专利名称：：测定银杏叶或其相关制剂中山柰酚葡萄糖鼠李糖苷含量的方法
技术领域：
：本发明属于药品质量控制领域，涉及一种测定银杏叶或其相关制剂中山柰酚葡萄糖鼠李糖苷含量的方法。
背景技术：
：银杏叶又名白果叶，来源于银杏科植物银杏(GinkgobilobaL.)的干燥叶，在我国有悠久的药用历史，主要用于治疗肺虚咳喘和心悸怔忡等症。现代药理学研究表明，银杏叶具有清除氧自由基、降血脂、增强中枢神经系统功能、调节神经递质和激素水平、改善血液流变状态、抗炎、抗过敏等作用。因而用银杏叶研制开发的制剂品种越来越多，临床应用越来越广泛。目前在临床上应用的有斯泰隆、金纳多、天保宁、银可络、舒血宁、络欣通，冠心酮等多种品牌的片齐、颗粒齐、注射剂，主要用于治疗各种心脑血管疾病、糖尿病、神经系统疾病和呼吸系统疾病等。银杏叶及其制剂中主要有效成分为黄酮类和内酯类两类成分，到目前为止，国内外关于银杏叶及其制剂的质量控制方法普遍是测定这两类成分的含量。关于银杏叶及其制剂中黄酮类含量测定的方法，虽然已经有高效液相色谱法和薄层扫描法，但其测定原理都是在水解的基础上，以槲皮素、山柰素和异鼠李素三种黄酮苷元为对照，经过折算而进行测定的，这两种方法的主要缺点是(1)需要水解。在水解过程中，由于操作等多方面的原因，可能发生水解不够或水解过度等现象，导致测定结果不准确；而且水解过程费时费力，严重影响工作效率。(2)测定的是黄酮苷元的含量。由于测定的是水解后的黄酮苷元的含量，不能准确反映银杏叶及其制剂中黄酮苷类成分的真实含量，不能达到真正控制银杏叶及其制剂质量均一性的目的。
发明内容本发明的目的是提供一种测定银杏叶或其相关制剂中山柰酚葡萄糖鼠李糖苷含量的方法。本发明提供的测定银杏叶或其相关制剂中山柰酚葡萄糖鼠李糖苷含量的方法，包括如下步骤在无阴性干扰的情况下，以山柰酚葡萄糖鼠李糖苷为对照品，利用高效液相色谱对作为供试品的所述银杏叶或其相关制剂中的山柰酚葡萄糖鼠李糖苷进行测定，由外标法计算得到所述银杏叶或其相关制剂中山柰酚葡萄糖鼠李糖苷的含量。该方法中，在所述测定步骤之前，先将所述对照品和所述供试品溶于溶剂中；溶解所述对照品的溶剂选自甲醇、甲醇的水溶液、乙醇、乙醇的水溶液和流动相中的任意一种；溶解所述供试品的溶剂选自甲醇、甲醇的水溶液、乙醇、乙醇的水溶液和流动相中的任意一种。所述测定步骤中，检测波长为190nm400nm，优选360nm。流动相为下述溶剂a溶剂C中的任意一种所述溶剂a为甲醇的水溶液，所述溶剂b为乙腈的水溶液，所述溶剂c为甲醇、乙腈和水组成的混合液。所述流动相还可为溶剂溶剂c中的任意一种与修饰剂、缓冲溶液、离子抑制剂和PH值调节剂中的至少一种组成的混合液；其中，所述溶剂a为甲醇的水溶液，所述溶剂b为乙腈的水溶液，所述溶剂c为甲醇、乙腈和水组成的混合液；所述修饰剂选自四氢呋喃、异丙醇和二氧六环中的任意一种；所述缓冲溶液选自磷酸盐缓冲溶液、乙酸盐缓冲溶液和柠檬酸盐缓冲溶液中的任意一种；所述离子抑制剂选自十二烷基磺酸钠、十一烷基磺酸钠、己烷磺酸钠、庚烷磺酸钠、辛烷磺酸钠和壬烷磺酸钠中的任意一种；所述PH值调节剂选自甲酸、乙酸、磷酸和柠檬酸中的任意一种。所述修饰剂的加入量为所述溶剂a或溶剂b或溶剂c体积的0.5%10.0%，优选3.0%5.0%；所述缓冲溶液的加入量为所述溶剂a或溶剂b或溶剂c体积的0.5%10.0%，优选3.0%5.0%；所述离子抑制剂的加入量为所述溶剂a或溶剂b或溶剂c体积的0.3.0%，优选0.5%1.0%;所述PH值调节剂的加入量为所述溶剂a或溶剂b或溶剂C体积的0.05%5.0%，优选0.2%1.0%。所述相关制剂为银杏叶药材、银杏叶提取物、含有银杏叶的固体制剂或含有银杏叶的液体制剂，其中，所述固体制剂为丸剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、滴丸剂、散剂或茶剂，所述液体制剂为注射剂、口服液、酊剂或煎膏剂。本发明提供的测定银杏叶或其相关制剂中山奈酚葡萄糖鼠李糖苷含量的方法，可为下述方法a-方法c中的任一方法所述方法a为1)制备对照品的溶液称取山柰酚葡萄糖鼠李糖苷对照品，加甲醇制成每Iml含0.04mg的溶液，得到所述对照品的溶液；2)制备供试品溶液(1)制备银杏叶的溶液取银杏叶，粉碎，称取2g，加入质量百分浓度为75%的乙醇水溶液100ml，称定重量，置于水浴中加热回流提取40分钟，取出，放冷，再称定重量，用质量百分浓度为75%的乙醇水溶液补足减失的重量，摇勻，滤过，量取续滤液25ml，蒸干，残渣加水2ml使其溶解，置于已处理好的聚酰胺柱中，用水50ml洗脱，弃去水液，再用质量百分浓度为75%的乙醇水溶液IOOml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇使其溶解，定量转移至5ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇勻，用0.45μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，得到所述银杏叶的溶液；其中，所述聚酰胺柱按照下述方法进行处理取聚酰胺颗粒用60目筛筛除细粉，加23倍重量的水浸泡使其润湿，装入色谱柱中，用25倍柱体积的质量百分浓度为2%5%的盐酸水溶液洗脱，再用去离子水洗脱至中性，接着用25倍柱体积的质量百分浓度为2%5%的盐酸水溶液洗脱，再用去离子水洗脱至中性；(2)制备银杏叶提取物的溶液称取购自浙江康恩贝植物提取物有限公司生产的产品批号为070301的银杏叶提取物0.035g，加入甲醇10ml，超声处理10分钟，用孔径为0.45μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，得到所述银杏叶提取物的溶液；(3)制备舒血宁注射液的溶液用孔径为0.45μm的微孔滤膜滤过舒血宁注射液，取续滤液，得到所述舒血宁注射液的溶液；3)测定所述供试品溶液中山柰酚葡萄糖鼠李糖苷的含量选用型号为AgilentZORBAXEclipsePlusC18、规格为50mmX4.6讓、±真充剂粒径为1.8μm的高效液相色谱柱，所述色谱柱中的填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶，以乙腈和质量百分浓度为0.4%的磷酸水溶液组成的混合液为流动相，分别精密吸取所述对照品溶液与所述供试品溶液各2μ1，分别注入所述高效液相色谱仪中，按照表1所示进行梯度洗脱，每次所述梯度洗脱的平衡时间为10分钟，所述流动相的流速为每分钟0.6ml，所述检测波长为360nm，所述色谱柱的柱温为40°C，理论板数按山柰酚葡萄糖鼠李糖苷峰计算不低于8000，所述表1中，A代表乙腈，B代表质量百分浓度为0.4%的磷酸水溶液，％代表体积百分比；表1、梯度洗脱条件<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>根据所得所述供试品和对照品的高效液相色谱图计算得到所述山柰酚葡萄糖鼠李糖苷的峰面积及所述对照品的峰面积，按照下式所示的外标法进行计算山柰酚葡萄糖鼠李糖苷的峰面积χ对照品溶液的浓度供试品溶液中山柰酚葡萄糖鼠李糖苷的浓度=-对照品的峰面积得到所述供试品溶液中山柰酚葡萄糖鼠李糖苷的浓度；所述方法b为1)制备对照品的溶液称取山柰酚葡萄糖鼠李糖苷对照品，加甲醇制成每Iml含0.04mg的溶液，得到所述对照品的溶液；2)制备供试品溶液(1)制备银杏叶的溶液取银杏叶，粉碎，称取2g，加入质量百分浓度为75%的乙醇水溶液100ml，称定重量，置于水浴中加热回流提取40分钟，取出，放冷，再称定重量，用质量百分浓度为75%的乙醇水溶液补足减失的重量，摇勻，滤过，量取续滤液25ml，蒸干，残渣加水2ml使溶解，置于已处理好的聚酰胺柱中，用水50ml洗脱，弃去水液，再用质量百分浓度为75%的乙醇水溶液IOOml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇使其溶解，定量转移至5ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇勻，用0.45μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，得到所述银杏叶的溶液；其中，所述聚酰胺柱按照下述方法进行处理取聚酰胺颗粒用60目筛筛除细粉，加23倍重量的水浸泡使其润湿，装入色谱柱中，用25倍柱体积的质量百分浓度为2%5%的盐酸水溶液洗脱，再用去离子水洗脱至中性，接着用25倍柱体积的质量百分浓度为2%5%的盐酸水溶液洗脱，再用去离子水洗脱至中性；(2)制备银杏叶提取物的溶液称取购自浙江康恩贝植物提取物有限公司生产的产品批号为070301的银杏叶提取物0.035g，加入甲醇10ml，超声处理10分钟，用孔径为0.45μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，得到所述银杏叶提取物的溶液；(3)制备舒血宁注射液的溶液用孔径为0.45μm微孔滤膜滤过舒血宁注射液，取续滤液，得到所述舒血宁注射液的溶液。3)测定所述供试品溶液中山柰酚葡萄糖鼠李糖苷的含量选用型号为HP1100型Inertsilr0DS-3C18、规格为250mmX4.6mm、填充剂粒径为5μπι的高效液相色谱柱，所述色谱柱中的填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶，以流动相A和流动相B组成的混合液为流动相，分别吸取所述对照品溶液与所述供试品溶液各10μ1，分别注入所述高效液相色谱仪中，按照表2所示进行梯度洗脱，每次洗脱的平衡时间为10分钟，流动相的流速为每分钟1.0ml，所述检测的波长为360nm，所述色谱柱的柱温为30°C，理论板数按山柰酚葡萄糖鼠李糖苷峰计算不低于8000；所述流动相A为由水、乙腈、异丙醇和柠檬酸以体积比1