专利名称：水稻矮缩病毒三抗夹心酶联免疫吸附检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种水稻矮缩病毒三抗体夹心酶联免疫吸附检测试剂盒及其制备方 法，属于农业生物技术领域。
背景技术：
水稻矮缩病是水稻生产上的重要病害，曾在我国南方稻区爆发流行，造成严重的 产量损失。近年来，水稻矮缩病在滇中和滇东高原稻区及滇西南、滇南热带稻区发生蔓延， 易感品种最高发病率达90%以上，早期(秧苗期)感染导致难以抽穗，植株矮化枯死，引起 严重减产。水稻矮缩病由水稻矮缩病毒引起。水稻矮缩病毒(Rice dwarf virus, RDV)属于 呼肠孤病毒科(Reoviridae)植物呼肠孤病毒属(Wiytoreovirus)成员。RDV病毒粒子为等 轴粒体，直径约60-80nm，无刺突，无脂蛋白外膜包被，具双层的蛋白衣壳，内含单拷贝基因 组及病毒RNA转录酶和甲基化酶。共有12条长度不等的双连RNA，沉降系数50S，稀释限点 1 X 10_4-1 X ΙΟ"5,在4摄氏度下48hr保持侵染力。病毒基因组以超卷曲的形式包装在病毒 粒内，与蛋白质组成复合体。S1、S2、S3、S5、S7、S8和S9编码结构蛋白，S4、S6、S10、Sll和 S12别编码非结构蛋白。RDV由三种叶蝉传播，即黑尾叶蝉(Nephotettix cinctic印s)，二 条黑叶蝉(N. apicalis)，电光叶蝉，在田间以黑尾叶蝉为主。为加强水稻矮缩病的早期规模化快速诊断，加强其监测与预防，需要建立快速、准 确、灵敏的检测方法。目前的检测方法准确性差、灵敏度低，难于规模化生产。
发明内容
本发明提供一种水稻矮缩病毒三抗体夹心酶联免疫吸附测定(TAS--ELISA)检测 试剂盒，本发明利用提纯的水稻矮缩病毒制备效价高、特异性强的多克隆抗体和单克隆抗 体建立的TAS-ELISA检测试剂盒，具有准确性强、灵敏度高和规模化生产等优点。本发明的另一目的在于提供这种水稻矮缩病毒三抗体夹心酶联免疫吸附测定 (TAS-ELISA)检测试剂盒的制备方法。本发明提供的试剂盒包含阳性对照、阴性对照、水稻矮缩病毒多克隆抗体、水稻矮 缩病毒单克隆抗体、酶标抗体及其它材料和药品，将阳性对照、阴性对照、水稻矮缩病毒多 克隆抗体、水稻矮缩病毒单克隆抗体、酶标抗体及其它材料和药品组装，得到试剂盒，所说 的其它材料和药品包括被缓冲液、PBST、病毒抽提缓冲液、封闭缓冲液、底物缓冲液、底物、 5块酶标板及20个一次性滴管，其特征在于所述的水稻矮缩病毒多克隆抗体在分离提纯水 稻矮缩病毒后，通过家兔免疫分离血清得到；所述的水稻矮缩病毒单克隆抗体在分离提纯 水稻矮缩病毒后，通过小鼠免疫、细胞融合、克隆纯化得到。上述水稻矮缩病毒样品的采集和抽提缓冲液的制备在田间采集病株样品，经电 子显微镜和标准抗体检测含有大量水稻矮缩病毒且只含有该病毒，样品采集后放入_80°C 冰箱中保存备用。抽提缓冲液为0. 2M的PBS，其pH7. 4含0. 5%巯基乙醇，0. OlM EDTA。
病毒提纯液的提纯步骤如下1)取新鲜的感病叶片100g，加300mL的0. IM磷酸盐缓冲液，其PB，pH = 6. 4 ；2)勻浆器充分勻浆，三层尼龙纱布过滤；3)滤液中加入等体积的三氯甲烷，4°C搅拌15min，4°C，2500rpm离心15min ；4)取上清，加1/10体积的四氯化碳，4°C搅拌15min，4°C，2500rpm离心15min ；5)弃沉淀，上清中加入 6% (ff/V)PEG(MW6000),3% NaCl，4°C搅拌溶解，静置 2hr， 4°C，4500rpm 离心 20min ；6)弃上清，沉淀用少量 PB (0. 