专利名称：Atp生物发光法在快速评估消毒剂消杀效果的应用的制作方法
专利说明
为了实现对消毒剂消毒效果的快速评估，Best等人尝试以五种不同类型的微生物混合液作为试验菌悬液，通过消毒剂对该混合液的杀菌谱来划分消毒剂类型，取得了较好的效果。郇政山报道了发酵法与快检纸片法在餐具检测中消毒效果的评价，此法以其快速、便捷的优点得以推广。细菌的快速培养定量方法如微滴菌落计数法以及用于实验室筛选消毒产品的微生物生长分析仪等皆有报道。这些快速评价方法有其实用的一面，然而这些都是通过培养法计数，改善的程度不大。
ATP生物发光技术是目前有望实现即时检测微生物最快的方法，它的原理是萤火虫荧光素酶(Firefly Luciferase)以荧光素(D-Luciferin)、三磷酸腺苷(ATP)和O2为底物，在Mg2+存在时，能将化学能转化为光能。反应式表示为
ATP既是荧光素酶催化发光的必需底物，又是所有生物生命活动的能量来源，在荧光素酶催化的发光反应中，ATP在一定的浓度范围内，其浓度与发光强度呈线性关系。D’Eustachio和Levin的研究表明，各生长时期的细菌均有较恒定水平的ATP含量，一般为每个细胞含ATP0.28×10-10～8.9×10-10μg(即0.054～1.76×10-18mol)，平均为3×10-10μg ATP/cell(0.594×10-18molATP/cell)，酵母细胞大约是细菌细胞的100倍，每个酵母细胞的ATP含量也比细菌细胞多100倍左右。因此，提取细菌的ATP，利用生物发光法测出ATP的含量后，即可推算出样品中的含菌量，整个过程仅为几分钟。本发明的目的在于提供一种快速评估消毒剂消杀效果的方法及试剂。
本发明所提供的ATP生物发光法在快速评估消毒剂消毒效果中的应用，主要是将ATP生物发光法这种微生物数量快速检测技术替换传统真菌和细菌的平板培养计数法，进行消毒剂处理前后的活菌数量快速测定。评估一种消毒剂的消毒效果仅需要1～3h，极大提高了评估的效率，大幅度缩短了评估时间。
本发明最主要的技术特征是首次将ATP生物发光法这种微生物数量快速检测技术用于消毒剂消毒效果的评估；其次是采用ATP清除剂结合滤膜过滤的办法，有效地克服了非目标细胞ATP对测定的干扰。本发明按照GB15981，在消毒剂消毒效果评估中主要采用4种标准菌株大肠杆菌(Escherichia coli)8099、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC 6538、枯草杆菌黑色变种(Bacillus subtilis var.niger)ATCC 9372和白色念珠菌(Candidaalbicans)ATCC 10231。具体操作方法如下(1)标准菌株ATP含量与细胞数量的换算系数(K)测定a.制备4种标准指示菌株菌悬液在37℃下，用胰蛋白胨(TSA)培养基培养大肠杆菌8099、ATCC 6538、ATCC 9372标准菌株18～24h，用沙堡弱氏琼脂培养基培养ATCC 10231菌株40～48h，通过接种针刮下斜面上的菌苔，用生理盐水制成菌悬液，经8000r/min室温下离心5min，弃上清后的菌泥用生盐水悬�。瓜妇甘揪氖课�1×108～5×108cells/mL，真菌指示菌的数量为1×107～5×107cells/mL，作为测试用的标准菌悬液(简称A液)。
b.菌悬液的活菌含量平板培养计数按10倍稀释法进行倾注平板培养计数，培养和计数方法按GB15981。
c.标准菌悬液的生物发光法测定获得上述4种标准菌株8099、ATCC 9372、ATCC 6538和ATCC10231菌悬液(A液)后，用ATP提取剂Ec对4种菌悬液以及作为空白对照的生理盐水和用生理盐水配制的一系列标准ATP溶液在室温下进行ATP提取1～5min，取0.1mL ATP提取溶液，加入0.8ml含解抑剂的检测缓冲液中，加上萤光素酶-荧光素试剂0.1mL通过生物发光仪检测每分钟发光值(CPM)。