000470506.08混合而得的混合液，所述流动相B为水、乙腈、异丙醇和柠檬酸以体积比1400200306.88混合而得的混合液；所述表2中，A代表所述流动相A，B代表所述流动相B，％代表体积百分比；表2、梯度洗脱条件<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>100_1_根据所得所述供试品和对照品的高效液相色谱图计算得到所述山柰酚葡萄糖鼠李糖苷的峰面积及所述对照品的峰面积，按照下式所示的外标法进行计算山柰酚葡萄糖鼠李糖苷的峰面积X对照品溶液的浓度供试品溶液中山柰酚葡萄糖鼠李糖苷的浓度=对照品的峰面积得到所述供试品溶液中山柰酚葡萄糖鼠李糖苷的浓度；所述方法c为1)制备对照品的溶液称取山柰酚葡萄糖鼠李糖苷对照品适量，加甲醇制成每Iml含0.04mg的溶液，得到所述对照品的溶液；2)制备供试品溶液(1)制备银杏叶提取物的溶液称取购自浙江康恩贝植物提取物有限公司生产的产品批号为070301的银杏叶提取物0.035g，加入甲醇10ml，超声处理10分钟，用孔径为0.45μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，得到所述银杏叶提取物的溶液；(2)制备舒血宁注射液的溶液用孔径为0.45μm微孔滤膜滤过舒血宁注射液，取续滤液，得到所述舒血宁注射液的溶液。3)测定所述供试品溶液中山柰酚葡萄糖鼠李糖苷的含量选用型号为Inertsil0DS-3C18、规格为250mmX4.6mm、填充剂粒径为5μm的高效液相色谱柱，所述色谱柱中的填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶，以乙腈和质量百分浓度为0.4%的磷酸水溶液组成的混合液为流动相，分别吸取所述对照品溶液与所述供试品溶液各ομ1，分别注入所述高效液相色谱仪中，按照表3所示进行梯度洗脱，每次洗脱的平衡时间为10分钟，流动相的流速为每分钟1.0ml，所述检测的波长为360nm，所述色谱柱的柱温为30°C，理论板数按山柰酚葡萄糖鼠李糖苷峰计算不低于8000；所述表3中，A代表乙腈，B代表质量百分浓度为0.4%的磷酸水溶液，％代表体积百分比；表3、梯度洗脱条件<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>根据所得所述供试品和对照品的高效液相色谱图计算得到所述山柰酚葡萄糖鼠李糖苷的峰面积及所述对照品的峰面积，按照下式所示的外标法进行计算<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>得到所述供试品溶液中山柰酚葡萄糖鼠李糖苷的浓度。上述测定方法中，所述无阴性干扰的情况是指处方中含银杏叶的复方制剂中，取去除银杏叶以后的其他所有药味，按照原加工工艺和供试品溶液的制备方法制得的阴性样品溶液，按照同样的色谱条件，进样后，在色谱图中无与对照品色谱峰保留时间一致的色谱峰。所述外标法是指在规定的色谱条件下，分别取对照品溶液和供试品溶液进样，根据对照品色谱峰的保留时间确定供试品色谱图中被测成分的色谱峰，再以该色谱峰的面积或峰高与对照品色谱峰的面积或峰高及其浓度进行比较，计算得到供试品中被测成分的浓度，即为得到供试品中被测成分的含量。本发明提供的测定银杏叶制剂中山柰酚葡萄糖鼠李糖苷含量的方法，在制备供试品溶液时，不需要水解，克服了现有测定方法中测定结果不准确、水解过程费时费力等缺点，能够准确测定银杏叶及其制剂中黄酮苷类成分的真实含量，有利于有效控制相关产品的质量。图1为实施例1中对照品的HPLC图谱。图2为实施例1中作为供试品的银杏叶药材的HPLC图谱。图3为实施例1中作为供试品的银杏叶提取物的HPLC图谱。图4为实施例1中作为供试品的舒血宁注射液的HPLC图谱。图5为实施例2中对照品的HPLC图谱。图6为实施例2中作为供试品的银杏叶药材的HPLC图谱。图7为实施例2中作为供试品的银杏叶提取物的HPLC图谱。图8为实施例2中作为供试品的舒血宁注射液的HPLC图谱。图9为实施例3中对照品的HPLC图谱。图10为实施例3中作为供试品的银杏叶提取物的HPLC图谱。图11为实施例3中作为供试品的舒血宁注射液的HPLC图谱。具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。本发明中所述浓度如无特别说明，均为质量百分浓度。山柰酚葡萄糖鼠李糖苷的结构确认数据英文名:kaempferol3-0-2“-glucosyIrhamnoside结构式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>取干燥银杏叶10kg，用乙醇40升回流提取2次，提取液合并，减压浓缩，与柱层析硅胶(100目200目)20kg拌样后，置索氏提取器中，依次用石油醚、乙酸乙酯和甲醇各4升回流提�。