛋白溶液的混合物和能够与朊病毒蛋白结合的配体接触，所述有机相包括分散在有机溶剂中的所述基本上不溶于水的药学活性剂，其中混合物在和配体接触之前已经经历高剪切条件。在一些实施方式中，提供了产生包含纳米颗粒的组合物的方法，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，所述方法包括a)使包括有机相和白蛋白溶液的混合物经历高剪切条件，所述有机相包括分散在有机溶剂中的所述基本上不溶于水的药学活性剂，和b)使混合物和能够与朊病毒蛋白结合的配体接触。在一些实施方式中，方法进一步包括c)从混合物中除去配体和与其结合的蛋白质。在一些实施方式中，混合物基本上不含表面活性剂。在一些实施方式中，提供了从怀疑包含朊病毒蛋白的包含纳米颗粒的组合物中除去朊病毒蛋白的方法，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，所述方法包括a)使纳米颗粒组合物和能够与朊病毒蛋白结合的配体接触，b)从纳米颗粒组合物中除去配体和与其结合的蛋白质。在一些实施方式中，提供了从怀疑包含异常朊病毒蛋白的白蛋白组合物中除去朊病毒蛋白的方法，包括a)使包括白蛋白的组合物和能够与朊病毒蛋白结合的配体接触，b)从白蛋白组合物中除去配体和与其结合的蛋白质，其中所述白蛋白组合物用于产生包含纳米颗粒的组合物，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂。在一些实施方式中，提供了从包含纳米颗粒的组合物中除去朊病毒蛋白的方法， 所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，所述方法包括a)确定在组合物中存在或不存在朊病毒蛋白，b)使组合物和能够与朊病毒蛋白结合的配体接触，和c)从组合物中除去配体和与其结合的蛋白质。还提供了在朊病毒除去过程期间制造的组合物。例如，在一些实施方式中，提供了包含纳米颗粒的组合物，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，所述组合物进一步包括能够与朊病毒蛋白结合的配体。在一些实施方式中，提供了包括纳米颗�：湍芄挥腚貌《镜鞍捉岷系呐涮宓幕旌衔铮瞿擅卓帕０椎鞍缀突旧喜蝗苡谒囊┭Щ钚约粒雠涮甯阶庞谥С植牧希热绫疚拿枋龅囊恢只蚨嘀种С植牧�。在一些实施方式中，提供了装载有包含纳米颗粒的组合物的柱，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，其中柱包含能够与朊病毒蛋白结合的配体。还提供了通过本文所描述方法制造的组合物。还提供了使用本文描述的不含朊病毒组合物的方法。例如，在一些实施方式中，提供了施用包含纳米颗粒的组合物的方法，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，其中组合物基本上不含朊病毒蛋白。在一些实施方式中，提供了治疗疾病(比如癌症)的方法，包括施用包含纳米颗粒的组合物，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，其中组合物基本上不含朊病毒蛋白。在一些实施方式中，提供了施用包含纳米颗粒的组合物的方法，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，其中在组合物中的白蛋白通过包含朊病毒除去过程的方法获得，所述朊病毒除去过程包括使初始白蛋白组合物和能够与朊病毒蛋白结合的配体接触。在一些实施方式中，朊病毒除去过程进一步包括从所述白蛋白组合物中除去所述配体和与其结合的蛋白质。在一些实施方式中，提供了治疗疾病(比如癌症)的方法， 包括施用包含纳米颗粒的组合物，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性齐U，其中在组合物中的白蛋白通过包含朊病毒除去过程的方法获得，所述朊病毒除去过程包括使初始白蛋白组合物和能够与朊病毒蛋白结合的配体接触。还提供了包括本文描述的不含朊病毒的纳米颗粒组合物的试剂盒和剂型(比如小瓶，例如密封小瓶)和可用于本文描述的方法的试剂盒。还提供了进行本文描述的一种或多种方法的系统(包括装置)。本发明的这些和其他方面和优点将从随后的详细描述和所附的权利要求变得显而易见。应当理解，本文描述的各种实施方式的一种、一些或所有性质可结合，以形成本发明的其他实施方式。附图简述
图1提供了在20%或25%白蛋白中用0. 01%和0. 005%瘙痒病仓鼠脑勻浆攻击的DVR树脂的蛋白质印�：蚐DS-PAGE凝胶。AMN31是阳性对照树脂。观察到的信号是结合部分。“-PK”和“+PK”表示不存在或存在蛋白酶K消化。图2提供了在20%或25%白蛋白中用0. 01%和0. 005%瘙痒病仓鼠脑勻浆攻击的YVHEA和SYA树脂的蛋白质印�：蚐DS-PAGE凝胶。AMN31是阳性对照树脂。观察到的信号是结合部分。“-PK”和“+PK”表示不存在或存在蛋白酶K消化。图3提供了在20%或25%白蛋白中用0. 01%和0. 005%瘙痒病仓鼠脑勻浆攻击的D4树脂的蛋白质印迹和SDS-PAGE凝胶。AMN31是阳性对照树脂。观察到的信号是结合部分。“-PK”和“+PK”表示不存在或存在蛋白酶K消化。图4描绘了对于20%白蛋白通过朊病毒减少树脂柱(PRDT(病原体除去和诊断技术)柱)除去TSE的工艺流程图。图5显示了在对于20%白蛋白通过PRDT柱除去TSE的研究中来自外加实验的色谱图。图6显示了离心的20%白蛋白溶液(10倍浓缩或没有10倍浓缩)的蛋白印迹干扰试验。图7描绘了对于25%白蛋白通过朊病毒减少树脂柱(PRDT柱)除去TSE的工艺流程图。图8显示在对于25%白蛋白通过PRDT柱除去TSE的研究中来自外加实验的色谱图。图9显示了离心的25%白蛋白溶液(10倍浓缩或没有10倍浓缩)的蛋白印迹干扰试验。发明详述本发明提供了不含朊病毒的包括纳米颗粒的组合物(比如药学组合物)，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂；和制造不含朊病毒组合物的方法。一方面，本发明提供了包括纳米颗粒的组合物(比如药学组合物)，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，其中组合物基本上不含朊病毒蛋白。另一方面，提供了制造不含朊病毒的包括纳米颗粒的组合物(比如药学组合物) 的方法，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂。还提供了在制造过程的方法期间制造的组合。另一方面，提供了使用不含朊病毒的包括纳米颗粒的组合物(比如药学组合物) 的方法，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂。还提供了包括本文描述的不含朊病毒的纳米颗粒组合物的试剂盒和剂型(比如小瓶，例如密封小瓶)和可用于本文描述方法的试剂盒和系统(包括装置)。本文使用“不含朊病毒”是为了方便以及以便一般性地描述本发明组合物，并意图包括本文描述的所有实施方式。本文提到“大约”数值或参数包括(和描述)涉及该数值或参数本身的实施方式。 例如描述提到“大约” X包括“X”的描述。应该理解，本文所述的本发明的方面和实施方式包括“由各方面和实施方式组成 (consisting)”和/或“基本上由各方面和实施方式组成(consisting essentially of)”。
不含朊病毒的纳米颗粒组合物本发明提供了包括纳米颗粒的组合物(比如药学组合物)，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，其中组合物基本上不含朊病毒蛋白。在一些实施方式中，组合物是无菌的。在一些实施方式中，组合物是可无菌过滤的。在一些实施方式中， 组合物进一步包括药学上可接受的载体。在一些实施方式中，在组合物中通过具有大约IOOfg/ml或更高检测灵敏度的检测方法检测不到朊病毒蛋白，就是说，在使用具有大约100fg/ml或更高检测灵敏度(例如大约50fg/ml，大约10fg/ml，大约lfg/ml，大约0. If g/ml的检测灵敏度)的方法的试验中测试结果是阴性的。在组合物中的朊病毒含量可直接从组合物中确定。可选地，在测定之前可处理组合物，例如浓缩或富集以便促进在组合物中朊病毒蛋白的检测和量化。测定组合物是否基本上不含朊病毒蛋白的一种方法是体内传染性试验。例如，体内传染性可由在小鼠、貂、仓鼠或山羊模型中接种测试组合物证明。传染性可通过致死剂量(LD50)来测定，所述致死剂量，即，当通过给定途径(比如通过大脑内途径)施用时诱导50%暴露动物发病的剂量。可选地，传染性可通过传染单位测定，所述传染单位即，能够使疾病通过给定途径从一种实验动物传播到另一种的最小传染剂量。一般地，lOOIU-ic/ ml (通过大脑内途径测定的传染单位)相当于大约10LD50/ml和lpg/ml的朊病毒蛋白。测定组合物中的朊病毒蛋白的另一种方法是免疫聚合酶链反应(IPCR)，其为如此技术，凭借该技术PCR的指数扩增能力与通过ELISA形式的抗体检测蛋白质相结合，并应用到修改的实时IPCR方法中以检测超低水平的朊病毒蛋白。见Barletta等，J. Virology Method, 127 (2005):巧4_104。使用IPCR，重组仓鼠IM3C被检测一直为lfg/ml并用半定量剂量反应检测蛋白酶K(PK)消化的瘙痒病感染的稀释到10_8(大约10-100个传染单位)的仓鼠脑勻浆。在一些实施方式中，通过蛋白质错误折叠循环扩增(PMCA)测定在组合物中的朊病毒蛋白。该方法已经用于在血液中检测ft^sc。适合检测组合物中朊病毒蛋白的其他方法包括，但不限于使用时间分辨离解增强荧光技术的定量夹心ELISA ；双色荧光共焦扫描 (dual-color fluorescent confocal scanning)；构象依赖性免疫测定方法(CDI)。蛋白质印迹、珠印迹(bead blot)、凝胶迁移率变动分析(gel-mobility shift assays)、荧光原位杂交分析(FISH)、放射性标记或生物荧光标记追踪、核磁共振、电子顺磁共振、停流光谱 (stopped-flow spectroscopy)、柱层析法、毛细管电泳法或其他方法也可被开发以检测组合物中的朊病毒蛋白。在一些实施方式中，基于用于检测朊病毒蛋白的一种试验(比如上述试验的任何一种)，组合物基本上不含朊病毒蛋白。在一些实施方式中，两种或多种试验被用于分析组合物，且这些不同试验之间的关系用于测定组合物是否含有朊病毒蛋白。因此，在一些实施方式中，提供了包含纳米颗粒的组合物，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，其中组合物基本上不含朊病毒蛋白。在一些实施方式中，组合物具有小于大约100fg/ml的朊病毒传染性。在一些实施方式中，组合物具有小于大约lOIU-ic/ml的朊病毒传染性。在一些实施方式中，组合物具有小于大约lLD50/ml的朊病毒传染性。在一些实施方式中，基于蛋白质错误折叠循环扩增(PMCA)试验，组合物显示不存在朊病毒蛋白。在一些实施方式中，基于IPCR试验，组合物显示不存在朊病毒蛋白。在
10一些实施方式中，组合物具有小于大约lOIU-ic/ml的朊病毒传染性，并基于PMCA试验，显示不存在朊病毒蛋白。在一些实施方式中，组合物具有小于大约lOIU-ic/ml的朊病毒传染性，并基于IPRC试验显示不存咋朊病毒蛋白。在一些实施方式中，基于《就vCJD风险研究血浆源医药产品的制造过程的指南》(Guideline for the Investigation of Manufacturing Processes for Plasma-Derived Medicinal Products with Regard to vCJD Risk)中提
供的标准(CPMP5136/03)-见 http://www. emea. europa. eu/pdfs/human/bwp/513603en.
