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专利名称：一种金标银染定量检测铅离子的方法及其试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及重金属检测技术领域，尤其是涉及一种金标银染定量检测铅离子的方法及其试剂盒。
背景技术：
铅(Pb)，是重金属之一，在生物体内和环境中残留时间长，对人体神经系统有严重损害，对人体健康产生严重威胁。自然界中的铅主要以离子形式(Pb2+)存在，故实现对铅离子的准确、灵敏、快速的现场检测非常重要。目前检测铅离子的方法主要有原子发射光谱法、ICP-MS法、原子吸收光谱法、电化学法、离子色谱法、毛细管电泳法、紫外一可见分光光度法、重金属快速测定仪法、试纸条法等。原子发射光谱法、ICP-MS法、原子吸收光谱法、电化学法、离子色谱法、毛细管电泳法，准确度和灵敏度高，但均需使用特定的仪器，价格昂贵，操作繁琐，且要求检测人员具备一定的专业知识，分析成本高，无法应用于现场检测，难以普及；紫外一可见分光光度法选择性差，检出限高；重金属快速测定仪法可应用于现场检测，但灵敏度不高、选择性差，样品预处理复杂；试纸条法虽然快速、简便而在现场检测中别具优势，但其只能够定性分析铅离子浓度是否达到该试纸条的检测限，而不能准确定量检测铅离子的浓度。金标银染(Gold label silver stain)技术将纳米金颗粒与DNA杂交系统结合在一起后，浸入含银离子的银染试剂中，由于纳米金颗粒对银离子的还原有催化作用，银染试剂中的银离子在纳米金颗粒表面被还原为单质银而沉积，呈现出黑色的银染信号。纳米金颗粒数目越多，银染信号的灰度值越大，而纳米金颗粒数目取决于体系中靶DNA或者其他研究对象的数目，因此根据银染信号的灰度值即可定量检测靶DNA或者其他研究对象的浓度。目前，国内外还没有关于将金标银染技术应用于定量检测铅离子的相关研究报道。

发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种高灵敏度、高选择性且可定量分析铅离子浓度的金标银染定量检测铅离子的方法及其试剂盒。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为一种金标银染定量检测铅离子的方法，具体包括以下步骤( I)硅烷化载玻片的制备将载玻片置于piranha洗液中，于90_100°C加热20_40min后取出，用蒸馏水洗涤三次，置于N2氛中干燥后，浸入l_3wt%的3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)溶液中，于室温下硅烷化处理2-6h，再用乙醇洗净后，于110-130°C真空干燥l_3h后，得到硅烷化载玻片，所述的piranha洗液为98%的浓硫酸和30%双氧水按体积比7:3的比例混合得到；(2)特异性DNA-纳米金探针溶液的制备a.将 10 u L 的 100 u M 序列为 SEQ ID NO:1 所示的 IDNA 与 10 u L 的 100 u M 序列为SEQ ID N0:2所示的2DNA混合均匀，在90° C水浴反应5min，自然冷却至室温后得50 y M的脱氧核酶结合物溶液；b.将500 μ L23.5ηΜ的纳米金溶液与7.1 μ L50 μ M的脱氧核酶结合物溶液混合，4°C培育22-26h后，用蒸馏水稀释100倍，即得特异性DNA-纳米金探针溶液；(3)特异性DNA-纳米金探针与样品反应及银染放大将步骤(2)所得的特异性DNA-纳米金探针溶液与样品溶液按体积比1-3:2-6混合，振荡摇匀10-20min后，加入IuL的ImM EDTA 二钠盐(乙二胺四乙酸二钠)，混匀后，取
2-4uL混合溶液滴在娃烧化载玻片上,于室温下至试样点完全干燥后，在试样点上滴银染试剂4-6uL，室温下暗箱静置20-30min后，立即用蒸馏水冲去多余银染试剂，然后干燥载玻片;(4)金标银染信号的定量分析将干燥后载玻片上的金标银染试样点扫描成图片获得待测样品溶液的金标银染信号及其灰度平均值，根据金标银染信号灰度平均值与铅离子溶液浓度之间的定量关系，计算得到待测样品溶液中铅离子的准确浓度。步骤(2)中所述的纳米金颗粒的直径为15_30nm，所述的特异性DNA-纳米金探针
的结构如下所示
权利要求