宜嵋阴ヌ崛∥锞杞�(200目300目)柱色谱分离，用体积比为9555050的三氯甲烷和甲醇的混合液进行梯度洗脱，收集相应馏分，经硅胶柱反复色谱分离、纯化，即得。该化合物的核磁检测结果如下1HNMR(300MHz,CD3OD)δ0.94(3Η,d,J=5.9Hz,H-6“)，3·19-3.43(6Η,m,sugarprotons)，3·70(2H，m，H-6〃‘)，3·81(1H，dd，J3,2=3.5Hz，J34〃=9.3Hz，H_3")，4.29(1H,dd,J2jl=1.3Hz,J2j3=3.5Hz,H-2")，4.42(1H，d，J=7.7Hz，H_1〃')，5.73(lH，d，J=1.lHz，H-l")，6.20(lH，d，J=1.9Hz，H_6)，6.37(lH，d，J=1.9Hz，H_8)，6.94(2H,d,J=8.9Hz,H-3'andH-5'),7.76(2H,d,J=8.9Hz,H-2'andH-6')。13CNMR(50MHz,DMS0_d6)δ17.7(C_6rha),62.4(C_6glc),72.0(C_5rha)，78.0(C-C-5glc)，73.5(C-4rha),71.0(C-4glc)，7.18(C-3rha)，77.9(C-3glc)，82.7(C-2rha)，5.4(C_2glc)，102.6(C-Irha)，107.1(C-Iglc)，106.0(C.10)，158.6(C-9)，94.9(C-8)，166.O(C_7)，100.0(C_6)，163.2(C_5)，179.6(C_4)，135.5(C_3)，159.4(C_2)，132.0(C-2',C-6'),116.6(C-3'，C_5'),161.7(C-4'),122.6(C-I')。由上可知，该化合物结构正确。实施例1、色谱条件与系统适用性试验色谱柱的型号为AgilentZORBAXEclipsePlusC18，规格为50mmX4.6mm,1.8μm，填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶，以乙腈和浓度为0.4%的磷酸水溶液的混合液为流动相，按照表1所示进行梯度洗脱，每次洗脱的平衡时间为10分钟，流动相的流速为每分钟0.6ml；检测波长为360nm，柱温为40°C，理论板数按山柰酚葡萄糖鼠李糖苷峰计算应不低于8000。表1中，A代表乙腈，B代表浓度为0.4%的磷酸水溶液，所列A和B的百分比(％)均为体积百分比。对于表1中所列时间段内，流动相的体积百分比由小到大或由大到小进行变化的洗脱区间，可直接设定该洗脱区间内体积百分比的两端值，色谱仪中的既定程序会进行自动调整。表1、梯度洗脱条件<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>对照品溶液的制备精密称取山柰酚葡萄糖鼠李糖苷对照品适量，加甲醇制成每Iml含0.04mg的溶液，即得。供试品溶液的制备(1)银杏叶取银杏叶本品，粉碎，精密称取2g，精密加入75%乙醇100ml，称定重量，置水浴中加热回流提取40分钟，取出，放冷，再称定重量，用75%乙醇补足减失的重量，摇勻，滤过，精密量取续滤液25ml，蒸干，残渣加水2ml使溶解，置于已处理好的聚酰胺柱(3060目，3g，内径1cm)，用水50ml洗脱，弃去水液，再用75%乙醇IOOml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇适量使溶解，定量转移至5ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇勻，用0.45μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。其中，所用聚酰胺柱按照下述方法进行处理取新购置的聚酰胺颗粒，用60目筛筛除细粉，加23倍重量的水浸泡使其润湿，装入色谱中，用25倍柱体积的2%5%的盐酸溶液洗脱，再用去离子水洗脱至中性，接着用25倍柱体积的2%5%的氢氧化钠溶液洗脱，再用去离子水洗脱至中性，即可。(2)银杏叶提取物精密称取购自浙江康恩贝植物提取物有限公司生产的产品批号为070301的银杏叶提取物0.035g，精密加入甲醇10ml，超声处理10分钟，用孔径为0.45μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。(3)舒血宁注射液取注射液，用孔径为0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。测定分别精密吸取对照品溶液与上述三种供试品溶液各2μ1，注入高效液相色谱仪中进行测定，所得高效液相色谱结果如图1-图4所示。其中，图1为对照品的HPLC图谱，山柰酚葡萄糖鼠李糖苷的保留时间为18.934分钟，图2为作为供试品的银杏叶药材的HPLC图谱，山柰酚葡萄糖鼠李糖苷的保留时间为18.718分钟，图3为中作为供试品的银杏叶提取物的HPLC图谱，山柰酚葡萄糖鼠李糖苷的保留时间为18.921分钟，图4为作为供试品的舒血宁注射液的HPLC图谱，山柰酚葡萄糖鼠李糖苷的保留时间为18.738分钟。