Pdf，其内容以其整体并入本文，组合物不含朊病毒蛋白。本文描述的组合物一般基本上不含ft^sc。在一些实施方式中，组合物也基本上不含I^rPc。在一些实施方式中，在组合物中PrPsc和I^rPc的摩尔比不大于大约1 1，比如不大于大约 1 10、1 100、1 1000、1 10000 或 1 100000 的任何一个。在一些实施方式中，组合物基本上不含来自人类、牛、绵羊和啮齿类(比如仓鼠、 小鼠和貂)的朊病毒蛋白。在一些实施方式中，组合物基本上不含H型朊病毒蛋白、L型朊病毒蛋白或二者。在一些实施方式中，组合物基本上不含细胞结合的朊病毒蛋白、游离的朊病毒蛋白或二者。本使用的术语“PrPc”指在哺乳动物体内自然表达的天然朊病毒蛋白分子。本文所用的术语“ft^sc”指被认为具有传染性的构象改变形式的分子。本文所用的“白蛋白”指天然存在的白蛋白，不包含重组产生的白蛋白。天然发生的白蛋白相对于重组白蛋白是有优势的，因为它是体内白蛋白受体的天然配体。在本文描述的方法中使用的白蛋白一般保留白蛋白的翻译后修饰并因此降低了免疫原性的风险。在一些实施方式中，白蛋白从血液源的组合物中获得。本文所用的“血液源的组合物”包括全血、红细胞浓缩物、血浆、血清、血小板富集和血小板匮乏的馏分、血小板浓缩物、白细胞、血浆沉淀物、血浆分馏沉淀物和上清液、血浆分馏中间物、源于血液的各种其他物质等。在一些实施方式中，白蛋白来自人。在一些实施方式中，白蛋白来自动物比如牛、绵羊和啮齿类 (比如小鼠、仓鼠和貂)。在一些实施方式中，白蛋白从一群至少一些已经被朊病毒感染的个体中(比如人)获得。在一些实施方式中，白蛋白从一群至少一些被怀疑已经被朊病毒感染的个体中(比如人)获得。在一些实施方式中，白蛋白从大批量群的个体中获得。在一些实施方式中，本文描述的组合物包含在朊病毒除去过程期间引入的痕量物质。例如，在一些实施方式中，提供了包含纳米颗粒的组合物，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，其中组合物基本上不含朊病毒蛋白，和其中组合物包含痕量的能够结合朊病毒蛋白的配体。在一些实施方式中，提供了包含纳米颗粒的组合物，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，其中组合物基本上不含朊病毒蛋白，和其中组合物包含痕量的支持材料(比如来自本文描述的支持材料的材料，包括树脂)。在一些实施方式中，提供了包含纳米颗粒的组合物，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，其中组合物基本上不含朊病毒蛋白，和其中组合物包含痕量的能够结合朊病毒蛋白的配体和痕量的支持材料(比如来自本文描述的支持材料的材料，包括树脂)。“痕量”指例如在生物利用度和/或生物等效方面不影响组合物性质的可检测的量。在一些实施方式中，组合物与其中白蛋白没有通过朊病毒除去过程被净化的组合物生物等价。可建立生物等效，例如通过在Cmax和AUC 二者的0. 80和1. 25之间的90% 置信区间或在AUC的0. 80和1. 25之间的90%置信区间和在Cmax的0. 70和1. 43之间的
90%置信区间。在一些实施方式中，在组合物中白蛋白稳定剂的水平小于其中白蛋白没有通过朊病毒除去过程被净化的组合物的白蛋白稳定剂水平。这些白蛋白稳定剂包括，例如N-乙酰色氨酸酯和辛酸钠。本文描述的组合物一般包括纳米颗粒，所述纳米颗粒包括基本上不溶于水的药学活性剂和白蛋白。在一些实施方式中，纳米颗粒组合物包含纳米颗粒，所述纳米颗粒包括基本上不溶于水的药学活性剂和白蛋白。在一些实施方式中，本文描述的组合物中的纳米颗粒具有不大于大约lOOOnm，包括例如不大于大约900、800、700、600、500、400、300、200、 190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、90、80、70 或 60nm 的任何一个的平均直径。 在一些实施方式中，在组合物中所有纳米颗粒的至少大约50% (例如至少大约60%、70%、 80%、90%、95%或99%的任何一个)具有不大于大约lOOOnm，包括例如不大于大约900、 800、700、600、500、400、300、200、190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、90、80、70 或60nm的任何一个的直径。在一些实施方式中，在组合物中所有纳米颗粒的至少大约50% (例如至少60 %、70 %、80 %、90 %、95 %或99 %的至少一个)落在大约20到大约200nm，包括例如大约30到大约180nm的任何一个，和大约40到大约150、大约50到大约120和大约 60到大约IOOnm的任何一个的范围内。在一些实施方式中，组合物的纳米颗粒部分中至少大约5% (包括例如至少大约 10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或 90%的任何一个)的白蛋白是交联的(例如通过一个或多个二硫键交联)。在一些实施方式中，纳米颗粒包括用白蛋白(例如人血清白蛋白)包被的基本上不溶于水的药学活性剂(比如紫杉醇)。在一些实施方式中，组合物包括纳米颗�：头悄擅卓帕Ｐ问蕉叩幕旧喜蝗苡谒囊┭Щ钚约粒渲性谧楹衔镏兄辽俅笤�50%、60%、 70%、80%、90%、95%或99%的任何一个的基本上不溶于水的药学活性剂为纳米颗粒形式。在一些实施方式中，按重量计，在纳米颗粒中基本上不溶于水的药学活性剂构成纳米颗粒的大于大约50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%的任何一个。在一些实施方式中， 纳米颗粒具有非聚合基体。在一些实施方式中，纳米颗粒包括基本上不溶于水的药学活性剂的核心，其基本上不含聚合材料(比如聚合基体)。在一些实施方式中，纳米颗粒组合物基本上不含(比如不含)表面活性剂或有机溶剂(比如Cremophor (克列莫佛) ，TweenSO或用于施用基本上不溶于水的药学活性剂的其他有机溶剂)。在一些实施方式中，纳米颗粒组合物包含小于大约20 %、15 %、10 %、 7.5%,5%,2. 5%、1%或更少的任何一个的有机溶剂。从包含白蛋白的组合物中除去朊病毒使施用更大量的白蛋白成为可能，而无需担心朊病毒。本发明因此还考虑包含纳米颗粒的组合物(比如药学组合物)，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，其中白蛋白与基本上不溶于水的药剂的重量比是大约20 1或更高，比如大约30 1或更高、大约40 1或更高、或大约50 1或更高的任何一个。示例性比率包括，例如大约20 1到大约40 1、大约40 1到大约 60 1、大约60 1到大约80 1或大约90 1到大约100 1。在一些实施方式中，
