专利名称：一种鉴定抗体敏感性和克隆细胞株的方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗体技术领域。更具体地讲，本发明涉及一种抗体敏感性的鉴定方法，和抗体制备过程中，分泌目标抗体的阳性克隆细胞株的鉴定方法。
背景技术：
抗体是B细胞增殖分化为浆细胞所分泌的一类具有免疫功能的球蛋白，存在于体液中并介导体液免疫。抗体能与相应抗原(如病原体)特异性结合，在其他免疫分子和细胞的参与下发挥免疫效应。根据性质不同可将抗体分为单克隆抗体(以下简称单抗)和多克隆抗体(以下简称多抗)两种。单抗具有理化性状高度均一、生物活性单一、抗原结合特异性强、易于控制质量等优点，现已广泛应用于生物学和医学研究领域。单抗可作为亲合层析的配体、生物治疗的导向物、免疫抑制剂、研究工作中的探针等，广泛应用与研究、疾病的治疗和诊断。在临床检测方面主要用于诊断各类病原体，检测肿瘤特异性抗原和肿瘤相关抗原和检测淋巴细胞表面标志和测定机体微量成分。
在临床诊断中，单抗的质量直接决定了检测结果准确性，而单抗对其抗原的敏感性是反映单抗质量的重要指标。目前临床和科研中针对抗体敏感性的鉴定方法主要有ELISA (酶联免疫吸附试验)、Western-blot (免疫印迹)试验、免疫荧光试验，但这些方法均存在一定的不足。
ELISA和Western-blot检测试验中所使用的抗原蛋白为重组蛋白或通过裂解细胞获得的变性蛋白复合物，与天然构象蛋白都存在一定差异，因此这些实验结果反映出的仅是重组或变性蛋白与单抗的敏感性，而不能准确反映单抗与天然构象蛋白敏感性。尤其是如果该单抗所结合的抗原决定簇为构象表位，由于蛋白变性后空间结构被破坏，单抗则不能与此变性蛋白结合，采用此变性蛋白抗原检测结果就得到假阴性的错误结果。
免疫荧光试验包括直接免疫荧光试验和间接免疫荧光试验，其中间接免疫荧光试验需要借助于二抗来完成，这两个试验虽然能反映单抗与天然构象蛋白结合的能力，但由于其操作时间较长、操作步骤较为繁琐，同时需要高昂的试验设备，如荧光显微镜、流式细胞仪。
CN1660907A公开了单抗的三种鉴定方法，包括间接免疫荧光法、斑点免疫印迹法和金标记免疫电镜法，其中间接免疫荧光法和金标记免疫电镜法均需要高昂的设备配合进行结果的判断，斑点免疫印迹法借助硝酸纤维素膜作为固相载体进行抗原-抗体反应，需要通过获得细胞膜蛋白裂解液进行吸附，由于细胞膜蛋白裂解液中的蛋白发生了变性，因此鉴定结果不能反应单抗与天然构象蛋白的敏感性。
CN1718588A公开了一种单抗用于恶性肿瘤检测的方法，它是通过ELISA技术和免疫印迹技术实现的，ELISA试验技术是以重组蛋白作为抗原进行检测，免疫印迹试验技术是以变性的蛋白作为抗原进行的检测，两种试验技术均无法真实反映出单抗与天然构象蛋白的敏感性。
CN101891806A公开了一种单抗质量的筛选方法，是使用间接免疫荧光技术来实现的，间接免疫荧光试验的判定需要昂贵的荧光显微镜，一般的小型临床和科研机构的经济承受能力有限，这种方法不利于普及。
此外，在单抗的制备过程中，人们需要对抗体阳性克隆细胞株进行筛�。竦媚芊置诟呙舾行钥固宓目寺∠赴�。目前人们大多采用ELISA方法进行阳性克隆筛选。该方法一般使用重组蛋白作为抗原，筛选出的单抗往往并不适用于天然构象蛋白的结合反应，造成筛选失败，浪费人力物力。
CN1693461A公开了单抗制备过程中阳性克隆细胞株的筛选方法，是使用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)进行的，这种方法一般是使用重组蛋白作为抗原进行筛选，但是由于重组蛋白与天然构象蛋白有一定差异，因此通过ELISA筛选出的阳性克隆细胞株并不能真实反映单抗与天然构象蛋白的敏感性。
可见，现有的抗体和抗体阳性克隆细胞株的筛选方法，多数是通过抗体与重组蛋白或变性蛋白的结合水平反映抗体的敏感性。而在医学检验领域，多要利用抗体与天然构象蛋白的特异性结合力，为了准确快捷筛选出与天然构象蛋白结合能力强的单抗，需要一种新的试验技术来判断单抗的与天然构象蛋白的结合水平。发明内容