1M，PH = 6. 4)悬�。�4°C，4500rpm 离心 20min。7)重复步骤6)5-6次，合并上清；8)上清中加入 6% (ff/V)PEG(MW6000),3% NaCl 4°C搅拌溶解，4°C静置 4_8hr ；9)4°C，4500rpm 离心 20min ；10)弃上清，沉淀用 0. 1Μ、ρΗ = 6. 4 的 PB 悬�。�3mL/100mg ；11)用0.01M，pH6.4磷酸缓冲液分别配制20%、30%、40%和50%的蔗糖液(W/ W)。以 BECKMANSW28 转头的离心管按 7ml (20% )、7ml (30% )、8ml (40% )和 8ml (50% )的 比例由低浓度开始加入管中。用IOml注射器和长针头将蔗糖液依次注入离心管底部，最后 加:3ml 60% (W W)的蔗糖垫，形成由上至下，浓度由低到高的梯度柱，放置12-15小时后 使用。12)将所得悬浮液上密度梯度离心，经4°C，15000rpm，2hr条件下，收集乳白色环 带，所得溶液即为提纯的病毒制剂。13)该病毒提纯液电镜下观察含较大量的水稻矮缩病毒病毒粒子，未见杂质；紫 外分光光度仪上测定A260/A^0 = 0. 869，电镜负染法测相对纯度，_80°C保存备用。水稻矮缩病毒多克隆抗体的制备1)选用^g以上健康雄兔作为免疫动物，提纯水稻病毒稀释至lmg/mL作为免疫 抗原。取ImL病毒液于雄兔耳静脉注射，1周后再重复注射一次，依次重复注射4周后，第5 周耳静脉采血，采血后，分离血清，得水稻矮缩病毒多克隆抗体，分装于2mL无菌离心管中， 加入0. 1% NaN3, _80°C保存备用。2)抗体效价的测定稀释病毒提纯液至0. lmg/ml，备用。将上述抗血清倍比稀释 为1/10、1/20、1/40、1/80...... 1/20480，以间接ELISA法测定抗体效价，见表1。3)抗体灵敏度的测定稀释抗血清至lmg/ml，备用。将病毒提纯液稀释为lmg/ ml、lmg/ml 0· 0lmg/ml、0· 00lmg/ml、0· 000lmg/ml、0· 0000lmg/ml、0· 00000lmg/ml 以间接 ELISA法测定抗体灵敏度。结果与分析经四次免疫家兔后采血，分离得到40ml抗血清，间接ELISA法测的效 价为1 20480，工作效价为1 6000。最低检出浓度，也即检测灵敏度达0. 00001mg/ml。 水稻矮缩病毒单克隆抗体的制备1)用提纯的水稻矮缩病毒注射免疫BAL B/C小白鼠STU系3月龄雌鼠，取其脾细 胞使之与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合；2)取融合细胞培养上清，用间接ELISA方法筛选抗体阳性孔，选择呈强阳性反应 的细胞孔，进行有限稀释法克�。┐笈嘌螅糜诟顾票负鸵旱４妗＝峁秆〕鲆桓鏊景醪《竟闫椎タ寺】固逑赴辏浣覧LISA测定抗体效价为1 5000 10000。试剂盒的组装1)水稻矮缩病毒多克隆抗体上述制备的抗血清中加0. 叠氮化钠，作为防腐， 无菌分装后，密封、_80°C冷贮备用，每个试剂盒中ΙΟΟμΙ，使用时按1 500稀释；2)水稻矮缩病毒单克隆抗体上述制备的水稻矮缩病毒单克隆抗体中加0. 1% 叠氮化钠，作为防腐，无菌分装后，密封，4°C保存，备用；每个试剂盒中ΙΟΟμΙ，使用时按 1 500稀释；3)阳性对照所述的阳性对照为提纯的水稻矮缩病毒，用PBST稀释，浓度在 10 μ g/ml 20 μ g/ml ；4)阴性对照健康水稻叶片加PBST研磨后的汁液作为阴性对照；5)酶标抗体Sigma公司购买，分装，4 °C保存，备用。