12在纳米颗粒组合物中白蛋白与基本上不溶于水的药学活性剂的重量比是大约18 1或更低，比如大约15 1或更低，例如大约10 1或更低。在一些实施方式中，在组合物中白蛋白与基本上不溶于水的药学活性剂的重量比落在大约1 1到大约18 1、大约2 1 到大约15 1、大约3 1到大约13 1、大约4 1到大约12 1、大约5 1到大约 10 1的任何一个的范围内。在一些实施方式中，组合物的纳米颗粒部分中白蛋白与基本上不溶于水的药学活性剂的重量比是大约1 2、1 3、1 4、1 5、1 6、1 7、1 8、 1 9、1 IOU IlU 12、1 13、1 14、1 15 或更低的任何一个。在一些实施方式中，颗粒组合物包含一种或多种上面的特征。在一些实施方式中，纳米颗粒组合物是Abraxane 。包括其他基本上不溶于水的药学活性剂(比如多西紫杉醇和沃塔紫杉醇(ortataxel))的纳米颗粒组合物也可包括一种或多种上面的特征。在一些实施方式中，提供了包含纳米颗粒的组合物，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，其中在组合物中的白蛋白通过包含朊病毒除去过程的方法获得，所述朊病毒除去过程包括使初始白蛋白组合物和能够与朊病毒蛋白结合的配体接触。在一些实施方式中，朊病毒除去过程进一步包括从所述白蛋白组合物中除去所述配体和与其结合的蛋白质。在一些实施方式中，提供了包含纳米颗粒的组合物，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，其中在组合物中的白蛋白通过如此方法获得，所述方法包括a)使初始包括白蛋白的组合物和能够与朊病毒蛋白结合的配体接触以引起在配体和朊病毒蛋白之间形成复合物，和b)从初始组合物中除去复合物。下面更加详细地描述包括白蛋白和基本上不溶于水的药物的纳米颗粒。下面更加详细地描述从组合物(比如初始白蛋白组合物、纳米颗粒组合物——所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂、或在制造纳米颗粒过程中形成的中间组合物)中除去朊病毒的方法。本发明包括由本文描述的任何方法产生的组合物。与其中白蛋白没有通过朊病毒除去过程净化的组合物相比，本文描述的组合物一般已经降低了朊病毒蛋白水平。例如在一些实施方式中，与其中白蛋白没有通过朊病毒除去过程净化的组合物相比，所述组合物具有小于大约50%、40%、30%、20%、10%、5%、 4%,3%,2%,1%或更少的任何一个的朊病毒蛋白。在一些实施方式中，与其中白蛋白没有通过朊病毒除去过程净化的组合物相比，所述组合物具有小大约1、2、2. 5、3、3. 5、4、4. 5、5、 6、7或8个对数的任何一个的朊病毒蛋白。在一些实施方式中，与其中白蛋白没有通过朊病毒除去过程净化的组合物相比，所述组合物具有小大约1、2、2. 5、3、3. 5、4、4. 5、5、6、7或 8个对数的任何一个的传染性。在一些实施方式中，本发明的组合物与其中白蛋白没有通过朊病毒除去过程净化的组合物生物等价。虽然本申请关注白蛋白，但是应当理解也考虑在血液或血浆中通常发现的其他蛋白质，其包括，但不限于，免疫球蛋白(包括IgA和IgG)、脂蛋白、载脂蛋白B、α酸糖蛋白、 β-2-巨球蛋白、甲状腺球蛋白、转铁蛋白、纤连蛋白、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X 等。本文提供的所有关于白蛋白的相关描述，就它们用于形成纳米颗粒的方面，同样适合这些其他蛋白质。制造不含朊病毒的纳米颗粒组合物的方法
另一方面，提供了产生不含朊病毒的纳米颗粒组合物的方法。例如，在一些实施方式中，提供了产生包含纳米颗粒的组合物的方法，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，所述方法包括使包括白蛋白溶液和有机相的混合物经历高剪切条件， 所述有机相包括分散在有机溶剂中的所述基本上不溶于水的药学活性剂，其中白蛋白通过包括从初始白蛋白组合物中除去朊病毒蛋白的方法获得。在一些实施方式中，提供了产生包含纳米颗粒的组合物的方法，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性齐U，所述方法包括使包括白蛋白溶液和有机相的混合物经历高剪切条件，所述有机相包括分散在有机溶剂中的所述基本上不溶于水的药学活性剂，其中白蛋白通过包括使初始白蛋白组合物和能够与朊病毒蛋白结合的配体接触的方法获得。在一些实施方式中，提供了产生包含纳米颗粒的组合物的方法，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性齐IJ，所述方法包括使包括白蛋白溶液和有机相的混合物经历高剪切条件，所述有机相包括分散在有机溶剂中的所述基本上不溶于水的药学活性剂，其中白蛋白通过如此方法获得， 所述方法包括a)使初始白蛋白组合物和能够与朊病毒蛋白结合的配体接触，和b)从初始组合物中除去配体和与其结合的蛋白质。在一些实施方式中，提供了产生包含纳米颗粒的组合物的方法，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，所述方法包括a)从初始白蛋白组合物中除去朊病毒蛋白；b)使包括溶液和有机相的混合物经历高剪切条件，所述溶液包括除去朊病毒的白蛋白，所述有机相包括分散在有机溶剂中的所述基本上不溶于水的药学活性剂。在一些实施方式中，提供了产生包含纳米颗粒的组合物的方法，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，所述方法包括a)使初始白蛋白组合物和能够与朊病毒蛋白结合的配体接触以引起在配体和朊病毒蛋白之间形成复合物，和b)从白蛋白初始组合物除去复合物；c)使包括溶液和有机相的混合物经历高剪切条件，所述溶液包括除去朊病毒的白蛋白，所述有机相包括分散在有机溶剂中的所述基本上不溶于水的药学活性剂。在一些实施方式中，提供了产生包含纳米颗粒的组合物的方法，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，所述方法包括a)使白蛋白溶液和能够与朊病毒蛋白结合的配体接触，b)从白蛋白溶液中除去配体和与其结合的蛋白质，c)使包括白蛋白溶液和有机相的混合物经历高剪切条件，所述有机相包括分散在有机溶剂中的所述基本上不溶于水的药学活性剂。在一些实施方式中，混合物基本上不含表面活性剂。可在形成纳米颗粒期间除去朊病毒。