为了解决现有技术中的问题，本发明利用细胞，特别是细胞表面的天然构象的蛋白来鉴定抗体敏感性或鉴定阳性克隆细胞株。
本发明一方面提供了一种鉴定抗体敏感性的方法，包括如下步骤:
获取固相载体、细胞和抗体；
抗体吸附于固相载体；
细胞与吸附在固相载体的抗体孵育，保留细胞中与抗体结合的细胞；
对与抗体结合的细胞进行染色和细胞计数；
根据细胞计数结果鉴定抗体的敏感性。
本发明另一方面提供了一种鉴定克隆细胞株的方法，包括以下步骤:
获取固相载体、细胞和克隆细胞株的分泌的抗体；
将分泌的抗体吸附固相载体；
细胞与吸附在固相载体的抗体孵育，保留细胞中与抗体结合的细胞；
对与抗体结合的细胞进行染色和细胞计数；
根据细胞计数结果鉴定克隆细胞株。
本发明还一方面提供了一种以上方法进行抗体或克隆细胞株鉴定的试剂盒，包括，
固相载体，用于吸附待测抗体或克隆细胞株分泌的抗体；
抗体包被液，用于抗体吸附于固相载体；
细胞洗涤液，用于洗涤除去未与抗体结合的细胞；
染色液，用于染色与抗体结合的细胞。
本发明又一方面提供了一种鉴定抗体特异性的方法，包括，
获取固相载体、细胞和抗体，细胞包括至少已知两种细胞类型；
抗体吸附于固相载体；
细胞与吸附在固相载体的抗体孵育，保留细胞中与抗体结合的细胞；
对与抗体结合的细胞进行染色，并分别进行细胞计数；
通过比较不同细胞类型的已知细胞计数结果，鉴定抗体的特异性。
本发明利用活细胞表面表达的天然构象的抗原与待测抗体结合，并对细胞进行染色和计数，来鉴定抗体的敏感性，同时也可以鉴定抗体制备过程中克隆细胞株的质量。该方法可以直观地反映抗体与天然构象抗原的结合水平，结果更加准确，并减少阳性克隆细胞株筛选失败导致的人力和物力的浪费。另一方面，本发明的方法通过区分待测抗体结合的细胞类型，初步判断待测抗体的特异性。本方法简单、快捷、直观。
图1是实施方式中“城墙式”细胞计数法示意图。
图2是实施例1的鉴定结果图。
图3是实施例2的鉴定结果图。
图4是实施例3的鉴定结果图。
图5是实施例4的鉴定结果图。
图6是实施例5的鉴定结果图。
图7是实施例6的鉴定结果图。
图8是实施例7的鉴定结果图。
图9是实施例8的鉴定结果图。
具体实施方式
本发明的其它方面和优点在阅读以下描述和具体实施方案后将变得显而易见。
除另有说明外，本文中使用的术语具有以下含义。
本文中使用的术语“抗体”，在本文中以最广义使用并具体覆盖完整的单克隆抗体、多克隆抗体、由至少两种完整抗体形成的多特异性杭体(如双特异性抗体)、及抗体片段，只要它们显示所需生物学活性。
术语“单克隆抗体”在用于本文时指由基本上同质的抗体群获得的抗体，即构成群体的各个抗体相同，除了可能以极少量存在的可能的天然存在突变以外。另外，与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制品不同，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除了它们的特异性以外，单克隆抗体的优越性体现在可以通过杂交瘤培养合成它们而不受其它免疫球蛋白的污染。修饰语“单克隆”，指示抗体由基本上同质的抗体群获得的特征，并不解释为需要通过任何特定方法来生产抗体。
鉴定抗体敏感性的方法
技术领域：
本发明一方面提供了一种鉴定抗体敏感性的方法，包括以下步骤:
获取固相载体、细胞和抗体；
抗体吸附于固相载体；
细胞与吸附在固相载体的抗体孵育，保留细胞中与抗体结合的细胞；
对与抗体结合的细胞进行染色和细胞计数；
根据细胞计数结果鉴定抗体的敏感性。
获取固相载体、细胞和抗体。待鉴定的抗体为单克隆抗体或多克隆抗体，通常需要鉴定的抗体为单克隆抗体；固相载体选择应用最广泛的聚苯乙烯凹孔板，也可以选择本领域通用的材料，如纤维素、交联右旋糖酐等，外形上也可以用试管和珠粒等。