按照外标法计算山柰酚葡萄糖鼠李糖苷的含量，具体计算过程如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>得到所述供试品为银杏叶时，其中山柰酚葡萄糖鼠李糖苷的浓度为0.023mg/g；按照与上相同的方法，计算得到所述供试品为银杏叶提取物时，其中山柰酚葡萄糖鼠李糖苷的浓度为8.02mg/g;所述供试品为舒血宁注射液时，其中山柰酚葡萄糖鼠李糖苷的浓度为0.023mg/ml。实施例2、色谱条件与系统适用性试验色谱柱的型号为HP1100型Inertsilr0DS-3C18，规格为250mmX4.6mm，5μm，填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶，以流动相A和流动相B组成的混合液为流动相，按照表2所示进行梯度洗脱，每次洗脱的平衡时间为10分钟，流动相的流速为每分钟1.0ml；检测波长为360nm，柱温为30°C，理论板数按山柰酚葡萄糖鼠李糖苷峰计算应不低于8000。所述流动相A为由水、乙腈、异丙醇和柠檬酸以体积比1000470506.08混合而得的混合液，所述流动相B为水、乙腈、异丙醇和柠檬酸以体积比1400200306.88混合而得的混合液。表2中，A代表所述流动相A，B代表所述流动相B，所列A和B的百分比(％)均为体积百分比。对于表2中所列时间段内，流动相的体积百分比由小到大或由大到小进行变化的洗脱区间，可直接设定该洗脱区间内体积百分比的两端值，色谱仪中的既定程序会进行自动调整。表2、梯度洗脱条件<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>对照品溶液的制备精密称取山柰酚葡萄糖鼠李糖苷对照品适量，加甲醇制成每Iml含0.04mg的溶液，即得。供试品溶液的制备(1)银杏叶取银杏叶本品，粉碎，精密称取2g，精密加入75%乙醇100ml，称定重量，置水浴中加热回流提取40分钟，取出，放冷，再称定重量，用75%乙醇补足减失的重量，摇勻，滤过，精密量取续滤液25ml，蒸干，残渣加水2ml使溶解，置于已处理好(该处理方法同实施例1)的聚酰胺柱(3060目，3g，内径1cm)，用水50ml洗脱，弃去水液，再用75%乙醇IOOml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇适量使溶解，定量转移至5ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇勻，用0.45μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。(2)银杏叶提取物精密称取购自浙江康恩贝植物提取物有限公司生产的产品批号为070301的银杏叶提取物0.035g，精密加入甲醇10ml，超声处理10分钟，用0.45μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。(3)舒血宁注射液取注射液，用0.45μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。测定分别精密吸取对照品溶液与上述三种供试品溶液各10μ1，注入高效液相色谱仪中进行测定，所得高效液相色谱结果如图5-图8所示。其中，图5为对照品的HPLC图谱，山柰酚葡萄糖鼠李糖苷的保留时间为52.635分钟，图6为作为供试品的银杏叶药材的HPLC图谱，山柰酚葡萄糖鼠李糖苷的保留时间为51.722分钟，图7为中作为供试品的银杏叶提取物的HPLC图谱，山柰酚葡萄糖鼠李糖苷的保留时间为50.846分钟，图8为作为供试品的舒血宁注射液的HPLC图谱，山柰酚葡萄糖鼠李糖苷的保留时间为50.565分钟。按照外标法计算山柰酚葡萄糖鼠李糖苷的含量，具体计算过程如下一…—w八—仓被测成分的峰面积X对照品溶液的浓度供试品溶液中被测成分的浓度二--——-对照品的峰面积得到所述供试品为银杏叶时，其中山柰酚葡萄糖鼠李糖苷的浓度为0.023mg/g；按照与上相同的方法，计算得到所述供试品为银杏叶提取物时，其中山柰酚葡萄糖鼠李糖苷的浓度为8.02mg/g;所述供试品为舒血宁注射液时，其中山柰酚葡萄糖鼠李糖苷的浓度为0.023mg/ml。实施例3、色谱条件与系统适用性试验色谱柱的型号为Inertsil0DS-3C18，规格为250mmX4.6mm，5μm，填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶，以乙腈和浓度为0.4%的磷酸水溶液的混合液为流动相，按照表3所示进行梯度洗脱，每次洗脱的平衡时间为10分钟，流动相的流速为每分钟1.Oml；检测波长为360nm,柱温为30°C，理论板数按山柰酚葡萄糖鼠李糖苷峰计算应不低于8000。