每个试剂盒中5μ 1(按 1 10000 稀释)；6)其他主要材料及药品按溶液体积称量分装，常温下保存.具体用量如下①包被缓冲液每个试剂盒中4. 52g(l. 59g Na2C03+2. 93g NaHCO3)；使用时，加 1000ml双蒸水，将1. 59g Na2CO3和2. 93g NaHCO3溶解于IOOOml双蒸水中，调pH值为9. 6 ；②PBST 每个试剂盒中90. 4g或124. 8g，使用时加8000ml双蒸水，加入0. 5%的 tween20 ；每 IOOOmlPBST含有(8. Og NaCl.O. 2g KH2PO4,0. 2g KCU2. 9g Na2HP042H20).或者 (8. Og NaCl、0. 2g KH2PO4,0. 2g KCl、7. 2g Na2HPO4. 12H20)；③病毒抽提缓冲液每个试剂盒中IOml (10ml PBST中溶解1. 3gNa2S03和0. 2g NaN3)，按1 100使用；使用时，加入1000ml PBST，调pH值为7. 4 ；④封闭缓冲液PBST中加入5%的脱脂奶粉，溶解，即用即配；⑤底物缓冲液每个试剂盒中IOml (IOm的10%乙二醇胺(pH = 9. 8)溶解500mg 底物)，按1 10使用；使用时用IOOml的10%乙二醇胺(pH = 9. 8)稀释；底物为硝基苯 磷酸盐(P-NPP)，500mg/留试剂盒；⑥酶标板5块，一次性滴管20个。水稻矮缩病毒的TAS-ELISA检测试剂盒的检测规程1)水稻矮缩病毒多抗血清(1 500)加入酶标板(包被缓冲液稀释)，每孔 100 μ 1，37 °C 下放置 3h。2) PBST洗板6次，快速3次，慢速3次(3min/次)，拍干。3)样品加入病毒抽提缓冲液(约5-10倍)研磨样品，加入酶标板，每孔ΙΟΟμΙ， 4 °C下放置过夜。4)同上洗板。5)每孔加入150 μ 1封闭缓冲液，37°C下放置30min。6)抛弃孔中液体，拍干。7)水稻矮缩病毒单抗(1 500) (PBST稀释)，加入酶标板，每孔100μ 1，37°C下放 置3h。8)同上洗板。9)羊抗鼠AP-IgG(l 10000) (PBST稀释)，加入酶标板，每孔100 μ 1，37°C下放置 3h.
10)同上洗板。11)用底物缓冲液溶解底物(lmg/ml)，加入酶标板，每孔100 μ 1，室温)下 至充分显色(每孔加入50 μ 1 IN NaOH终止显色)。肉眼或酶标仪读数。阴阳性判别、检测灵敏度与准确率比较应用酶标仪进行检测结果判别时，记录酶标仪在405nm波长下酶标板每孔的OD 数值，首先进行空白孔系统调零，若空白孔出现明显的颜色反应，或经空白孔调零后，系统 检测出现大量的负值时，整个系统测定无效；每一样品测定双孔的OD值应基本一致，若两 孔测定值差别较大(一般指同一样品相同稀释度两孔的OD值超过其均值的0. 5-1. 5倍范 围)，该酶标板测定无效。若阳性对照OD值低于或接近阴性对照OD值时，测定也无效。待 测样品OD值与阴性对照OD值检测之比大于等于2. 1时，待测样品为阳性，否则为阴性.肉 眼判别检测结果时，首先也是观察空白孔、阴性孔、阳性孔的颜色，若空白孔、阴性孔颜色较 深或阳性孔无颜色或颜色较浅时，则本块酶标板测定无效.目测待测样品颜色反应与阴性 对照颜色反应深浅对比，较深则为阳性，较浅则为阴性。检测灵敏度达到0. Olng/ml，与电镜检测结果比较准确率相符，比间接ELISA和 DAS-ELISA检测灵敏度提高100倍。本发明的优点是1)提供的水稻矮缩病毒的特异性抗体，运用TAS-ELISA能够高 度特异、准确、灵敏的检测水稻矮缩病毒；幻利用本发明所制备的试剂盒可有效地检测田 间作物水稻矮缩病毒的检测。