例如在一些实施方式中，提供了产生包含纳米颗粒的组合物的方法，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，所述方法包括a)使包括白蛋白溶液和有机相的混合物和能够与朊病毒蛋白结合的配体接触， 所述有机相包括分散在有机溶剂中的所述基本上不溶于水的药学活性剂。在一些实施方式中，方法进一步包括b)从混合物中除去配体和与其结合的蛋白质。在一些实施方式中，方法进一步包括C)使混合物经历高剪切条件。在一些实施方式中，方法进一步包括从混合物中除去有机溶剂。在一些实施方式中，混合物基本上不含表面活性剂。在一些实施方式中，提供了产生包含纳米颗粒的组合物的方法，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，所述方法包括a)使包括白蛋白溶液和有机相的混合物经历高剪切条件，所述有机相包括分散在有机溶剂中的基本上不溶于水的药学活性剂；和b)使混合物和能够与朊病毒蛋白结合的配体接触。在一些实施方式中，方法进一步包括c)从混合物中除去配体和与其结合的蛋白质。在一些实施方式中，方法进一步包括从混合物中除去有机溶剂。在一些实施方式中，混合物基本上不含表面活性剂。在一些实施方式中，提供了产生包含纳米颗粒的组合物的方法，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，所述方法包括使包括有机相和白蛋白溶液的混合物和能够与朊病毒蛋白结合的配体接触，所述有机相包括分散在有机溶剂中的所述基本上不溶于水的药学活性剂，其中混合物在和配体接触之前已经经历高剪切条件。在一些实施方式中，提供了产生包含纳米颗粒的组合物的方法，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，所述方法包括a)使包括有机相和白蛋白溶液的混合物经历高剪切条件，所述有机相包括分散在有机溶剂中的所述基本上不溶于水的药学活性剂，和b)使混合物和能够与朊病毒蛋白结合的配体接触。在一些实施方式中，方法进一步包括c)从混合物中除去配体和与其结合的蛋白质。在一些实施方式中，方法进一步包括d)从混合物中除去水相。在一些实施方式中，混合物基本上不含表面活性剂。在一些实施方式中，提供了产生包含纳米颗粒的组合物的方法，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，所述方法包括a)使包括有机相和白蛋白溶液的混合物经历高剪切条件，所述有机相包括分散在有机溶剂中的所述基本上不溶于水的药学活性剂，b)除去所述有机溶剂，和c)使除去有机溶剂的混合物和能够与朊病毒蛋白结合的配体接触。在一些实施方式中，方法进一步包括d)从混合物中除去配体和与其结合的蛋白质。在一些实施方式中，方法进一步包括d)从混合物中除去水相。在一些实施方式中，混合物基本上不含表面活性剂。在一些实施方式中，提供了产生包含纳米颗粒的组合物的方法，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，所述方法包括a)使包括有机相和白蛋白溶液的混合物经历高剪切条件，所述有机相包括分散在有机溶剂中的所述基本上不溶于水的药学活性剂，b)除去所述有机溶剂，c)添加白蛋白到混合物，和d)使混合物和能够与朊病毒蛋白结合的配体接触。在一些实施方式中，方法进一步包括e)从混合物中除去配体和与其结合的蛋白质。在一些实施方式中，方法进一步包括f)从混合物中除去水相。在一些实施方式中，混合物基本上不含表面活性剂。本文描述的方法一般包括使包括有机相和白蛋白溶液的混合物经历高剪切条件， 所述有机相包括分散在有机溶剂中的基本上不溶于水的药学活性剂。在一些实施方式中， 高剪切条件是高压勻浆作用，例如在大约3000到大约30，OOOpsi，包括例如大约6000到大约 25，OOOpsi、大约 9000 到大约 18，OOOpsi、大约 10，000 到大约 25，OOOpsi、大约 15，000 到大约25，OOOpsi范围内的压力下。在一些实施方式中，有机溶剂是基本上不能和水混合的有机溶剂(比如氯仿或二氯甲烷)和可溶于水的有机溶剂(比如可溶于水的醇，包括乙醇和叔丁醇)的混合物。在一些实施方式中，基本上不能和水混合的有机溶剂和可溶于水的有机溶剂的比例(ν/ν)(例如氯仿/乙醇或氯仿/ 丁醇的比例)大约为1 9、1 8、1 7、 1 6、1 5、1 4、1 3、1 2、1 1、2 1、3 1、4 1、5 1、6 1、7 1、8 1 或 9 1 的任何一个，或比例为大约 3 7、5 7、4 6、6 4、5 5、6 5、8 5、9 5、 9.5 5、5 3、7 3、6 4 或 9. 5 0. 5 的任何一个。在一些实施方式中，方法进一步包括从混合物中除去有机相(比如在减压情况下通过蒸发除去)。在一些实施方式中，方法进一步包括从混合物中除去水相。在一些实施方式中，方法进一步包括无菌过滤通过上述方法形成的纳米颗粒。在一些实施方式中，提供了从怀疑包含朊病毒蛋白的包含纳米颗粒的组合物中除去朊病毒蛋白的方法，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，所述方法包括a)使纳米颗粒组合物和能够与朊病毒蛋白结合的配体接触，b)从纳米颗粒组合物中除去配体和与其结合的蛋白质。在一些实施方式中，提供了从怀疑包含异常朊病毒蛋白的白蛋白组合物中除去朊病毒蛋白的方法，包括a)使包括白蛋白的组合物和能够与朊病毒蛋白结合的配体接触，b)从白蛋白组合物中除去配体和与其结合的蛋白质，其中所述白蛋白组合物用于产生包含纳米颗粒的组合物，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂。在一些实施方式中，提供了从包含纳米颗粒的组合物中除去朊病毒蛋白的方法， 所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，所述方法包括a)确定在组合物中存在或不存在朊病毒蛋白，b)使组合物和能够与朊病毒蛋白结合的配体接触，和c)从组合物中除去配体和与其结合的蛋白质。在一些实施方式中，本文描述方法的一个或多个步骤可以批式进行。在一些实施方式中，本文描述方法的一个或多个步骤可以以连续方式进行。形成纳米颗粒之前除去朊病毒在包含白蛋白的纳米颗粒组合物被制造之前，可从初始白蛋白组合物中除去朊病毒蛋白。一般地，方法包括使初始白蛋白组合物和能够与朊病毒蛋白结合的配体接触，并从白蛋白组合物中除去配体和与其结合的蛋白质。使用相同的或不同的配体，该过程可重复一次或多次。在朊病毒除去过程期间，还可同时使用两种或多种配体。在一些实施方式中，初始白蛋白组合物是血液源的组合物。例如在一些实施方式中，初始白蛋白组合物是全血、红细胞浓缩物、血浆、血清、血小板富集和血小板匮乏馏分、 血小板浓缩物、白细胞、血浆沉淀物、血浆分馏沉淀物和上清液、或血浆分馏中间物。