d.标准菌株ATP含量与细胞数量的换算系数(K)测定通过对系列标准ATP浓度及其对应CPM值取对数后，进行线性回归，获得线性回归方程Lg[ATP](mol/L)＝A+B×Lg(CPM)。然后将标准菌悬液测得的CPM值代入回归方程，求出其ATP浓度，再通过与平板培养计数结果对照，可获得各标准菌株的ATP含量--细胞数量换算系数K。ATP含量--细胞数量换算系数K＝悬液平板计数菌数(cfu/mL)×103/菌悬液的ATP浓度(mol/L)。
(2)消毒剂处理后生物发光法对照值测定采用目的消毒剂处理指示菌悬液，以平板法验证，达到100％杀灭指示菌株，将处理液用微孔滤膜过滤并用ATP清除剂进一步去除非目的ATP的干扰，提取残留细胞中的ATP后进行发光检测，并用系列标准ATP和配制ATP的无菌纯水进行同样的ATP提取的发光检测，通过系列标准ATP及其对应的CPM值取对数后的回归方程，换算成相当于原液中的ATP浓度，比较100％杀灭样品的ATP浓度和空白溶液中的ATP浓度，对不同类型的指示菌进行经验处理后，使100％杀灭样品经ATP生物发光换算成的活菌总数结果能较好地和平板培养结果相对应。
(3)利用换算系数进行消毒剂消杀效果快速评估a.消毒效果初始评估用菌悬液的制备在37℃下用胰蛋白胨(TSA)培养基培养大肠杆菌8099、ATCC 6538、ATCC 9372标准菌株18～24h，用沙堡弱氏琼脂培养基培养ATCC 10231菌株40～48h，用接种针刮下斜面上的菌苔后，用生理盐水制成菌悬液。经8000r/min室温下离心5min，弃上清后的菌泥用生理盐水悬浮，通过血球计数板初步估计，使细菌指示菌的数量为1×108～5×108cells/mL，真菌指示菌的数量为1×107～5×107cells/mL，直接作为不加有机物的评估用菌液(简称A液)，加有机物的评估用菌液则将离心后的菌泥用生理盐水悬�。儆�30g/L的BSA(牛血清白蛋白)无菌溶液按1∶1比例混合后即成，(简称B液)。
b.消毒处理前标准菌悬液活菌总数的ATP生物发光法测定取1mL评估用标准菌悬液，加入1mL细胞ATP提取剂Ec振匀，于室温作用适当时间(1-5min)，取0.1mL ATP提取溶液，加入0.8ml含解抑剂的pH7.8，为25mmol/L的Tricine缓冲液中，加入0.1mL荧光素酶-荧光素试剂，立即摇匀，置生物发光检测仪进行发光脉冲计数(发光CPM值)。进行空白和系列标准ATP的校正检测，并做出ATP和CPM的对数线性回归方程，换算成指示微生物的活菌数量(X)，活菌数量(X)(cfu/mL)＝样品中的ATP浓度(mol/L)×K×10-3。
c.消毒作用后残留活菌总数的ATP生物发光法测定配制高于目标浓度50倍以上的消毒药液，按小于总体积2％的数量加入到50～100mL的A液或B液中，使其达到作用的目标消毒剂浓度，在25℃±2℃条件下作用一定时间后，用评估消毒剂的专用中和剂中和，处理液在无菌条件下过直径为47mm孔径为0.22～0.45μm的滤膜，去真空后用1mL ATP清除剂(AE)原位处理滤膜2～10min，加30～50mL生理盐水冲洗2次。在无菌条件下取下过滤膜，放入50mL无菌烧杯中，加入1mL无菌超纯水和1mLATP提取剂Ec，振匀，于室温(25℃)作用适当时间(1～2min)，取0.1mL ATP提取溶液，加入适量解抑剂和pH7.8，25mmol/L的Tricine缓冲液，使其体积为0.9mL，再加入0.1mL萤光素酶-荧光素试剂，立即置发光仪中检测发光CPM值，同时进行空白和系列标准ATP的校正检测，通过系列标准ATP及其对应的CPM值取对数后的回归方程Lg[ATP](mol/L)＝A+B×Lg(CPM)，由样品的CPM值，获得样品的ATP浓度，并通过ATP含量--细胞数量换算系数K转化成标准微生物的活菌数量(Y)(cfu/mL)＝K×10(A+Blg(CPM))×10-3。