细胞可以是来自血液或组织中提取到的活细胞，例如外周血中提取的单个核细胞、淋巴细胞和白细胞，也可以是细胞培养的传代细胞。通常而言，进行抗体敏感性鉴定时，已知待测抗体是哪一种抗原或小分子的抗体，优选选择那些细胞表面表达较多该抗原或小分子的细胞。例如，已知淋巴细胞表面表达较多⑶3或⑶4抗原，在鉴定⑶3或⑶4抗体的敏感性时，优选使用淋巴细胞。白细胞各亚群的细胞表面都有CD45抗原的表达，在鉴定CD45抗体质量时，可以直接选用白细胞，无需进一步提取细胞亚群。
细胞的提�。梢允褂蒙桃迪赴崛∈约梁校凑掌渌得魇榈牟僮鞑街杼崛∠赴部梢允褂贸９娴姆椒ㄌ崛∠赴＠纾褂肞ercoll细胞分离液提取外周血单个核细胞，使用淋巴细胞分离液提取外周血淋巴细胞，使用红细胞溶血剂裂解红细胞后获得外周血中白细胞；培养的贴壁细胞先通过消化酶消化后再离心得到浓度较高的细胞，培养的悬浮细胞直接通过离心收集得到浓度较高的细胞。
一般而言，可以用商品化的淋巴细胞分离液提取淋巴细胞的方法如下:
取新鲜抗凝血ImL,与Hanks液1:1混勻；
将上述混匀后的液体小心加于2mL的淋巴细胞分离液之液面上，以1500 2000rpm/min分离心15分钟，此时离心管中由上至下细胞分四层，各层的分布为:第一层为血浆或组织匀浆层，第二层为环状乳白色淋巴细胞，第三层为透明分离液层，第四层为红细胞层；
收集第二层细胞放入含细胞洗涤液的试剂管中，充分混匀后，以1500 2000rpm/min离心10 30min,沉淀经反复洗2次即得所需细胞。
抗体吸附于固相载体。使用包被液将抗体制成抗体溶液,与固相载体接触,例如，将抗体溶液加入到聚苯乙烯多孔板，如96孔聚苯乙烯板的板孔中，放置于37°C孵育箱中I 2h或4度放置过夜。抗体与载体的吸附为物理吸附，靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用力，这种物理吸附是非特异性的，吸附的多少取决于PH值、温度、蛋白浓度、离子强度以及吸附时间。另外，固相载体对不同蛋白质的吸附能力是不同的，大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团，故更易吸附到固相载体表面。所使用的包被液有碳酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液等，优选碳酸盐缓冲液，pH范围为8 10，优选9 10，更优选9.5 10 ;离子强度为0.01 Imol/L，优选0.01 0.5mol/L,更优选0.05 0.lmol/L ;抗体在96孔聚苯乙烯板中的包被量为2 50ug/板,优选5 20ug/板,更优选5 IOug/板。
细胞与吸附了固相载体的抗体孵育，保留细胞中与抗体结合的细胞。将细胞制备成细胞悬液，浓度为为5 500cells/uL,优选10 100cells/uL,更优选50 80cells/uL。将获得的细胞悬液与吸附了抗体的固相载体接触，吸附到载体上的抗体通过与细胞表面抗原或小分子的直接结合使目标细胞被抓�。椅路跤欢问奔浜螅褂肏anks液进行洗涤，此时不含有与单抗相结合的抗原的细胞则被洗脱，含有与单抗相结合的抗原的细胞则被保留下来。抗体与活细胞结合的过程中，如选用96孔聚苯乙烯板作为载体，则每孔中加入的上述浓度的细胞悬液lOOul。抗体与细胞结合的条件一般为轻微振荡室温孵育Ih左右，优选20 40分钟，更优选20 30分钟。
抗体与活细胞反应结束后，使用细胞洗液将未与抗体结合的细胞洗脱，所使用的洗液种类有很多，包括PBS溶液、含有BSA的PBS溶液、含有小牛血清的PBS溶液，优选含有BSA的PBS溶液，其中BSA的浓度为0.1 lg/L。一般情况下如使用96孔聚苯乙烯板作为载体时，每次洗涤时加入细胞洗液的量为100 300uL，优选200uL。使用细胞洗液洗涤所反应的各个孔，每孔每次加入200uL细胞洗液,轻微吹打孔内液体,然后吸走孔内液体,重复洗涤3次，洗涤完毕后需要将孔内的洗液吸去进行后续的细胞染色。