1.一种金标银染定量检测铅离子的方法，其特征在于具体包括以下步骤: (1)娃烧化载玻片的制备 将载玻片置于piranha洗液中，于90-100°C加热20-40min后取出，用蒸馏水洗涤三次，置于N2氛中干燥后，浸入l_3wt%的3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)溶液中，于室温下硅烷化处理2-6h，再用乙醇洗净后，于110-130°C真空干燥l_3h后，得到硅烷化载玻片，所述的piranha洗液为98%的浓硫酸和30%双氧水按体积比7:3的比例混合得到； (2)特异性DNA-纳米金探针溶液的制备 a.将IOii L的IOOii M序列为SEQ ID NO:1所示的IDNA与10 y L的100 y M序列为SEQ ID NO: 2所示的2DNA混合均匀，在90° C水浴反应5min，自然冷却至室温后得50 y M的脱氧核酶结合物溶液； b.将500u L23.5nM的纳米金溶液与7.1 y L50 y M的脱氧核酶结合物溶液混合，4°C培育22-26h后，用蒸馏水稀释100倍，即得特异性DNA-纳米金探针溶液； (3)特异性DNA-纳米金探针与样品反应及银染放大 将步骤(2)所得的特异性DNA-纳米金探针溶液与样品溶液按体积比1-3:2-6混合，振荡摇匀10-20min后，加入IuL的ImM EDTA 二钠盐(乙二胺四乙酸二钠)，混匀后，取2_4uL混合溶液滴在娃烧化载玻片上，于室温下至试样点完全干燥后，在试样点上滴银染试剂4-6uL，室温下暗箱静置20-30min后，立即用蒸馏水冲去多余银染试剂，然后干燥载玻片； (4)金标银染信号的定量分析 将干燥后载玻片上的金标银染试样点扫描成图片获得待测样品溶液的金标银染信号及其灰度平均值，根据金标银染信号灰度平均值与铅离子溶液浓度之间的定量关系，计算得到待测样品溶液中铅离子的准确浓度。
2.根据权利要求1所述的一种金标银染定量检测铅离子的方法，其特征在于:步骤(2)中所述的纳米金颗粒的直径为15-30nm，所述的特异性DNA-纳米金探针的结构如下所示
3.根据权利要求1所述的一种金标银染定量检测铅离子的方法，其特征在于:步骤(3)中所述的银染试剂由组分A和组分B组成，所述的组分A为含0.25g/mL的AgNO3溶液，组分B为0.0425g/mL的氢醌、0.064g/mL的朽1檬酸、0.059g/mL的朽1檬酸三钠按等体积比混合而成，临用前将组分A、组分B按体积比3:100混合即得银染试剂。
4.根据权利要求1所述的一种金标银染定量检测铅离子的方法，其特征在于:步骤(4)的具体过程如下: A.用扫描仪将载玻片上的金标银染试样点扫描成图片； B.利用Matlab软件的imread命令，读出每个像素点的灰度值，令信号的灰度值=255—读出的灰度值，使信号的灰度值仍介于0至255之间,无色最小为0,全黑色最大为255,颜色越深，信号的灰度值越大； C.设置信号的灰度值阈值为10，取信号的灰度值>10时的有效像素点，求出有效像素点数目；D.将所有的有效像素点的金标银染信号的灰度值加和，即得金标银染信号的灰度总值； E.用金标银染信号的灰度总值除以有效像素点数目，即得到金标银染信号的灰度平均值； F.配制一系列不同浓度的铅离子溶液，按照前述步骤获得金标银染信号及其灰度平均值，建立金标银染信号灰度平均值与铅离子溶液浓度之间的定量关系； G.根据上述步骤获得待测样品溶液的金标银染信号及其灰度平均值，根据金标银染信号灰度平均值与铅离子溶液浓度之间的定量关系，计算得到待测样品溶液中铅离子的准确浓度。
5.—种金标银染定量检测铅离子的试剂盒，其特征在于:包括硅烷化载玻片、特异性DNA-纳米金探针和银染试剂，所述的特异性DNA-纳米金探针在纳米金上结合有特异性DNA，所述的特异性DNA-纳米金探针的结构如下所示
6.根据权利要求5所述的一种金标银染定量检测铅离子的试剂盒，其特征在于:所述的纳米金颗粒的直径为15-30nm。
7.根据权利要求5所述的一种金标银染定量检测铅离子的试剂盒，其特征在于:所述的银染试剂由组分A和组分B组成，所述的组分A为含0.25g/mL的AgNO3溶液，组分B为.0.0425g/mL的氢醌、0.064g/mL的朽1檬酸、0.059g/mL的朽1檬酸三钠按等体积比混合而成，临用前将组分A、组分B按体积比3:100混合即得银染试剂。
全文摘要
本发明公开了一种金标银染定量检测铅离子的方法及其试剂盒，特点是包括将载玻片加热清洗干燥，浸入APTES溶液中，于室温下硅烷化处理再用乙醇洗净后，于110-130℃真空干燥1-3h后得到硅烷化载玻片的步骤；将DNA和纳米金溶液混合，振荡摇匀，室温下温育加水稀释得到特异性DNA-纳米金探针溶液的步骤；将特异性DNA-纳米金探针溶液与样品溶液混合后，滴在硅烷化载玻片上室温至试样点完全干燥后，滴银染试剂暗箱静置后，立即用蒸馏水冲洗再干燥的步骤；最后进行金标银染信号的定量分析，计算得到待测样品溶液中铅离子的准确浓度的步骤，优点是具有高灵敏度、高选择性且可定量分析铅离子浓度，不仅操作简单而且可现场检测。
文档编号G01N1/38GK103076327SQ20131000807
公开日2013年5月1日 申请日期2013年1月9日 优先权日2012年10月25日
发明者郭智勇, 王泽波, 陈贝贝, 郝婷婷, 杜书平, 马青青 申请人:宁波大学