表3中，A代表乙腈，B代表浓度为0.4%的磷酸水溶液，所列A和B的百分比(％)均为体积百分比。对于表3中所列时间段内，流动相的体积百分比由小到大或由大到小进行变化的洗脱区间，可直接设定该洗脱区间内体积百分比的两端值，色谱仪中的既定程序会进行自动调整。表3、梯度洗脱条件<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>对照品溶液的制备精密称取山柰酚葡萄糖鼠李糖苷对照品适量，加甲醇制成每Iml含0.04mg的溶液，即得。供试品溶液的制备(1)银杏叶提取物精密称取购自浙江康恩贝植物提取物有限公司生产的产品批号为070301的银杏叶提取物0.035g，精密加入甲醇10ml，超声处理10分钟，用0.45μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。(2)舒血宁注射液取注射液，用0.45μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。测定分别精密吸取对照品溶液与上述三种供试品溶液各10μ1，注入高效液相色谱仪中进行测定，所得高效液相色谱结果如图9-11所示。其中，图9为对照品的HPLC图谱，山柰酚葡萄糖鼠李糖苷的保留时间为44.452分钟，图10为作为供试品的银杏叶提取物的HPLC图谱，山柰酚葡萄糖鼠李糖苷的保留时间为44.332分钟，图11为作为供试品的舒血宁注射液的HPLC图谱，山柰酚葡萄糖鼠李糖苷的保留时间为44.335分钟。按照外标法计算山柰酚葡萄糖鼠李糖苷的含量，具体计算过程如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula>得到所述供试品为银杏叶提取物时，其中山柰酚葡萄糖鼠李糖苷的浓度为8.02mg/g;所述供试品为舒血宁注射液时，其中山柰酚葡萄糖鼠李糖苷的浓度为8.02mg/mlο权利要求一种测定银杏叶或其相关制剂中山柰酚葡萄糖鼠李糖苷含量的方法，包括如下步骤在无阴性干扰的情况下，以山柰酚葡萄糖鼠李糖苷为对照品，利用高效液相色谱对作为供试品的所述银杏叶或其相关制剂中的山柰酚葡萄糖鼠李糖苷进行测定，由外标法计算得到所述银杏叶或其相关制剂中山柰酚葡萄糖鼠李糖苷的含量。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在所述测定之前，先将所述对照品和所述供试品分别溶于溶剂中，分别得到对照品溶液和供试品溶液；溶解所述对照品的溶剂选自甲醇、甲醇的水溶液、乙醇、乙醇的水溶液和流动相中的任意一种；溶解所述供试品的溶剂选自甲醇、甲醇的水溶液、乙醇、乙醇的水溶液和流动相中的任意一种。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述对照品溶液的浓度为每Iml所述对照品溶液中含有0.OOlmg1.OOmg所述对照品，优选每Iml所述对照品溶液中含有0.04mg所述对照品。4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于所述流动相为下述溶剂溶剂c中的任意一种所述溶剂a为甲醇的水溶液，所述溶剂b为乙腈的水溶液，所述溶剂c为甲醇、乙腈和水组成的混合液。5.根据权利要求2-4任一所述的方法，其特征在于所述流动相为溶剂a_溶剂c中的任意一种与修饰剂、缓冲溶液、离子抑制剂和PH值调节剂中的至少一种组成的混合液；所述溶剂a为甲醇的水溶液，所述溶剂b为乙腈的水溶液，所述溶剂c为甲醇、乙腈和水组成的混合液；所述修饰剂选自四氢呋喃、异丙醇和二氧六环中的任意一种；所述缓冲溶液选自磷酸盐缓冲溶液、乙酸盐缓冲溶液和柠檬酸盐缓冲溶液中的任意一种；所述离子抑制剂选自十二烷基磺酸钠、十一烷基磺酸钠、己烷磺酸钠、庚烷磺酸钠、辛烷磺酸钠和壬烷磺酸钠中的任意一种；所述PH值调节剂选自甲酸、乙酸、磷酸和柠檬酸中的任意一种。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述修饰剂的加入量为所述溶剂a或溶剂b或溶剂c体积的0.5%10.0%，优选3.0%5.0%；所述缓冲溶液的加入量为所述溶剂a或溶剂b或溶剂c体积的0.5%10.0%，优选3.0%5.0%；所述离子抑制剂的加入量为所述溶剂a或溶剂b或溶剂c体积的0.1%3.0%，优选0.5%1.0%；所述PH值调节剂的加入量为所述溶剂a或溶剂b或溶剂c体积的0.05%5.0%，优选0.2%1.0%。7.根据权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于所述测定步骤中，检测波长为190nm400nm，优选360nm。8.根据权利要求1-7任一所述的方法，其特征在于所述相关制剂为银杏叶药材、银杏叶提取物、含有银杏叶的固体制剂或含有银杏叶的液体制剂。