对与抗体结合的细胞进行染色和细胞计数。使用细胞染料，例如核酸染料，对结合在固相载体上的活细胞进行染色。加入的核酸染料通过与细胞内核酸物质的结合，使细胞具有易于肉眼识别的颜色。所使用的核酸染料有甲基氯、瑞士吉姆萨、沙黄、苏木素等，优选甲基氯、瑞士吉姆萨和苏木素染料中的一种，其中甲基氯染料使用水配制而成，甲基氯水溶液的浓度为0.05% 5%，优选0.05% 1.5%，更优选为0.05-0.5%。瑞士吉姆萨和苏木素使用市场上销售的成品即可，细胞染色之前，首先使用4%中性甲醛固定液固定96孔聚苯乙烯板中结合的细胞，每孔加入固定液50uL，然后使用染色液进行染色，染色过程中孔中的液体无需倒掉，每孔直接再加入50 IOOuL染色液，室温放置5 15min，为促进染色，可用吹风机从孔底部加热l_2min，之后用塑料吸管吸去孔内的染色液，再使用塑料吸管加入纯水，重复“吸液一加纯水”2次，洗去染色液，最后96孔聚苯乙烯板倒扣去净孔内液体后进行细胞计数。整个计数过程是通过普通的倒置显微镜来实现的，采用“城墙式”细胞计数方法，通过观察显微镜下细胞的计数结果来判断此抗体敏感性的高低，细胞计数结果越多，待鉴定抗体的敏感性越高。可以通过设置阳性和阴性抗体对照来进一步提高鉴定的准确性。
鉴定克隆细胞株的方法
技术领域：
本发明还提供了一种鉴定克隆细胞株的方法。获得待鉴定克隆细胞株培养上清，其中含有分泌的抗体，使用上述鉴定抗体敏感性的方法，得到细胞计数结果，细胞越多说明该细胞株分泌的抗体与天然构象的抗原敏感性越好，从多株克隆中筛选计数结果高的进行扩大培养，有助于提到克隆细胞株筛选的成功率。
抗体或克隆细胞株鉴定的试剂盒
本发明还提供了适用于上述方法的鉴定试剂盒，包括固相载体，用于吸附待测抗体或克隆细胞株分泌的抗体；抗体包被液，用于抗体吸附于固相载体；细胞洗涤液，用于洗涤除去未与抗体结合的细胞；染色液，用于染色与抗体结合的细胞。具体固相载体、抗体包被液、细胞洗涤液、染色液的描述如前。
鉴定抗体特异性的方法
技术领域：
本发明还提供了一种鉴定抗体特异性的方法，包括获取固相载体、至少两种已知细胞类型的细胞、待鉴定抗体。将抗体吸附于固相载体，将细胞与吸附了固相载体的抗体孵育，保留与抗体结合的细胞，对与抗体结合的细胞进行染色，并分别进行细胞计数。具体步骤和试剂选择如前面方法中所述。比如，鉴定待测的CD14抗体的特异性时，可以使用淋巴细胞和单核细胞，用一种能区分这两类细胞的染料如瑞士吉姆萨染料对这两类细胞进染色，或者使用对淋巴细胞或单核细胞特异性的染料进行染色，通过比较两种细胞类型的计数结果，可以初步判断CD14抗体与单核细胞结合的特异性。由于单核细胞表面的CD14抗原表达明显多于淋巴细胞的，如果淋巴细胞的计数明显高于正常情况，则该待测抗体对⑶14抗原的特异性不够理想。比如，使用质量合格的CD14抗体鉴定，其淋巴细胞的计数结果为20个，而待测的CD14抗体的淋巴计数有50个，可以认为该待测抗体的特异性不理想。
实施例
以下将通过具体实施例对本发明作出进一步的描述。实施例仅对本发明作出示例性说明，并非对本发明作出任何意义上的限定。
除非另有声明，否则以下实施例中使用的试剂组分为分析纯，使用的溶剂为去离子水，所用的细胞计数设备为尼康ANT1-MOULD倒置显微镜。所述的细胞计数方法示意图如图1所示。显微镜下细胞放大倍数为100X10。以下实施例中所述的96孔聚苯乙烯板的规格为400uL/孔。
实施例一
将待测的鼠抗人⑶3单抗、已鉴定过的质量较好的鼠抗人⑶3单抗(阳性对照)和阴性对照鼠IgG (基本不与CD3抗原结合)均按照IOug/板包被96孔聚苯乙烯板，每个测试设置两个复孔，以PH 9.8的碳酸盐缓冲液作为包被液，37度孵育箱放置lh，取出96孔板，放置于干净毛巾上倒扣96孔板将孔内液体拍干后，加入已制备好的淋巴细胞悬液IOOuL/孔，淋巴细胞悬液的浓度为6X107/L，放置于摇床上室温轻微摇动30分钟，使用细胞洗液洗脱所反应的各个孔，每孔每次加入200uL细胞洗液，轻微吹打孔内液体，然后吸走孔内液体，重复洗涤3次，使用4%中性甲醛固定液固定96孔聚苯乙烯板中结合的细胞，每孔加入固定液50uL然后使用0.25%甲基氯染色，每孔直接再加入50uL甲基氯染色液，室温放置5min，之后使用塑料吸管吸去孔内的染色液，再使用塑料吸管加入纯水，重复“吸液一加纯水”2次，最后将96孔聚苯乙烯板倒扣去净孔内液体后进行显微镜下细胞计数。显微镜下细胞染色效果如图2所示，计数结果为待测抗体孔内细胞计数为248和257，阳性对照为240和245，阴性对照为23和17。淋巴细胞表面有⑶3抗原，利用淋巴细胞计数能够进行待测抗体针对CD3抗原敏感性的鉴定。
