专利名称：一种非标记检测dna结合蛋白的芯片及其制备、应用方法
技术领域：
本发明涉及的是一种非标记检测DNA结合蛋白的芯片及其制备、应用方法。这里的DNA结合蛋白主要是指具有特异的DNA结合序列的调控因子。该芯片可以对多个DNA结合蛋白同时进行检测，具有高通量、高灵敏、直观、制备简单、成本低、无需标记蛋白质等优点。
目前用于研究DNA与蛋白质的方法很多，如凝胶迁移率分析(EMSA)、足迹法(foot-printing)等。虽然这些常规的方法在序列特异性的DNA结合蛋白的研究中发挥了重大的作用，但它们工作量大、很费时间，操作中容易造成放射性物质的污染，而且还无法进行高通量的检测。最近在《自然·生物技术》(Nature Biotechnology)杂志上报道了一种新型的分子信标(Molecular Beacon)的方法检测DNA结合蛋白，该方法避免了放射性物质的污染，检测方便，但还是无法进行高通量操作。基因芯片，又称DNA芯片，由于它的方便、快捷可以进行大规模操作等优点在基因的表达谱分析、单碱基多态性(SNP)检测等方法中已经有了广泛的应用。但大多数DNA结合蛋白只和特异序列的双链DNA结合。美国Affymetrix公司以及东南大学吴健雄实验室先后发展了若干新型的双链DNA芯片，可以对多个DNA结合蛋白进行大规模的检测。但这些方法在检测前必须对蛋白质进行荧光分子标记，这样在标记的过程中可能导致低丰度蛋白质的丢失，不利于提高检测效率和灵敏度。
本发明一种非标记检测DNA结合蛋白的芯片及其制备、应用方法是采取以下方案实现的本发明的非标记检测DNA结合蛋白的芯片，其特征在于结构具有双链寡核苷酸探针，双链寡核苷酸探针的序列是针对被检测的DNA结合蛋白的特异性DNA识别序列而设计的，在含有待测DNA结合蛋白的识别位点的之间分成两条带有粘性末端的半位点片段即探针1和探针2，其中一条双链寡核苷酸片段即探针1固定在基底上，而另一条双链寡核苷酸片段即探针2上引入标记物。
该非标记检测DNA结合蛋白的芯片制备方法，其特征在于(1)根据待检测的DNA结合蛋白的特异性结合序列设计双链寡核苷酸探针，在DNA结合蛋白的识别位点之间将其分成两个含有粘性末端的半位点片段探针1和探针2，两条探针可以通过粘性末端进行杂交；(2)将其中一条双链寡核苷酸片段即探针1固定在基底上，而另一条双链寡核苷酸片段即探针2上引入标记物；或者探针2不标记任何荧光基团，而是将其远离半位点5’端设计成突出的粘末端，突出末端的碱基序列中含有若干腺嘌呤(A)。
该非标记检测DNA结合蛋白的芯片，其探针1固定的基底采用微球、尼龙膜、醋酸纤维素膜、塑料、橡胶、陶瓷或玻璃片等；其探针2上所引入的标记物为荧光分子基团、生物素、纳米颗粒等。
该非标记检测DNA结合蛋白的芯片中用于DNA结合蛋白检测的双链寡核苷酸探针，可根据不同DNA结合蛋白的特异性结合序列，设计多个包含有不同的蛋白识别序列的固定化探针，并构成微阵列芯片。
该非标记检测DNA结合蛋白的芯片，其特征在于探针1和探针2的粘性末端即互补杂交序列长度控制在2～10个碱基，其序列为被检测蛋白的DNA特异性结合序列中的一部分。