d.消毒剂消毒效果计算消毒剂的杀菌率(％)＝(X-Y)/X×100；杀灭对数值＝LgX-LgY。
本发明所提及的微生物细胞ATP释放剂Ec含有1～30g/LTritonX-1000.1～5.0g/L十六烷三甲基溴化铵(CTAB)0.1～3.0g/L二甲亚砜(DMSO)0.01～0.1g/L乙二胺四乙酸(EDTA)0.01～0.1g/L硫酸镁(MgSO4)制作过程为每升无菌超纯水中加入1～30gTritonX-100、0.1～5.0gCTAB、0.1～3.0gDMSO、0.01～0.1gEDTA、0.01～0.1gMgSO4，加热使其溶解，振匀即成，所有试剂采用分析纯，可在室温条件下1～5min内完成微生物细胞ATP的提�。虮�、快速。
本发明所提及的解抑剂为内含葡萄糖单元分别为6、7、8的环糊精等环状化合物，具体制作过程为取0.1～15.0g分析纯环糊精溶解于pH 7.8 Tricine缓冲液(内含50mmol/LTricine、10mmol/L MgSO4、1mmol/L EDTA、1mmol/L DTT)中，使终体积为1000mL，0.22μm滤膜过滤除菌后分装至5个灭菌的小瓶，于4℃冰箱储存备用。该解抑剂可以排除阳离子、阴离子和两性离子表面活性剂等物质对分析的干扰。
本发明所提及中和消毒剂用的中和剂的使用方法为50g/L无水硫代硫酸钠(Na2S2O3)的磷酸盐缓冲液(PBS，0.03mol/L，pH7.2)，用量为1∶0.9时具有中和过氧乙酸的作用；而每1mL的100mg/L的二氧化氯则采用50g/L的无水硫代硫酸钠(Na2S2O3)溶液25μl。
本发明所提及的ATP清除剂AE，其具体成份和制作过程如下用50mmol/LTris-HCl，10mmol/L MgSO4，1mmol/LEDTA，1mg/mlBSA，pH6.8的缓冲溶液配制焦磷酸酶0.1～10mg/mL，并通过0.22μm的滤膜过滤除菌。实施例1标准菌株ATP含量与细胞数量的换算系数(K)的测定(1)制备4种标准指示菌株菌悬液在37℃下，用胰蛋白胨(TSA)培养基培养大肠杆菌8099、ATCC 6538、ATCC 9372标准菌株20h，用沙堡弱氏琼脂培养基培养ATCC 10231菌株45h，通过接种针刮下斜面上的菌苔，用生理盐水制成菌悬液，在8000r/min室温下离心5min，弃上清后的菌泥用生盐水悬�。怪甘鞠妇课�1×108～5×108cells/mL，指示真菌数量为1×107～5×107cells/mL，作为测试用的标准菌悬液(简称A液)。
(2)菌悬液的活菌含量平板培养计数按10倍稀释法进行倾注平板培养计数，培养和计数方法按GB15981。4种标准指示菌株菌悬液8099、ATCC9372、ATCC6538和ATCC10231的活菌总数平板培养结果分别为4.9×108cfu/mL、1.3×108cfu/mL、1.5×108cfu/mL和1.0×107cfu/mL。
(3)标准菌悬液的生物发光法测定取1mL上述进行平板培养的4种标准菌株8099、ATCC 9372、ATCC 6538和ATCC10231菌悬液(A液)，加入1mL ATP提取剂Ec，振匀，于室温(25℃)作用2min。取0.1mL ATP提取溶液，加入0.8mL含解抑剂的pH7.8，25mmol/L的Tricine缓冲液，再加入0.1mL荧光素酶-荧光素试剂，立即摇匀，置生物发光检测仪进行发光脉冲计数(发光CPM值)。同法检测空白对照的生理盐水和用生理盐水配制的一系列标准ATP溶液的发光CPM值。