图1为提纯后在电镜下观察到大量的病毒粒体(bar = IOOnm)。图2为提纯得到的RDV于紫外分光光度计下测到典型的吸收峰值。
具体实施例方式本发明制备了水稻矮缩病毒的特异性强、灵敏度高、效价高的抗体，并应用其建立 了能够特异、准确、灵敏地检测水稻矮缩病毒的TAS-ELISA检测试剂盒。1.水稻矮缩病毒的分离提纯在田间采集典型水稻矮缩病株样品，经电子显微镜和PCR检测含有大量水稻矮缩 病毒，采集叶片，放入_80°C冰箱中保存备用。提纯步骤1)取新鲜的感病叶片IOOg,加300mL的0. IM磷酸盐缓冲液(PB, pH = 6. 4)；2)勻浆器充分勻浆，三层尼龙纱布过滤；3)滤液中加入等体积的三氯甲烷，4°C搅拌15min，4°C，2500rpm离心15min ；4)取上清，加1/10体积的四氯化碳，4°C搅拌15min，4°C，2500rpm离心15min ；5)弃沉淀，上清中加入 6% (ff/V)PEG(MW6000),3% NaCl，4°C搅拌溶解，静置 2hr， 4°C，4500rpm 离心 20min ；6)弃上清，沉淀用少量 PB (0. 1M，PH = 6. 4)悬浮，4°C，4500rpm 离心 20min。7)重复(6) 5-6次，合并上清；8)上清中加入 6% (ff/V)PEG(MW6000),3% NaCl 4°C搅拌溶解，4°C静置 4_8hr ；
9) 40C, 4500rpm 离心 20min ；10)弃上清，沉淀用 PB (0. 1M，pH = 6. 4)悬�。�3mL/IOOmg ；11)用0.01M，PH6.4磷酸缓冲液分别配制20%、30%、40%和50%的蔗糖液(W/ W)。以 BECKMANSW28 转头的离心管按 7ml (20% )、7ml (30% )、8ml (40% )和 8ml (50% )的 比例由低浓度开始加入管中。用IOml注射器和长针头将蔗糖液依次注入离心管底部，最后 加:3ml 60% (W W)的蔗糖垫，形成由上至下，浓度由低到高的梯度柱，放置12-15小时后 使用。12)将所得悬浮液上密度梯度离心G°C，15000rpm，a!r)，收集乳白色环带，所得 溶液即为提纯的病毒制剂。13)该病毒提纯液电镜下观察含较大量的水稻矮缩病毒病毒粒子，未见杂质，见 图1 ；病毒提纯液用PBS缓冲液稀释10倍于BECKMAN DU640型紫外分光光度仪上测定 190nm-450nm全波长扫描图、260nm和^Onm吸收值。纯化的RDV紫外吸收曲线最高峰在 220nm 230nm 间，为典型病毒扫描图，见图 2。A260 = 0. 6173，A280 = 0. 5656，A260/280 =1.091，提纯病毒的浓度为3.85%ig/ml，提纯病毒的产量为11. 5mg/100g病叶。-80°C保 存备用。2.水稻矮缩病毒多克隆抗体的制备1)选用^g以上健康雄兔作为免疫动物，提纯水稻病毒稀释至lmg/mL作为免疫 抗原。取ImL病毒液于雄兔耳静脉注射，1周后再重复注射一次，依次重复注射4周后，第5 周耳静脉采血，采血后，分离血清，得水稻矮缩病毒多克隆抗体，分装于2mL无菌离心管中， 加入0. 1% NaN3, _80°C保存备用。2)抗体效价的测定稀释病毒提纯液至0. lmg/ml，备用。将上述抗血清倍比稀释 为1/10、1/20、1/40、1/80...... 1/20480，以间接ELISA法测定抗体效价，见表1。3)抗体灵敏度的测定稀释抗血清至lmg/ml，备用。