实施例二
将两株待测的鼠抗人⑶4抗体细胞株培养上清和阴性对照鼠IgG按照5ug/板包被96孔聚苯乙烯板，每个测试设置两个复孔，以pH 9.0的碳酸盐缓冲液作为包被液，37度孵育箱放置1.5h，取出96孔板，放置于干净毛巾上倒扣96孔板将孔内液体拍干后，加入已制备好的淋巴细胞悬液IOOuL/孔，淋巴细胞悬液的浓度为6X 108/L，放置于摇床上室温轻微摇动I小时，使用细胞洗液洗脱所反应的各个孔，每孔每次加入200uL细胞洗液，使用200uL量程的移液器轻微吹打孔内液体，然后吸走孔内液体，重复洗涤3次，使用4%中性甲醒固定液固定96孔聚苯乙烯板中结合的细胞,每孔加入固定液50uL然后使用0.05%甲基氯染色，每孔直接再加入IOOuL甲基氯染色液，室温放置3min，之后使用塑料吸管吸去孔内的染色液，再使用塑料吸管加入纯水，重复“吸液一加纯水”2次，最后将96孔聚苯乙烯板倒扣去净孔内液体后进行显微镜下细胞计数。显微镜下细胞染色效果如图3所示，计数结果为第一株⑶4抗体为110和117，第二株⑶4抗体为24和27，阴性对照为10和17。淋巴细胞表面有CD4抗原，利用淋巴细胞能够进行待测克隆细胞株的筛�。冉狭礁鱿赴甑南赴剖峁芍谝桓鱿赴攴置诘腃D4抗体的能力和/或敏感性比较好，可用于进一步的扩大培养。
实施例三
将待测的鼠抗人⑶45单抗、已鉴定质量较好的Ebioscience公司的鼠抗人⑶45抗体和阴性对照鼠IgG按照20ug/板包被96孔聚苯乙烯板，每个测试设置两个复孔，以pH9.0的Tris-HCl缓冲液作为包被液，4度冰箱放置过夜，取出96孔板，放置于干净毛巾上倒扣96孔板将孔内液体拍干后，加入已制备好的白细胞悬液IOOuL/孔，白细胞悬液的浓度为7.2X108/L，放置于摇床上室温轻微摇动I小时，使用细胞洗液洗脱未与单抗结合的细胞，每孔每次加入200uL细胞洗液，使用200uL量程的移液器轻微吹打孔内液体，然后吸走孔内液体，重复洗涤3次，使用4 %中性甲醛固定液固定ELISA板中结合的细胞，每孔加入固定液50uL然后使用0.2 %甲基氯染色，每孔直接再加入IOOuL甲基氯染色液，室温放置3min，之后使用塑料吸管吸去孔内的染色液，再使用塑料吸管加入纯水，重复“吸液一加纯水” 2次，最后将96孔聚苯乙烯板倒扣去净孔内液体后进行显微镜下细胞计数。显微镜下细胞染色效果如图4所示，计数结果为待测⑶45抗体为653和662，ebioscience公司的⑶45抗体为630和625，阴性对照为12和15。已知各白细胞亚群的细胞表面都有⑶45抗原的表达，因此利用白细胞计数结果能够进行待测抗体针对CD45抗原敏感性的鉴定。
实施例四
将待测的鼠抗人⑶45单抗、已鉴定质量较好的Ebioscience公司的鼠抗人⑶45抗体和阴性对照鼠IgG分别按照IOug/板包被96孔聚苯乙烯板，每个测试设置两个复孔，以PH 9.6的碳酸盐缓冲液作为包被液，4度冰箱放置过夜，取出96孔板，放置于干净毛巾上倒扣96孔板将孔内液体拍干后，加入已制备好的白细胞悬液IOOuL/孔，白细胞悬液的浓度为5 X 107/L，放置于摇床上室温轻微摇动20分钟，使用细胞洗液洗脱未与单抗结合的细胞，每孔每次加入200uL细胞洗液，使用200uL量程的移液器轻微吹打孔内液体，然后吸走孔内液体，重复洗涤3次，使用4%中性甲醛固定液固定96孔聚苯乙烯板中结合的细胞，每孔加入固定液50uL然后使用瑞士吉姆萨染色,每孔直接再加入IOOuL瑞士吉姆萨染色液，室温放置15min，之后使用塑料吸管吸去孔内的染色液，再使用塑料吸管加入纯水，重复“吸液一加纯水”2次，最后将96孔聚苯乙烯板倒扣去净孔内液体后进行显微镜下细胞计数。显微镜下细胞染色效果如图5所示，计数结果为待测⑶45抗体为420和430，Ebioscience公司的CD45抗体为410和425，阴性对照为10和14。不同的核酸染料，只要能够对目标细胞进行合适的染色，都可以用于本发明的方法。