在一些实施方式中，初始白蛋白组合物从人中获得。在一些实施方式中，初始白蛋白组合物来自动物比如牛、绵羊和啮齿类(比如小鼠、仓鼠和貂)。在一些实施方式中，初始白蛋白组合物从一群至少一些已经被朊病毒感染的个体中(比如人)获得。在一些实施方式中，初始白蛋白组合物从一群至少一些被怀疑已经被朊病毒感染的个体中(比如人)获得。在一些实施方式中，初始白蛋白组合物是从体液(比如血液)中通过本领域常见的任何各种方法和/或通过示差沉淀制备的白蛋白组合物，所述各种方法包括离子交换层析、亲和层析、凝胶渗透层析和/或疏水层析。在一些实施方式中，初始组合物是从血液 (比如人血液)中纯化的白蛋白组合物。在一些实施方式中，初始白蛋白组合物是从血清 (比如人血清)中纯化的白蛋白组合物。在一些实施方式中，初始白蛋白组合物具有大约 100IU-ic/ml、90IU-ic/ml、50IU-ic/ml 或 10IU_ic/ml 的朊病毒传染性。在一些实施方式中，初始白蛋白组合物中白蛋白的浓度为大约(w/v)，包括例如大约2^^3^^4%、5%、 6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25% 或 30%。 在朊病毒除去过程期间，使配体和初始白蛋白组合物接触并允许和在初始白蛋白组合物中的朊病毒蛋白结合。基于配体的性质和它的对朊病毒蛋白的结合特异性，可确定并优化适合结合的条件以促进配体和朊病毒蛋白的结合。在一些实施方式中，在大约0°C到大约39°C，包括例如大约20°C到大约25°C的温度下进行结合。在大约4到大约10、包括例
16如大约5到大约9、大约6到大约8、大约6. 8到大约7. 5、大约6. 9到大约7. 4或大约7的 PH下进行结合。任选地，封闭剂(blocking agent)可用于减少与配体的非特异性结合。接触步骤之后，从剩余的组合物中除去配体和与其结合的蛋白质。本文所用的术语“除去”指从包含白蛋白的组合物中分离配体和与其结合的蛋白质。根据配体和用于促进分离的支持材料(如有的话)的性质，可以以多种方式进行分离。例如配体和与其结合的蛋白质可通过层析法(色谱法)分离出，比如，但不限于，薄层层析、柱层析和分批层析； 固体支撑和膜分离；反应器分离；磁分离；免疫分离；胶体分离；沉降作用；沉淀作用；或离心。在一些实施方式中，配体可附着于支持材料比如珠或膜，其又允许接触初始白蛋白组合物。在足够引起形成朊病毒-配体复合物的条件下，固定配体的支持物被允许接触初始白蛋白组合物。固相接着从组合物中分开，借此从样品中除去和配体结合的朊病毒蛋白。例如，在一种示例性实施方式中，配体被固定在柱中，比如色谱柱中，样品(比如初始白蛋白组合物)接着由于重力或在压力下，比如在高压液体色谱柱中经过柱。样品中的朊病毒蛋白将与固定在柱上的配体结合，可收集流过的样品。使用相同的或不同的配体，该方法可重复数次以获得期望的结果。可调整柱中样品(比如初始白蛋白组合物)的流速，以使配体和样品中朊病毒蛋白的结合最大化。在一些实施方式中，以大约0. Iml每分钟到大约5. Oml每分钟、大约0. Iml 每分钟到大约2. 5ml每分钟、大约0. Iml每分钟到大约0. 25ml每分钟、大约0. 25每分钟到大约0. 5ml每分钟、大约0. 5ml每分钟到大约1. Oml每分钟、大约1. Oml每分钟到大约1. 5ml 每分钟、大约1. 5ml每分钟到大约2. Oml每分钟、大约2. Oml每分钟到大约2. 5ml每分钟、大约2. 5ml每分钟到大约3. Oml每分钟、大约3. Oml每分钟到大约3. 5ml每分钟、大约3. 5ml 每分钟到大约4. Oml每分钟、大约4. Oml每分钟到大约4. 5ml每分钟或大约4. 5ml每分钟到大约5. Oml每分钟，包括例如大约0. Iml每分钟、0. 25ml每分钟、0. 5ml每分钟、1. Oml每分钟、1. 5ml每分钟、1. 7ml每分钟、1. 8ml每分钟、1. 9ml每分钟、2. Oml每分钟、2. Iml每分钟、2. 3ml每分钟、2. 5ml每分钟、2. 7ml每分钟、3. Oml每分钟、3. 5ml每分钟、4. Oml每分钟、 4. 5ml每分钟或5. Oml每分钟的流速进行结合。在一些实施方式中，流速为至少大约IOml 每分钟，比如至少大约20ml每分钟、30ml每分钟、40ml每分钟、50ml每分钟的任何一个。在结合过程期间还可调整总流过体积或总流过时间以使配体和样品(比如初始白蛋白组合物)中的朊病毒蛋白结合最大化。在一些实施方式中，总流过体积是柱体积的大约1倍到大约1000倍，包括例如柱体积的大约2倍到大约10倍、柱体积的大约10倍到大约20倍、柱体积的大约20倍到大约30倍、柱体积的大约30倍到大约40倍、柱体积的大约40倍到大约50倍、柱体积的大约50倍到大约1000倍、柱体积的大约50倍到大约500 倍、柱体积的大约100倍到大约600倍或柱体积的大约200倍到大约800倍。在一些实施方式中，总流过体积是柱体积的大约100倍。在其他实施方式中，总流过体积是柱体积的大约 500倍。在一些实施方式中，总流过时间是大约1小时到大约30小时，包括例如大约2小时到大约25小时、大约3小时到大约20小时，或大约3小时到大约17小时。在一些实施方式中，总流过时间是大约3小时、4小时、6小时、8小时、10小时、12小时、14小时、16小时、 17小时、18小时、19小时或20小时的任何一个。在一些实施方式中，总流过时间大于大约 24小时。在一些实施方式中，总流过时间小于大约8小时，包括例如7、6、5、4、3、2、1或0. 5小时的任何一个。可选地，在足够引起形成朊病毒-配体复合物的条件下，配体可首先和初始白蛋白组合物接触。接着随后通过使用柱，比如基于亲和层析法除去朊病毒-配体复合物。为了促进分离，配体可与结合伴侣缀合，以便配体/朊病毒复合物可通过结合伴侣，例如由使用包含识别结合伴侣的分子的亲和柱除去。除了分批层析或柱层析，也考虑使用结合朊病毒蛋白的配体的许多其他构造、修改和变化。这些变化和修改包括，但不限于分批过程、连续过程、移动床层析过程(moving bed chromatography processes)；低压、中压或高压过程；或小规模、中规模或大规模过程。在一些实施方式中，配体在膜、纤维珠上，被浸渍入非丝织网中，或包含在过滤器罩 (filter housing)中的涂布纤维上。在一些实施方式中，除去步骤不显著导致产率损失和/或白蛋白性质和/或稳定性的改变。在一些实施方式中，在其初始生物状态的白蛋白的回收率基本上保持至少超过 50 %，包括例如80 %、90 %或更高水平。在一些实施方式中，从朊病毒除去过程中白蛋白的回收率高于大约80^^90^^95%或99%的任何一个。在一些实施方式中，在朊病毒除去步骤之前，调整或控制初始白蛋白组合物中白蛋白的浓度，以在该过程期间，使白蛋白的非特异性结合和损失最小化。