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述固体制剂为丸剂、颗粒剂、片剂、胶囊齐、滴丸剂、散剂或茶剂，所述液体制剂为注射剂、口服液、酊剂或煎膏剂。10.根据权利要求1-9任一所述的方法，其特征在于所述测定银杏叶或其相关制剂中山奈酚葡萄糖鼠李糖苷含量的方法，是按照下述方法方法c中的任一方法进行测定的所述方法a为1)制备对照品的溶液称取山柰酚葡萄糖鼠李糖苷对照品，加甲醇制成每Iml含0.04mg的溶液，得到所述对照品的溶液；2)制备供试品溶液(1)制备银杏叶的溶液取银杏叶，粉碎，称取2g，加入质量百分浓度为75%的乙醇水溶液100ml，称定重量，置于水浴中加热回流提取40分钟，取出，放冷，再称定重量，用质量百分浓度为75%的乙醇水溶液补足减失的重量，摇勻，滤过，量取续滤液25ml，蒸干，残渣加水2ml使其溶解，置于已处理好的聚酰胺柱中，用水50ml洗脱，弃去水液，再用质量百分浓度为75%的乙醇水溶液IOOml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇使其溶解，定量转移至5ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇勻，用0.45μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，得到所述银杏叶的溶液；其中，所述聚酰胺柱按照下述方法进行处理取聚酰胺颗粒用60目筛筛除细粉，加23倍重量的水浸泡使其润湿，装入色谱柱中，用25倍柱体积的质量百分浓度为2%5%的盐酸水溶液洗脱，再用去离子水洗脱至中性，接着用25倍柱体积的质量百分浓度为2%5%的盐酸水溶液洗脱，再用去离子水洗脱至中性；(2)制备银杏叶提取物的溶液称取购自浙江康恩贝植物提取物有限公司生产的产品批号为070301的银杏叶提取物0.035g，加入甲醇10ml，超声处理10分钟，用孔径为`0.45μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，得到所述银杏叶提取物的溶液；(3)制备舒血宁注射液的溶液用孔径为0.45μm的微孔滤膜滤过舒血宁注射液，取续滤液，得到所述舒血宁注射液的溶液；3)测定所述供试品溶液中山柰酚葡萄糖鼠李糖苷的含量选用型号为AgilentZORBAXEclipsePlusC18、规格为50mmX4.6mm、±真充剂粒径为`1.8μm的高效液相色谱柱，所述色谱柱中的填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶，以乙腈和质量百分浓度为0.4%的磷酸水溶液组成的混合液为流动相，分别精密吸取所述对照品溶液与所述供试品溶液各2μ1，分别注入所述高效液相色谱仪中，按照表1所示进行梯度洗脱，每次所述梯度洗脱的平衡时间为10分钟，所述流动相的流速为每分钟0.6ml，所述检测波长为360nm，所述色谱柱的柱温为40°C，理论板数按山柰酚葡萄糖鼠李糖苷峰计算不低于8000，所述表1中，A代表乙腈，B代表质量百分浓度为0.4%的磷酸水溶液，％代表体积百分比；表1、梯度洗脱条件<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>根据所得所述供试品和对照品的高效液相色谱图计算得到所述山柰酚葡萄糖鼠李糖苷的峰面积及所述对照品的峰面积，按照下式所示的外标法进行计算山柰酚葡萄糖鼠李糖苷的峰面积X对照品溶液的浓度供试品溶液中山柰酚葡萄糖鼠李糖苷的浓度=-对照品的峰面积得到所述供试品溶液中山柰酚葡萄糖鼠李糖苷的浓度；所述方法b为1)制备对照品的溶液称取山柰酚葡萄糖鼠李糖苷对照品，加甲醇制成每Iml含0.04mg的溶液，得到所述对照品的溶液；2)制备供试品溶液(1)制备银杏叶的溶液取银杏叶，粉碎，称取2g，加入质量百分浓度为75%的乙醇水溶液100ml，称定重量，置于水浴中加热回流提取40分钟，取出，放冷，再称定重量，用质量百分浓度为75%的乙醇水溶液补足减失的重量，摇勻，滤过，量取续滤液25ml，蒸干，残渣加水2ml使溶解，置于已处理好的聚酰胺柱中，用水50ml洗脱，弃去水液，再用质量百分浓度为75%的乙醇水溶液IOOml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇使其溶解，定量转移至5ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇勻，用0.45μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，得到所述银杏叶的溶液；其中，所述聚酰胺柱按照下述方法进行处理取聚酰胺颗粒用60目筛筛除细粉，加23倍重量的水浸泡使其润湿，装入色谱柱中，用25倍柱体积的质量百分浓度为2%5%的盐酸水溶液洗脱，再用去离子水洗脱至中性，接着用25倍柱体积的质量百分浓度为2%5%的盐酸水溶液洗脱，再用去离子水洗脱