将病毒提纯液稀释为lmg/ ml、lmg/ml 0· 0lmg/ml、0· 00lmg/ml、0· 000lmg/ml、0· 0000lmg/ml、0· 00000lmg/ml 以间接 ELISA法测定抗体灵敏度。结果与分析经四次免疫家兔后采血，分离得到40ml抗血清，间接ELISA法测的效 价为1 20480，工作效价为1 6000。最低检出浓度(检测灵敏度)达0. 00001mg/ml。3.水稻矮缩病毒单克隆抗体的制备1)用提纯的水稻矮缩病毒注射免疫BAL B/C小白鼠STU系3月龄雌鼠，取其脾细 胞使之与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合；2)取融合细胞培养上清，用间接ELISA方法筛选抗体阳性孔，选择呈强阳性反应 的细胞孔，进行有限稀释法克�。┐笈嘌螅糜诟顾票负鸵旱４�。结果筛选出一个水稻矮缩病毒广谱单克隆抗体细胞株，间接ELISA测定抗体效 价为1 50000 100000。4.试剂盒的组装1)水稻矮缩病毒多克隆抗体上述制备的抗血清中加0. 叠氮化钠，作为防腐， 无菌分装后，密封、_80°C冷贮备用，每个试剂盒中ΙΟΟμΙ，使用时按1 500稀释；2)水稻矮缩病毒单克隆抗体上述制备的水稻矮缩病毒单克隆抗体中加0. 1% 叠氮化钠，作为防腐，无菌分装后，密封，4°C保存，备用；每个试剂盒中100μ1，使用时按1 500稀释；3)阳性对照所述的阳性对照为提纯的水稻矮缩病毒，用PBST稀释，浓度在 10 μ g/ml 20 μ g/ml ；4)阴性对照健康水稻叶片加PBST研磨后的汁液作为阴性对照；5)酶标抗体Sigma公司购买，分装，4 °C保存，备用。每个试剂盒中5μ 1(按 1 10000 稀释)；6)其他主要材料及药品按溶液体积称量分装，常温下保存.具体用量如下①包被缓冲液每个试剂盒中4. 52g(l. 59g Na2C03+2. 93g NaHCO3)；使用时，加 1000ml双蒸水，将1. 59g Na2CO3和2. 93g NaHCO3溶解于IOOOml双蒸水中，调pH值为9. 6 ；②PBST 每个试剂盒中90. 4g或124. 8g，使用时加8000ml双蒸水，加入0. 5%的 tween20 ；每 IOOOmlPBST 含有(8. Og NaCl.O. 2g KH2PO4,0. 2g KCU2. 9g Na2HPO4. 2H20) ·或 者(8. Og NaCl、0. 2g KH2PO4,0. 2g KCl、7· 2g Na2HPO4. 12H20)；③病毒抽提缓冲液每个试剂盒中IOmKlOml PBST中溶解1. 3gNa2S03和0. 2g NaN3)，按1 100使用；使用时，加入1000ml PBST，调pH值为7. 4 ；④封闭缓冲液PBST中加入5%的脱脂奶粉，溶解，即用即配；⑤底物缓冲液每个试剂盒中IOml (IOm的10%乙二醇胺(pH = 9. 8)溶解500mg 底物)，按1 10使用；使用时用IOOml的10%乙二醇胺(pH = 9. 8)稀释；⑥底物为硝基苯磷酸盐(P-NPP)，500mg/留试剂盒；⑦酶标板5块，一次性滴管20个。5.本试剂盒的田间检测水稻矮缩病毒的应用利用制备的水稻矮缩病毒TAS-ELISA检测试剂盒对田间水稻进行检测。从云南 寻甸、陆良、沾益、景洪、芒市、元江等地采集呈典型矮缩病症状的水稻样品，研磨至汁液产 生，按1 5倍稀释，然后用本发明所述的试剂盒检测，用健康株作阴性对照，用水稻矮缩 病毒感染的病株作阳性对照。结果表明，表现为病毒病症状的水稻样品均检测到了水稻矮 缩病毒，结果与电镜观察结果和RT-PCR检测结果一致，表明本发明所制备的水稻矮缩病毒 TAS-ELISA检测试剂盒能很好的用于田间水稻矮缩病毒检测。选取采集样品中的127个样品进行检测，其中检出阳性样品42个，检测结果见表 1。表1 RDV兔多抗血清效价I-ELISA检测结果