例如白蛋白的浓度可在大约到大约50%、大约5%到大约 25%、大约5%到大约30%、大约5%到大约40%、大约5%到大约10%、大约10%到大约 15%、大约15%到大约20%、大约20%到大约25%、大约25%到大约30%等的范围内，包括例如大约5%、10%、15%、20%、25%或30%的白蛋白。可分析所得白蛋白组合物以测定朊病毒除去过程的清除率。还可分析具有结合的朊病毒蛋白的配体(直接或洗脱后)以测定清除率。基于朊病毒蛋白的减少或传染性的降低，评估朊病毒的除去。在一些实施方式中，至少大约50%，包括例如至少大约60%、70%、80%、90%、95%、99%或100%的朊病毒蛋白被从初始白蛋白组合物中除去。在一些实施方式中，除去后白蛋白组合物的传染性比初始白蛋白组合物的传染性至少小大约10 X、20 X、30 X、40 X、50 X、80 X、100 X、200 X、 500X、1000X、IO4X、IO5X、IO6X、IO7X、IO8X、IO9X。在一些实施方式中，连续传染性用于测定朊病毒除去过程的清除率。制备样品的连续稀释物，且检查稀释物的传染活性，例如在实验动物中。其中一半动物被感染的稀释是感染效价。例如如果需要5倍稀释，那么样品可定义为具有5对数的传染性。通过比较初始白蛋白组合物的对数传染性和除去后白蛋白组合物的对数传染性，技术人员可测定朊病毒除去过程的清除率。在一些实施方式中，朊病毒除去方法产生1、1. 1、1. 2,1. 3,1. 4,1. 5、 1. 6,1. 7,1. 8,1. 9、2、3或4、5、6、7、8、9或10对数的任何一个的传染性降低。在一些实施方式中，基于通过本文描述用于朊病毒除去方法的下列步骤利用传染性材料的外加实验(spiking experiments)，测定朊病毒除去过程的清除率。适合的外加剂包括，但不限于，脑勻浆、微粒体、细胞膜穴样结构域(caveolae-like domains)、纯化的 PrPsc和朊病毒原纤维。在一些实施方式中，外加剂是清洁剂溶解的(比如肌氨酰溶解的)。 在一些实施方式中，在组合物中外加比例在大约0. 001%到大约5%、大约0. 001%到大约0. 25%、大约0. 001%到大约0. 1%、大约0. 001%到大约0. 005%、大约0. 005%到大约 0. 075%、大约0. 075%到大约0. 01%、大约0. 01%到大约0. 1%、大约0. 到大约0. 5%,
18大约0.5%到大约0.75%、大约0. 75 %到大约1 %、大约1 %到大约2 %、大约2 %到大约3 % 或大约3%到大约5%的范围内，包括例如大约0. 001%,0. 005%,0. 075%,0. 01%,0. 1%, 0. 5%,0. 75%、1%、2%、3%或 5%o在一些实施方式中，减少系数(reduction factor, RF)用于测定朊病毒除去过程的清除率。可使用下列公式计算RF RF = (V1X T1) / (V2 X T2)或Log10 [RF] = [Log10 (V1) +Log10 (T1) ] - [Log10 (V2) +Log10 (T2)]。其中V1和T1分别是初始白蛋白组合物的体积和效价(titre)，和V2和T2是除去后白蛋白组合物的体积和效价。最终计算之后减少系数可四舍五入到1位小数。在一些实施方式中，减少系数至少大约 1. 0,1. 5,2. 0,2. 5,3. 0,3. 5,4. 0,4. 5,5. 0,5. 5,6. 0,6. 5,7. 0、 7. 5或8. Ologltl传染性的朊病毒蛋白被从初始白蛋白组合物中除去。例如在外加20%白蛋白组合物的0. 5%肌氨酰溶解的部分中朊病毒蛋白可被除去大于或等于2. 51og10的减少系数。作为另一个实例，在外加25%白蛋白组合物的0. 5%肌氨酰溶解的部分中朊病毒蛋白可被除去大于或等于2. Olog10的减少系数。可通过标准的蛋白质印迹分析评估朊病毒的除去。例如，结合后配体可首先用消化所有I^rPc但不消化PrPsc的蛋白酶K处理。消化物接着在SDS凝胶上电泳并转移印迹到硝化纤维或PVDF膜的片上。分离的I^rPsc带接着使用3F4或6H4可视化。3F4与来自人、 仓鼠和猫科的氨基酸残基109-112PrP反应。在一种示例性实施方式中，以0. 6ug/ml的浓度进行温育最少一个小时，其后，过量的抗体被冲洗掉并将膜与兔抗小鼠辣根过氧化物酶缀合物(1 1000稀释)温育最少一个小时。用TTBS大量冲洗之后，使用增强化学发光， 使膜显影。在一些实施方式中，根据《就vCJD风险研究血浆源医药产品的制造过程的指南》 中提供的标准(CPMP5136/03)，评估朊病毒蛋白的除去。能够和朊病毒蛋白和支持材料结合的配体本文使用的“配体”指和朊病毒蛋白或肽结合的分子。“能够与朊病毒蛋白结合的配体”指在适合的条件下和朊病毒蛋白特异性结合的配体。在一些实施方式中，配体和人朊病毒蛋白特异性结合。在一些实施方式中，配体和仓鼠朊病毒蛋白特异性结合。在一些实施方式中，配体和小鼠蛋白特异性结合。在一些实施方式中，配体和来自多物种的朊病毒蛋白结合。例如在一些实施方式中，配体和人朊病毒蛋白、仓鼠朊病毒蛋白和小鼠朊病毒蛋白
纟口口。在一些实施方式中，配体利用高结合亲和性和朊病毒蛋白(比如人朊病毒蛋白、 仓鼠朊病毒蛋白和/或小鼠朊病毒蛋白)结合。例如，在一些实施方式中，配体具有大于大约 107、108、109、1010 或 IO11 的任何一个的结合系数(Kassociation) 0已经识别许多可结合朊病毒蛋白的配体，并可因此用在本发明的方法中。见，例如 W004/090102、W004/050851、W006/010915 和 W006/044459。这些包括，例如特异性识别朊病毒蛋白的肽、化合物和抗体。配体可被用于从组合物中除去所有形式的朊病毒蛋白或可被选择性地选择以检测或除去单一形式的朊病毒蛋白。在一些实施方式中，用于除去朊病毒的配体是肽，比如在PCT公开申请号 W004/05051中描述的肽。例如在一些实施方式中，配体是具有在表1中显示的SEQ ID NOs 1-232任何一个的氨基酸的肽。在一些实施方式中，配体是三肽，比如具有SEQ ID NO :48、 102、105、108、109、110、111、143、148、193、194、195、202、203、204 或 210 任何一个的氨基酸序列的肽。在一些实施方式中，配体是具有6个氨基酸的肽，比如具有SEQ ID NO 152, 153、180、181、182、183、185、186、187、188、189 或 190 任何一个的氨基酸序列的六聚体 (6-mers)。在一些实施方式中，配体具有SEQ ID NO :150或151的氨基酸序列。表1-结合朊病毒序列的氨基酸序列