实施例五
将待测的鼠抗人⑶45单抗、已鉴定质量较好的Ebioscience公司的鼠抗人⑶45抗体和阴性对照鼠IgG分别按照IOug/板包被96孔聚苯乙烯板，每个测试设置两个复孔，以PH 9.6的碳酸盐缓冲液作为包被液，4度冰箱放置过夜，取出96孔板，放置于干净毛巾上倒扣96孔板将孔内液体拍干后，加入已制备好的白细胞悬液IOOuL/孔，白细胞悬液的浓度为6 X 107/L，放置于摇床上室温轻微摇动20分钟，使用细胞洗液洗脱未与单抗结合的细胞，每孔每次加入200uL细胞洗液，使用200uL量程的移液器轻微吹打孔内液体，然后吸走孔内液体，重复洗涤3次，使用4%中性甲醛固定液固定96孔聚苯乙烯板中结合的细胞，每孔加入固定液50uL然后使用苏木素染色,每孔直接再加入IOOuL苏木素染色液,室温放置15min，之后使用塑料吸管吸去孔内的染色液，再使用塑料吸管加入纯水，重复“吸液一加纯水” 2次，最后将96孔聚苯乙烯板倒扣去净孔内液体后进行显微镜下细胞计数。显微镜下细胞染色效果如图6所示，计数结果为待测⑶45抗体为550和561，ebioscience公司的CD45抗体为541和555，阴性对照为15和17。不同的核酸染料，只要能够对目标细胞进行合适的染色，都可以用于本发明的方法。
实施例六
将待测的鼠抗人⑶45单抗、已鉴定质量较好的Ebioscience公司的鼠抗人⑶45抗体和阴性对照鼠IgG分别按照IOug/板包被96孔聚苯乙烯板，每个测试设置两个复孔，以PH 9.6的碳酸盐缓冲液作为包被液，4度冰箱放置过夜，取出96孔板，放置于干净毛巾上倒扣96孔板将孔内液体拍干后，加入已制备好的白细胞悬液IOOuL/孔，白细胞悬液的浓度为6 X IO7ZU放置于摇床上室温轻微摇动20分钟，使用细胞洗液洗脱未与单抗结合的细胞，每孔每次加入200uL细胞洗液，使用200uL量程的移液器轻微吹打孔内液体，然后吸走孔内液体，重复洗涤3次，使用4%中性甲醛固定液固定96孔聚苯乙烯板中结合的细胞，每孔加入固定液50uL然后使用沙黄染色，每孔直接再加入IOOuL沙黄染色液，室温放置15min，之后使用塑料吸管吸去孔内的染色液，再使用塑料吸管加入纯水，重复“吸液一加纯水” 2次，最后将96孔聚苯乙烯板倒扣去净孔内液体后进行显微镜下细胞计数。显微镜下细胞染色效果如图7所示，计数结果为待测⑶45抗体为525和531，ebioscience公司的⑶45抗体为536和531，阴性对照为14和17。不同的核酸染料，只要能够对目标细胞进行合适的染色，都可以用于本发明的方法。
实施例七
将待测的鼠抗人⑶19单抗、参比公司的鼠抗人⑶19单抗和阴性对照鼠IgG分别按照20ug/板包被96孔聚苯乙烯板，每个测试设置两个复孔，以pH 10.0的碳酸盐缓冲液作为包被液，37度孵育箱放置2h，取出96孔板，放置于干净毛巾上倒扣96孔板将孔内液体拍干后，加入已制备好的淋巴细胞悬液IOOuL/孔，淋巴细胞悬液的浓度为6X10VL，放置于摇床上室温轻微摇动20分钟，使用细胞洗液洗脱未与单抗结合的细胞，每孔每次加A 200uL细胞洗液，使用200uL量程的移液器轻微吹打孔内液体，然后吸走孔内液体，重复洗涤3次，使用4%中性甲醛固定液固定96孔聚苯乙烯板中结合的细胞，每孔加入固定液50uL然后使用0.2%甲基氯染色，每孔直接再加入IOOuL加基础氯染色液，室温放置5min，之后使用塑料吸管吸去孔内的染色液，再使用塑料吸管加入纯水，重复“吸液一加纯水” 2次，最后将96孔聚苯乙烯板倒扣去净孔内液体后进行显微镜下细胞计数。显微镜下细胞染色效果