权利要求
1. 一种水稻矮缩病毒TAS-ELISA检测试剂盒，其特征在于该试剂盒由阳性对照、阴性 对照、水稻矮缩病毒多克隆抗体、水稻矮缩病毒单克隆抗体、酶标抗体及其它材料和药品， 将阳性对照、阴性对照、水稻矮缩病毒多克隆抗体、水稻矮缩病毒单克隆抗体、酶标抗体及 其它材料和药品组装得到，所说的其它材料和药品包括被缓冲液、PBST、病毒抽提缓冲液、 封闭缓冲液、底物缓冲液、底物、5块酶标板及20个一次性滴管，所述的水稻矮缩病毒多克 隆抗体在分离提纯水稻矮缩病毒后，通过家兔免疫分离血清得到；所述的水稻矮缩病毒单 克隆抗体在分离提纯水稻矮缩病毒后，通过小鼠免疫、细胞融合、杂交瘤细胞筛选和克隆纯 化得到；所述的水稻矮缩病毒通过采集含有水稻矮缩病毒病株样品、经检侧提纯得到；所述的水稻矮缩病毒采集检测过程为在田间采集水稻病株样品，经电子显微镜和标 准抗体检测含有大量水稻矮缩病毒，且只含有该病毒，样品采集后放入-80°C冰箱中保存备 用；所述的水稻矮缩病毒提纯的过程为1)取新鲜的感病叶片100g，加300mL的0.IM磷酸盐缓冲液(PB, pH = 6. 4)；2)勻浆器充分勻浆，三层尼龙纱布过滤；3)滤液中加入等体积的三氯甲烷，4°C搅拌15min，4°C，2500rpm离心15min；4)取上清，加1/10体积的四氯化碳，4°C搅拌15min，4°C，2500rpm离心15min；5)弃沉淀，上清中加入6%(W/V)PEG(MW6000)，3% NaCl，4°C搅拌溶解，静置2hr，4°C， 4500rpm 离心 20min ；6)弃上清，沉淀用少量PB(0. 1M，PH = 6. 4)悬�。�4°C，4500rpm离心20min。7)重复(6)5-6次，合并上清;8)上清中加入6% (ff/V)PEG(MW6000),3% NaCl 4°C 搅拌溶解，4°C 静置 4_8hr ；9)40C，4500rpm 离心 20min ；10)弃上清，沉淀用PB (0. 1M，pH = 6. 4)悬�。�3mL/100mg ；11)用0.01M，pH6.4磷酸缓冲液分别配制20^^30^^40%和50%的蔗糖液(W/W)。以 BECKMANSW28 转头的离心管按 7ml (20% )、7ml (30% )、8ml (40% )和 8ml (50% )的比例由 低浓度开始加入管中。用IOml注射器和长针头将蔗糖液依次注入离心管底部，最后加:3ml 60% (W W)的蔗糖垫，形成由上至下，浓度由低到高的梯度柱，放置12-15小时后使用；12)将所得悬浮液上密度梯度离心，在4°C，15000rpm，2hr条件下，收集乳白色环带，所 得溶液即为提纯的病毒制剂；13)该病毒提纯液电镜下观察含较大量的水稻矮缩病毒病毒粒子，未见杂质；紫外分 光光度仪上测定A260/A^0 = 0. 869，电镜负染法测相对纯度，_80°C保存备用；所述的水稻矮缩病毒多克隆抗体由以下过程制备得到选用^cg以上健康雄兔作为免疫动物，提纯水稻病毒稀释至lmg/mL作为免疫抗原， 取ImL病毒液于雄兔耳静脉注射，1周后再重复注射一次，依次重复注射4周后，第5周耳 静脉采血，采血后，分离血清，得水稻矮缩病毒多克隆抗体，分装于2mL无菌离心管中，加入 0. 1% NaN3, _80°C保存备用；所述的水稻矮缩病毒单克隆抗体由以下过程制备得到用提纯的水稻矮缩病毒注射免疫BAL B/C小白鼠STU系3月龄雌鼠，取其脾细胞使之与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合；取融合细胞培养上清，用间接ELISA方法筛选抗体阳性孔， 选择呈强阳性反应的细胞孔，进行有限稀释法克�。