本发明非标记检测DNA结合蛋白的芯片的应用方法，其特征在于(1)将标记的探针2加入到含有待检测DNA结合蛋白的溶液中进行预作用；(2)将上述溶液与制备好的双链寡核苷酸固定化探针或双链寡核苷酸微阵列芯片杂交，在DNA结合蛋白特异性识别的作用下，探针2特异性杂交结合在与其互补的固定化探针1上；(3)通过缓冲液对杂交后固相化探针或微阵列芯片上的非特异性吸附物进行洗脱，将非特异性结合的蛋白质和探针2从芯片上洗脱下来；(4)对洗脱后固相化探针或微阵列芯片上的标记物进行检测；或者用DNA聚合酶法在探针2远离半位点3’端设掺入标记的脱氧尿嘧啶三磷酸腺苷(dUTP)，然后进行标记物检测；当待测的DNA结合蛋白存在时，探针1和探针2的结合效率很高，可以在探针1的位置上检测到探针2的标记物，反之，标记物的信号很弱，由此实现对DNA结合蛋白的非标记检测。
该非标记检测DNA结合蛋白的芯片的应用方法，可采用定量化的检测方法，先用已知浓度的某一待测DNA结合蛋白，根据上述的检测方法建立蛋白浓度与信号强度的标准曲线，再对该蛋白质在样品中的浓度进行定量检测。
本发明与现有技术相比，具有如下优点1、本发明的最大优点是不需要标记待检测的蛋白质，避免了在标记过程中可能造成的蛋白质的丢失，提高了检测的灵敏度。
2、本发明是基于微阵列的一种检测方法，可以对大量的DNA结合蛋白同时进行检测，反映的生物学意义更全面，同时可以节省大量的检测成本。
3、本发明避免了传统的同位素标记所带来的放射性物质的污染，操作更安全快捷。
4、根据引入的标记物的不同，本技术可以通过多种方式对信号进行检测。
图1是本发明芯片的探针制备示意图。
图2是本发明芯片的结构示意图1。
图3是本发明芯片的结构示意图2。
图4是本发明芯片应用方法示意图1。
图5是本发明芯片应用方法示意图2。
图6是本发明芯片应用方法中的不同浓度与信号强度的标准曲线图。
2、微阵列的制备根据步骤1制备的探针，如图2所示，将标有氨基(-NH2)的探针1固定在尼龙膜、醋酸纤维素膜或玻璃片等表面。其中每一个探针对应一个DNA结合蛋白。
3、芯片的杂交将探针2与细胞提取物混合25℃孵育15分钟，然后与芯片于25℃杂交。用洗脱液清洗游离的探针2和非特异性结合的蛋白质(如图4)。
4、信号检测在光学电荷耦合器件(CCD)显微镜、共聚焦显微镜或芯片荧光扫描仪(如ScanarryLite)上对杂交后芯片进行荧光信号检测。
5、标准曲线的建立按照步骤1～4，用已知浓度的DNA结合蛋白来建立不同浓度与荧光信号的标准曲线(如图6)。
6、结果分析根据与待测蛋白相对应的点的荧光信号的强弱，结合标准曲线，确定该蛋白质在细胞中的含量。
2、微阵列的制备和杂交同实例1。
3、荧光分子的掺入杂交后芯片在DNA聚合酶1大片段(Klenow酶)延伸体系37℃作用1小时，引入荧光标记的脱氧尿嘧啶三磷酸腺苷(如Cy3-dUTP)。用2倍的柠檬酸钠(2×SSC)，0.1％十二烷基硫酸钠(SDS)清洗游离的Cy3-dUTP(如图5)。
4、荧光信号的检测及结果分析同样利用掺入法建立已知浓度蛋白质的浓度与荧光强度的标准曲线(如图6)，同实例1进行荧光信号的检测及结果分析。实例2也可以通过增加掺入的Cy3-dUTP分子数来放大检测荧光信号，提高检测灵敏度。
权利要求
1.一种非标记检测DNA结合蛋白的芯片，其特征在于结构具有双链寡核苷酸探针，双链寡核苷酸探针的序列是针对被检测的DNA结合蛋白的特异性DNA识别序列而设计的，在含有待测DNA结合蛋白的识别位点的之间分成两条带有粘性末端的半位点片段即探针1和探针2，其中一条双链寡核苷酸片段即探针1固定在基底上，而另一条双链寡核苷酸片段即探针2上引入标记物。