如图8所示，计数结果为待测⑶19单抗为25和21，参比公司的⑶19单抗为125和130，阴性对照为16和14。可见，本方法既可以检测敏感性高的抗体，也可以检测出敏感性低的抗体，具有良好的通用性。
实施例八
将待测的鼠抗人⑶3单抗、参比公司的鼠抗人⑶3单抗和阴性对照鼠IgG分别按照IOug/板包被96孔聚苯乙烯板，每个测试设置两个复孔，以pH 9.0的碳酸盐缓冲液作为包被液，37度孵育箱放置1.5h，取出96孔板，放置于干净毛巾上倒扣96孔板将孔内液体拍干后，加入已制备好的淋巴细胞悬液IOOuL/孔，淋巴细胞悬液的浓度为5 X IQ1ZL,放置于摇床上室温轻微摇动30分钟，使用细胞洗液洗脱未与单抗结合的细胞，每孔每次加入200uL细胞洗液，使用200uL量程的移液器轻微吹打孔内液体，然后吸走孔内液体，重复洗涤3次，使用4%中性甲醒固定液固定96孔聚苯乙烯板中结合的细胞,每孔加入固定液50uL然后使用苏木素染色，每孔直接再加入IOOuL苏木素染色液，室温放置15min，之后使用塑料吸管吸去孔内的染色液，再使用塑料吸管加入纯水，重复“吸液一加纯水”2次，最后将96孔聚苯乙烯板倒扣去净孔内液体后进行显微镜下细胞计数。显微镜下细胞染色效果如图9所示，计数结果为待测⑶3单抗为51和42，参比公司的⑶19单抗为251和254，阴性对照为19和13。可见，本方法既可以检测敏感性高的抗体，也可以检测出敏感性低的抗体，具有良好的通用性。
本发明利用活细胞表面表达的天然构象的抗原与待测抗体结合，并对细胞进行染色和计数，来鉴定抗体的敏感性，同时也可以鉴定抗体制备过程中克隆细胞株的质量。该方法可以直观地反映抗体与天然构象抗原的结合水平，结果更加准确，并减少阳性克隆细胞株筛选失败导致的人力和物力的浪费。另一方面，本发明的方法通过区分待测抗体结合的细胞类型，初步判断待测抗体的特异性。本方法简单、快捷、直观。以上实施例证明，本发明的方法具有良好的通用性。
本文中的所有数据、图像、仪器、试剂和步骤应理解为说明性而非限制性的。虽然已结合上述具体实施方案描述了本发明，许多修改和其它变化对于本领域技术人员是显而易见的。所有这种修改和其它变化也落入本发明的精神和范围内。
权利要求
1.一种鉴定抗体敏感性的方法，包括以下步骤: 获取固相载体、细胞和抗体； 所述抗体吸附于所述固相载体； 所述细胞与吸附在所述固相载体的抗体进行孵育，保留所述细胞中与抗体结合的细胞； 对与抗体结合的细胞进行染色和细胞计数； 根据细胞计数结果鉴定所述抗体的敏感性。
2.一种鉴定克隆细胞株的方法，包括以下步骤: 获取固相载体、细胞和克隆细胞株的分泌的抗体； 将所述分泌的抗体吸附所述固相载体； 所述细胞与吸附在所述固相载体的抗体孵育，保留所述细胞中与抗体结合的细胞； 对与抗体结合的细胞进行染色和细胞计数； 根据细胞计数结果鉴定克隆细胞株。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:根据细胞计数结果鉴定所述抗体的敏感性，细胞数量多的抗体敏感性高；根据细胞计数结果鉴定克隆细胞株，细胞数量多的克隆细胞株质量好。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述细胞来自人体或动物体液中的细胞，或者人工培养的原代细胞，或者人工培养的传代细胞。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述人体或动物体液中的细胞选自红细胞、白细胞、血小板，优选白细胞中的淋巴细胞亚群。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述抗体选自单克隆抗体，优选选自抗细胞表面抗原的单克隆抗体，更优选抗淋巴细胞表面抗原的单克隆抗体。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述固相载体选自纤维素载体、交联右旋糖酐载体、聚苯乙烯载体。