(4)标准菌株ATP含量与细胞数量的换算系数(K)测定通过对系列标准ATP及其CPM取对数后，进行线性回归，获得线性回归方程Lg[ATP]＝-13.236+1.211Lg(CPM)，R＝0.998。
对样品CPM值取对数后，就可求出样品中的ATP浓度(moL/L)ATP浓度(moL/L)＝10-13.236+1.211Lg(CPM)再通过与平板培养计数结果对照，求出各标准菌株的ATP含量-细胞数量换算系数K(cells/moL ATP)K＝悬液平板计数菌数(cfu/mL)×103/10-13.236+1.211Lg(CPM)结果见表1
表1 ATP含量与细胞数量的换算系数(K)测定
*空白拟采用配制标准ATP的无菌纯水。
实施例2消毒剂处理后生物发光法对照值测定用过氧乙酸消毒剂处理ATCC10231和8099菌悬液，经平板培养验证100％杀灭后，处理液用无菌的微孔滤膜(直径为47mm，孔径为0.22～0.45μm)进行真空抽滤，去真空后用ATP清除剂AE原位处理滤膜5min，取下滤膜用ATP提取剂Ec进行残留细胞中的ATP提取后，吸取0.1mLATP提取液，加入0.8mL含解抑剂的pH7.8，25mmol/L的Tricine缓冲液和0.1mL萤光素酶-萤光素试剂，摇匀后立即做发光检测，并用系列标准ATP和配制ATP的无菌纯水进行同样的ATP提取的发光检测。通过系列标准ATP及其对应的CPM值取对数后的回归方程，(Lg[ATP]＝13.838+1.269Lg(CPM)，R＝0.988)换算成相当于原液中的ATP浓度，空白对照的CPM值也同样换算成ATP浓度，实验结果见表2。
表2 消毒剂处理后生物发光法对应值测定
<p>表5
实施例9用菌株B-3996kurΔtdhilvA+ΔpckA/pVIC40生产L-异亮氨酸9.1制备菌株B-3996kurΔtdhilvA+ΔpckA/pVIC40将在实施例7.1中获得的需要L-异亮氨酸的菌株B-3996kurΔtdh，借助于噬菌体Plkc转导(Lennox，病毒学1，190-206(1955)；Miller，分子遗传学实验，冷泉港实验室1972)，并分离L-异亮氨酸原养型转导体。
为此，将噬菌体Plkc在菌株MG1655上增殖(Guyer等，数量生物学冷泉港座谈会45，135-140(1981)，及Blattner等，科学277，1453-1462(1997))，并将噬菌体裂解物用于转导菌株B-3996kurΔtdh。感染复数为大约0.2。在含有2g/l葡萄糖和10mg/l L-苏氨酸的基本培养基上选择L-异亮氨酸原养型转导体。分离L-异亮氨酸原养型转导体，涂布于LB琼脂上以纯化或分离，并将其称为B-3996kurΔtdhilvA+。
然后如实施例3所述，将菌株B-3996kurΔtdhilvA+的pckA基因由实施例1和2中制备的ΔpckA等位基因置换。所得菌株称为B-3996kurΔtdhilvA+ΔpckA。
菌株B-3996kurΔtdhilvA+和B-3996kurΔtdhilvA+ΔpckA用分离自菌株B-3996的质粒pVIC40转化，并在补加20μg/ml链霉素的LB琼脂上选择携带质粒的细胞。各自选择的一个菌落称为B-3996kurΔtdhilvA+ΔpckA/pVIC40和B-3996kurΔtdhilvA+/pVIC40。
9.2生产L-异亮氨酸
(4)过氧乙酸消毒剂消毒效果计算通过样品CPM对数值换算成相当于原液中的ATP浓度后，参考消毒剂处理后生物发光法与平板培养对应值测定结果，并根据标准指示菌的ATP含量与细胞数量换算系数转化为相当于原液中的活菌总数，计算过氧乙酸对ATCC10231和8099的杀菌率和对数杀灭值。实验结果见表3。