KIHKFLA (SEQ ID FLLIDTA (SEQ ID YEDQWQA (SEQ ID DNPIDA (SEQ ID
NO: 1)__NO: 41)__NO: 81)__NO: 121)_
GTHDFQA (SEQ ID GFLFKFA (SEQ ID EWADDNA (SEQ IDFNEHEA (SEQ ID
NO: 2)__NO: 42)__NO: 82)__NO: 122)_
KFGSTHA (SEQ ID PWTIYIA (SEQ ID YEIDYGA~(SEQ~ID WGADGA (SEQ ID
NO: 3)__NO: 43)__NO: 83)__NO: 123)_
FVNEIEA (SEQ ID WH (SEQ ID NO: EFGYFDA (SEQID VIYSHA (SEQ ID
NO: 4)__44)__NO: 84)__NO: 124)_
GLHFKSA (SEQ ID WW (SEQ ID NO: WGDEQDA (SEQ ID HlLEEA (SEQ~ID-
NO: 5)__45)__NO: 85)__NO: 125)_
GRVLHHA (SEQ ID LW (SEQ ID NO: 46)HEEDWAA (SEQ ID PHENFA (SEQ ID NO: 6)__ NO: 86)_ NO: 126)_
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权利要求
1.包含纳米颗粒的组合物，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性齐U，其中所述组合物基本上不含朊病毒蛋白。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物具有小于大约100fg/ml的朊病毒传染性。
3.根据权利要求1或2任一项所述的组合物，其中所述组合物具有小于大约lOIU-ic/ ml的朊病毒传染性。
4.根据权利要求1-3任一项所述的组合物，其中基于蛋白质错误折叠循环扩增(PMCA) 试验或基于IPCR试验，所述组合物显示不存在朊病毒蛋白。
5.根据权利要求1-4任一项所述的组合物，进一步包括能够结合朊病毒蛋白的痕量配体。
6.根据权利要求1-5任一项所述的组合物，进一步包括痕量支持材料。
7.包含纳米颗粒的组合物，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性齐U，其中在所述组合物中的白蛋白通过包括朊病毒除去过程的方法获得，所述朊病毒除去过程包括使初始白蛋白组合物和能够与朊病毒蛋白结合的配体接触。
8.根据权利要求7所述的组合物，其中所述朊病毒除去过程进一步包括从所述白蛋白和组合物中除去所述配体和与其结合的蛋白质。
9.根据权利要求8所述的组合物，其中所述配体是肽。
10.根据权利要求8所述的组合物，其中所述配体是基于三嗪的化合物。
11.产生包含纳米颗粒的组合物的方法，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，所述方法包括a)从初始白蛋白组合物中除去朊病毒蛋白；b)使包括溶液和有机相的混合物经历高剪切条件，所述溶液包括除去朊病毒的白蛋白，所述有机相包括分散在有机溶剂中的所述基本上不溶于水的药学活性剂。
12.根据权利要求11所述的方法，其中步骤a)包括1)使初始白蛋白溶液和能够与朊病毒蛋白结合的配体接触。
13.根据权利要求12所述的方法，其中步骤a)进一步包括 从所述白蛋白溶液中除去所述配体和与其结合的蛋白质。
14.根据权利要求11-13任一项所述的方法，进一步包括从所述混合物中除去所述有机溶剂。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述除去有机溶剂是通过蒸发作用。
16.根据权利要求12-15任一项所述的方法，其中所述配体是肽。
17.根据权利要求12-15任一项所述的方法，其中所述配体是基于三嗪的化合物。
18.根据权利要求11-17任一项所述的方法，其中所述初始白蛋白组合物是血液源产
19.产生包含纳米颗粒的组合物的方法，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，所述方法包括a)使包括有机相和白蛋白溶液的混合物经历高剪切条件， 所述有机相包括所述基本上不溶于水的药学活性剂，和b)从所述混合物中除去朊病毒蛋白。
20.根据权利要求19所述的方法，其中步骤b)包括1)使所述混合物和能够与朊病毒蛋白结合的配体接触。
21.根据权利要求20所述的方法，其中步骤b)进一步包括 从所述混合物中除去所述配体和与其结合的蛋白质。
22.根据权利要求20或21所述的方法，其中所述配体是肽。
23.根据权利要求20或21所述的方法，其中所述配体是基于三嗪的化合物。
24.通过权利要求11-23任一项的方法生产的组合物。
25.从怀疑包含朊病毒蛋白的包含纳米颗粒的组合物中除去朊病毒蛋白的方法，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，所述方法包括a)使所述组合物和能够与朊病毒蛋白结合的配体接触，b)从所述组合物中除去所述配体和与其结合的蛋白质。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述配体是肽。
27.根据权利要求25所述的方法，其中所述配体是基于三嗪的化合物。
28.包含纳米颗粒的组合物，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性齐U，所述组合物进一步包括能够与朊病毒蛋白结合的配体。
29.根据权利要求观所述的组合物，其中所述配体是肽。
30.根据权利要求观所述组合物，其中所述配体是基于三嗪的化合物。
31.根据权利要求1-10和M任一项所述的组合物用于治疗疾病的用途。
32.根据权利要求31所述的用途，其中所述疾病是癌症。
全文摘要
公开了不含朊病毒的组合物，其包含纳米颗粒，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药物。还提供了制造不含朊病毒的组合物的方法和从该纳米颗粒组合物中除去朊病毒蛋白的方法。还提供了使用该组合物的方法，以及可用于进行该方法的试剂盒。
文档编号G01N33/53GK102460167SQ201080026604
公开日2012年5月16日 申请日期2010年4月15日 优先权日2009年4月15日
发明者N·P·德塞, P·孙雄, V·裴科夫 申请人:阿布拉科斯生物科学有限公司
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