至中性；(2)制备银杏叶提取物的溶液称取购自浙江康恩贝植物提取物有限公司生产的产品批号为070301的银杏叶提取物0.035g，加入甲醇10ml，超声处理10分钟，用孔径为0.45μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，得到所述银杏叶提取物的溶液；(3)制备舒血宁注射液的溶液用孔径为0.45μm微孔滤膜滤过舒血宁注射液，取续滤液，得到所述舒血宁注射液的溶液；3)测定所述供试品溶液中山柰酚葡萄糖鼠李糖苷的含量选用型号为HP1100型InertsilR0DS-3C18、规格为250mmX4.6mm、填充剂粒径为5μm的高效液相色谱柱，所述色谱柱中的填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶，以流动相A和流动相B组成的混合液为流动相，分别吸取所述对照品溶液与所述供试品溶液各10μ1，分别注入所述高效液相色谱仪中，按照表2所示进行梯度洗脱，每次洗脱的平衡时间为10分钟，流动相的流速为每分钟1.0ml，所述检测的波长为360nm，所述色谱柱的柱温为30°C，理论板数按山柰酚葡萄糖鼠李糖苷峰计算不低于8000；所述流动相A为由水、乙腈、异丙醇和柠檬酸以体积比1000470506.08混合而得的混合液，所述流动相B为水、乙腈、异丙醇和柠檬酸以体积比1400200306.88混合而得的混合液；所述表2中，A代表所述流动相A，B代表所述流动相B，％代表体积百分比；表2、梯度洗脱条件<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>根据所得所述供试品和对照品的高效液相色谱图计算得到所述山柰酚葡萄糖鼠李糖苷的峰面积及所述对照品的峰面积，按照下式所示的外标法进行计算供试品溶液中山柰酚葡萄糖鼠李糖苷的浓度=山柰酚葡萄糖鼠李糖苷的峰面积χ对照品溶液的浓度对照品的峰面积得到所述供试品溶液中山柰酚葡萄糖鼠李糖苷的浓度；所述方法C为1)制备对照品的溶液称取山柰酚葡萄糖鼠李糖苷对照品适量，加甲醇制成每Iml含0.04mg的溶液，得到所述对照品的溶液；2)制备供试品溶液(1)制备银杏叶提取物的溶液称取购自浙江康恩贝植物提取物有限公司生产的产品批号为070301的银杏叶提取物0.035g，加入甲醇10ml，超声处理10分钟，用孔径为0.45μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，得到所述银杏叶提取物的溶液；(2)制备舒血宁注射液的溶液用孔径为0.45μm微孔滤膜滤过舒血宁注射液，取续滤液，得到所述舒血宁注射液的溶液；3)测定所述供试品溶液中山柰酚葡萄糖鼠李糖苷的含量选用型号为Inertsil0DS-3C18、规格为250mmX4.6mm、填充剂粒径为5μm的高效液相色谱柱，所述色谱柱中的填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶，以乙腈和质量百分浓度为0.4%的磷酸水溶液组成的混合液为流动相，分别吸取所述对照品溶液与所述供试品溶液各10μ1，分别注入所述高效液相色谱仪中，按照表3所示进行梯度洗脱，每次洗脱的平衡时间为10分钟，流动相的流速为每分钟1.0ml，所述检测的波长为360nm，所述色谱柱的柱温为30°C，理论板数按山柰酚葡萄糖鼠李糖苷峰计算不低于8000；所述表3中，A代表乙腈，B代表质量百分浓度为0.4%的磷酸水溶液，％代表体积百分比；表3、梯度洗脱条件<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>根据所得所述供试品和对照品的高效液相色谱图计算得到所述山柰酚葡萄糖鼠李糖苷的峰面积及所述对照品的峰面积，按照下式所示的外标法进行计算<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>得到所述供试品溶液中山柰酚葡萄糖鼠李糖苷的浓度。全文摘要本发明公开了一种用于测定银杏叶或其相关制剂中山柰酚葡萄糖鼠李糖苷含量的方法。该方法是在无阴性干扰的情况下，以山柰酚葡萄糖鼠李糖苷为对照品，利用高效液相色谱对作为供试品的所述银杏叶或其相关制剂中的山柰酚葡萄糖鼠李糖苷进行测定，由外标法计算得到所述银杏叶或其相关制剂中山柰酚葡萄糖鼠李糖苷的含量。该方法在制备供试品溶液时，不需要水解，克服了现有测定方法中测定结果不准确、水解过程费时费力等缺点，能够准确测定银杏叶或其制剂中山柰酚葡萄糖鼠李糖苷的真实含量，有利于有效控制相关产品的质量。文档编号G01N30/06GK101813674SQ20101012267公开日2010年8月25日申请日期2010年3月11日优先权日2010年3月11日发明者付欣彤,王京辉,王志斌,郭洪祝,陈有根申请人:北京市药品检验所
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