表3 生物发光法快速评估过氧乙酸消毒及消毒后ATP量的计算结果
表中符号a为换成原液中ATP浓度＜CK的样品，b为换成原液中ATP浓度＜1/10CK的样品。
实施例4ATP生物发光法在快速评估二氧化氯消毒剂消杀效果的应用在评估中，采用8099、ATCC6538、ATCC9372和ATCC10231作为指示菌，消毒自处理时间采用1分钟，其它所有的步骤与实例3的步骤一致。对于二氧化氯采用50g/L的无水硫代硫酸钠(Na2S2O3)作为中和剂，用量为每1mL浓度为100mg/L的二氧化氯使用中和剂25μl，系列标准ATP的对数回归方程为Lg[ATP]＝-13.236+1.211Lg(CPM)，R＝0.998，实验结果见表4。
表4 生物发光法评估二氧化氯消毒剂的杀菌效果
注关于表中符号a为换成原液中ATP浓度＜CK的样品，b为换成原液中ATP浓度＜1/10CK。
权利要求
1.一种ATP生物发光法在快速评估消毒剂消杀效果的应用，其特征在于首先制作标准菌悬液，用细胞ATP释放剂Ec进行处理，加入萤光素酶-萤光素试剂后检测发光值(CPM)；同法，将标准菌悬液用消毒剂作用后采用ATP清除剂结合微孔滤膜过滤，检测滤膜发光值(CPM)，同时作系列标准ATP浓度及对应的CPM值取对数后的线性回归方程，再利用标准菌株ATP含量与细胞数量的换算系数(K)求出消毒剂处理前后的标准微生物菌悬液的活菌数量，评估消毒剂的消杀效果。
2.权利要求1所述的应用，按下述步骤进行(1)标准菌株ATP含量与细胞数量的换算系数(K)测定a.制备4种标准指示菌株菌悬液在37℃下，用胰蛋白胨(TSA)培养基培养大肠杆菌8099、ATCC 6538、ATCC 9372标准菌株18～24h，用沙堡弱氏琼脂培养基培养ATCC 10231菌株40～48h，通过接种针刮下斜面上的菌苔，用生理盐水制成菌悬液，经8000r/min室温下离心5min，弃上清后的菌泥用生盐水悬�。瓜妇甘揪氖课�1×108～5×108cells/mL，真菌指示菌的数量为1×107～5×107cells/mL，作为测试用的标准菌悬液(简称A液)；b.菌悬液的活菌含量平板培养计数按10倍稀释法进行倾注平板培养计数，培养和计数方法按GB15981；c.标准菌悬液的生物发光法测定获得上述4种标准菌株8099、ATCC 9372、ATCC 6538和ATCC10231菌悬液(A液)后，用ATP提取剂Ec对4种菌悬液以及作为空白对照的生理盐水和用生理盐水配制的一系列标准ATP溶液在室温下进行ATP提取1～5min，然后加入适量的解抑剂摇匀，细胞ATP提取液通过生物发光仪检测每分钟发光值(CPM)；d.标准菌株ATP含量与细胞数量的换算系数(K)测定通过对系列标准ATP浓度及其对对应CPM值取对数后，进行线性回归，获得线性回归方程Lg[ATP](mol/L)＝A+B×Lg(CPM)。将标准菌悬液测得的CPM值代入回归方程，求出其ATP浓度，再通过与平板培养计数结果对照，可获得各标准菌株的ATP含量--细胞数量换算系数K；ATP含量--细胞数量换算系数K＝悬液平板计数菌数(cfu/mL)×103/菌悬液的ATP浓度(mol/L)；(2)利用换算系数进行消毒剂消杀效果快速评估a.消毒效果初始评估用菌悬液的制备在37℃下用胰蛋白胨(TSA)培养基培养大肠杆菌8099、ATCC 6538、ATCC 9372标准菌株18～24h，用沙堡弱氏琼脂培养基培养ATCC 10231菌株40～48h，用接种针刮下斜面上的菌苔后，用生理盐水制成菌悬液；经8000r/min室温下离心5min，弃上清后的菌泥用生理盐水悬�。