8.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述细胞制备成细胞悬浮液，所述细胞悬液的浓度为5-500个细胞/微升，优选10-100个细胞/微升，更优选50-80个细胞/微升。
9.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述细胞与所述抗体在20°C-25V孵育I小时，优选20-40分钟，更优选20-30分钟。
10.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于:吸附时使用包被液与所述抗体混合，所述包被液的PH值为pH6-8，优选9-10，更优选9.5-10。
11.根据权利要求10所述方法，其特征在于:所述包被液的离子浓度为0.01-lmol/L,优选 0.01-5mol/L,更优选 0.05-0.lmol/L。
12.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于:使用染色液对与抗体结合的活细胞进行染色，所述染色液中的染料选自甲基氯、瑞士吉姆萨、沙黄、苏木素中的至少一种。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于:所述甲基氯配制为甲基氯水溶液，浓度为 0.05% -5%，优选 0.05-1.5%，更优选 0.05% -0.5%0
14.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述染色前，先将所述与抗体结合的活细胞固定。
15.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于:还包括设置阳性和/或阴性对照， 获取已知敏感性的抗体作为阳性和/或阴性抗体； 所述阳性和/或阴性抗体吸附于固相载体； 所述细胞与吸附在所述固相载体的所述阳性和/或阴性抗体孵育，保留所述细胞中与抗体结合的细胞； 对与抗体结合的细胞进行染色和细胞计数。
16.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述细胞计数为显微镜下进行的细胞计数。
17.一种使用权利要求1或2的方法进行抗体或克隆细胞株鉴定的试剂盒，包括， 固相载体，用于吸附待测抗体或克隆细胞株分泌的抗体； 抗体包被液，用于抗体吸附于所述固相载体； 细胞洗涤液，用于洗涤除去未与抗体结合的细胞； 染色液，用于染色与抗体结合的细胞。
18.根据权利要求17所述的试剂盒，其特征在于:还包括细胞固定液，用于固定与抗体结合的细胞。
19.一种鉴定抗体特异性的方法，包括， 获取固相载体、细胞和抗体，所述细胞包括至少已知两种细胞类型； 所述抗体吸附于所述固相载体； 所述细胞与吸附在固相载体的抗体孵育，保留所述细胞中与抗体结合的细胞； 对与抗体结合的细胞进行染色，并分别进行细胞计数； 通过比较不同已知细胞 型的细胞计数结果，鉴定抗体的特异性。
全文摘要
本发明公开了一种鉴定抗体敏感性的方法，同时也可以鉴定抗体制备过程中克隆细胞株的质量。本方面包括获取固相载体、细胞和抗体，将抗体吸附于固相载体上，将细胞与吸附在固相载体上的抗体孵育，保留细胞中与抗体结合的细胞，对于抗体结合的细胞进行染色和细胞计数，根据细胞计数结果鉴定抗体的敏感性或克隆细胞株质量。本发明还提供一种适用于本方法的试剂盒。该方法直观地反映抗体与天然构象抗原的结合水平，鉴定方法简便、快捷、直观。
文档编号G01N33/68GK103185803SQ20111045953
公开日2013年7月3日 申请日期2011年12月31日 优先权日2011年12月31日
发明者赵玉梅, 董丽芳, 雷霆 申请人:深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司, 北京深迈瑞医疗电子技术研究院有限公司
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