┐笈嘌螅糜诟顾票负鸵旱４�。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的试剂盒的组装为1)水稻矮缩病毒多克隆抗体上述制备的抗血清中加0.叠氮化钠，作为防腐，无菌 分装后，密封、_80°C冷贮备用，每个试剂盒中ΙΟΟμΙ，使用时按1 500稀释；2)水稻矮缩病毒单克隆抗体上述制备的水稻矮缩病毒单克隆抗体中加0.叠氮化 钠，作为防腐，无菌分装后，密封，4°C保存，备用；每个试剂盒中ΙΟΟμΙ，使用时按1 500 稀释；3)阳性对照所述的阳性对照为提纯的水稻矮缩病毒，用PBST稀释，浓度在10μ g/ ml 20 μ g/ml ；4)阴性对照健康水稻叶片加PBST研磨后的汁液作为阴性对照；5)酶标抗体=Sigma公司购买，分装，4°C保存，备用；每个试剂盒中5μ 1，使用时按 1 10000 稀释；6)其他主要材料及药品按溶液体积称量分装，常温下保存。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于所述的其他主要材料及药品具体用 量如下①包被缓冲液每个试剂盒中包括1.59g Na2C0jn2. 93g NaHCO3 ；使用时，加1000ml双 蒸水，将1. 59g Na2CO3和2. 93g NaHCO3溶解于IOOOml双蒸水中，调PH值为9. 6 ；②PBST每个试剂盒中90. 4g或124. 8g.使用时加8000ml双蒸水，加入0. 5 %的 tween20 ；每 IOOOmlPBST含有8. Og NaCl.O. 2g ΚΗ2Ρ04、0· 2gKCl、2. 9gNa2HP04 2H20或者8. Og NaCl、0.2g KH2P04、0.2g KC1、7. 2g Na2HPO4 12H20 ；③病毒抽提缓冲液每个试剂盒中IOml.由IOmlPBST中溶解1. 3gNa2S03* 0. 2g NaN3 得到，按1 100使用；使用时，调pH值为7. 4;④封闭缓冲液=PBST中加入5%的脱脂奶粉，溶解，即用即配；⑤底物缓冲液每个试剂盒中10ml，由pH为9.8的IOml的10%乙二醇胺溶解500mg 底物得到，底物为硝基苯磷酸盐，500mg/试剂盒。
全文摘要
本发明公开了一种水稻矮缩病毒三抗夹心酶联检测试剂盒，试剂盒包含阳性对照、阴性对照、水稻矮缩病毒多克隆抗体、水稻矮缩病毒单克隆抗体、酶标抗体及其它材料和药品，所说的其它材料和药品包括被缓冲液、PBST、病毒抽提缓冲液、封闭缓冲液、底物缓冲液、底物、5块酶标板及20个一次性滴管，水稻矮缩病毒多克隆抗体在分离提纯水稻矮缩病毒后，通过家兔免疫分离血清得到；所述的水稻矮缩病毒单克隆抗体在分离提纯水稻矮缩病毒后，通过小鼠免疫、细胞融合、克隆纯化得到；本发明制备的试剂盒检测灵敏度高、特异性强，可规模化生产用于水稻矮缩病的田间监测。
文档编号G01N33/577GK102128929SQ20101059248
公开日2011年7月20日 申请日期2010年12月16日 优先权日2010年12月16日
发明者丁铭, 张丽珍, 张仲凯, 方琦, 李婷婷, 李毅, 苏晓霞, 董家红, 陈永对 申请人:云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所
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