2.权利要求1所述的一种非标记检测DNA结合蛋白的芯片制备方法，其特征在于(1)根据待检测的DNA结合蛋白的特异性结合序列设计双链寡核苷酸探针，在DNA结合蛋白的识别位点之间将其分成两个含有粘性末端的半位点片段探针1和探针2，两条探针可以通过粘性末端进行杂交；(2)将其中一条双链寡核苷酸片段即探针1固定在基底上，而另一条双链寡核苷酸片段即探针2上引入标记物；或者探针2不标记任何荧光基团，而是将其远离半位点5’端设计为突出的粘末端，突出末端的碱基序列中含有若干腺嘌呤A。
3.根据权利要求1或2所述的一种非标记检测DNA结合蛋白的芯片，其特征在于探针1固定的基底采用微球、尼龙膜、醋酸纤维素膜、塑料、橡胶、陶瓷或玻璃片。
4.根据权利要求1或2所述的一种非标记检测DNA结合蛋白的芯片，其特征在于探针2上所引入的标记物为荧光分子基团、生物素、纳米颗粒。
5.根据权利要求1或2所述的一种非标记检测DNA结合蛋白的芯片，其特征在于芯片中所用于DNA结合蛋白检测的双链寡核苷酸探针，根据不同DNA结合蛋白的特异性结合序列，设计多个包含有不同的蛋白识别序列的固定化探针，并构成微阵列芯片。
6.根据权利要求1或2所述的一种非标记检测DNA结合蛋白的芯片，其特征在于探针1和探针2的粘性末端即互补杂交序列长度控制在2～10个碱基，其序列为被检测蛋白的DNA特异性结合序列中的一部分。
7.权利要求1或2所述的一种非标记检测DNA结合蛋白的芯片的应用方法，其特征在于(1)将标记的探针2加入到含有待检测DNA结合蛋白的溶液中进行预作用；(2)将上述溶液与制备好的双链寡核苷酸固定化探针或双链寡核苷酸微阵列芯片杂交，在DNA结合蛋白特异性识别的作用下，探针2特异性杂交结合在与其互补的固定化探针1上；(3)通过缓冲液对杂交后固相化探针或微阵列芯片上的非特异性吸附物进行洗脱，将非特异性结合的蛋白质和探针2从芯片上洗脱下来；(4)对洗脱后固相化探针或微阵列芯片上的标记物进行检测；或者用DNA聚合酶法在探针2远离半位点3’端掺入标记的脱氧尿嘧啶三磷酸腺苷，然后进行标记物检测；当待测的DNA结合蛋白存在时，探针1和探针2的结合效率很高，可以在探针1的位置上检测到探针2的标记物，反之，标记物的信号很弱，由此实现对DNA结合蛋白的非标记检测。
8.根据权利要求7所述的一种非标记检测DNA结合蛋白的芯片的应用方法，其特征在于采用定量化的检测方法，先用已知浓度的某一待测DNA结合蛋白，根据上述的检测方法建立蛋白浓度与信号强度的标准曲线，再对该蛋白质在样品中的浓度进行定量检测。
全文摘要
本发明涉及的是一种非标记检测DNA结合蛋白的芯片及其制备、应用方法。其结构具有双链寡核苷酸探针，双链寡核苷酸探针的序列是针对被检测的DNA结合蛋白的特异性DNA识别序列而设计的，将其在含有待测DNA结合蛋白的识别位点的之间分成两条带有粘性末端的半位点片段即探针1和探针2，其中一条双链寡核苷酸片段即探针1固定在基底上，而另一条双链寡核苷酸片段即探针2上引入标记物。把探针2与含有待检测的DNA结合蛋白的溶液一起孵育，然后与芯片进行杂交。DNA结合蛋白存在时，探针1和探针2的结合效率很高，可以在探针1的位置上检测到探针2的标记物。反之，标记物的信号很弱。由此，可实现对DNA结合蛋白的非标记检测。
文档编号G01N33/68GK1435492SQ0311291
公开日2003年8月13日 申请日期2003年3月5日 优先权日2003年3月5日
发明者白云飞, 葛芹玉, 陆祖宏, 李同祥, 王进科 申请人:东南大学
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