ü蚣剖宄醪焦兰疲瓜妇甘揪氖课�1×108～5×108cells/mL，真菌指示菌的数量为1×107～5×107cells/mL，直接作为不加有机物的评估用菌液(简称A液)，加有机物的评估用菌液则将离心后的菌泥用生理盐水悬浮，再与30g/L的BSA(牛血清白蛋白)无菌溶液按1∶1比例混合后即成，(简称B液)；b.消毒处理前标准菌悬液活菌总数的ATP生物发光法测定取1ml评估用标准菌悬液，加入1ml细胞ATP提取剂Ec振匀，于室温(25℃)作用适当时间(1-5min)，取0.1ml ATP提取溶液，加入0.8ml含解抑剂的pH7.8，25mmol/L 的Tricine缓冲液和0.1mL荧光素酶—荧光素试剂，立即摇匀，置生物发光检测仪进行发光脉冲计数(发光CPM值)；进行空白和系列标准ATP的校正检测，并作出ATP和CPM的对数线性回归方程，换算成指示微生物的活菌数量(X)；活菌数量(X)＝样品中的ATP浓度(mol/L)×K×10-3；c.消毒作用后残留活菌总数的ATP生物发光法测定配制消毒药液，加入到A液或B液中，使其达到作用的目标消毒剂浓度，在25℃±2℃条件下作用一定时间后，用评估消毒剂的专用中和剂中和，处理液在无菌条件下过直径为47mm、孔径为0.22～0.45μm的滤膜，去真空后用ATP清除剂(AE)1mL原位处理滤膜2～10min后，加入30～50mL生理盐水冲洗2次；在无菌条件下取下过滤膜，放入50mL无菌烧杯中，加入1mL无菌超纯水和1mLATP提取剂(Ec)，振匀，于室温下作用1～5min；取0.1mL ATP提取溶液，加入0.8ml含解抑剂的pH7.8，25mmol/L的Tricine缓冲液和0.1mL荧光素酶—荧光素试剂，立即摇匀，检测发光CPM值；同时进行空白和系列标准ATP的校正检测，通过系列标准ATP浓度及其对应的CPM值取对数后的回归方程，获得样品的ATP浓度，并利用ATP含量--细胞数量换算系数K转化成标准微生物的活菌数量(Y)(cells/mL)＝K×10(A+Blg(CPM))×10-3；d.消毒剂消毒效果计算消毒剂的杀菌率(％)＝(X-Y)/X×100，杀灭对数值＝LgX-LgY。
3.权利要求1或2所述的应用，细胞ATP释放剂Ec含有1～30g/L TritonX-1000.1～5.0g/L十六烷三甲基溴化铵(CTAB)0.1～3.0g/L二甲亚砜(DMSO)0.01～0.1g/L乙二胺四乙酸(EDTA)0.01～0.1g/L硫酸镁(MgSO4)。
4.权利要求2所述的应用，解抑剂含有葡萄糖单元分别为6、7、8的环糊精等环状化合物，其制作过程为取0.1～15.0g环糊精溶解于pH7.8的Tricine缓冲液(内含50mmol/LTricine、10mmol/L MgSO4、1mmol/L EDTA、1mmol/L DTT)中，使终体积为1000mL。
5.权利要求2所述的应用，使用的消毒剂的中和剂含有无水硫代硫酸钠。
6.权利要求5所述的应用，中和剂的使用方法为50g/L的无水硫代硫酸钠(Na2S2O3)的磷酸盐缓冲液(PBS，0.03mol/L，pH7.2)，用量为1∶0.9时具有中和过氧乙酸的作用；而每1mL的100mg/L的二氧化氯则采用50g/L的无水硫代硫酸钠(Na2S2O3)溶液25μl。
7.权利要求1或2所述的应用，使用的ATP清除剂(AE)，其具体成份和制作过程如下用50mmol/LTris-HCl，10mmol/L MgSO4，1mmol/L EDTA，1mg/mLBSA，pH6.8的缓冲溶液配制焦磷酸酶0.1～10mg/mL，并通过0.22μm的滤膜过滤除菌。
全文摘要
本发明涉及ATP生物发光法在快速评估消毒剂消杀效果的应用，首先根据消毒剂消毒效果评估时主要采用的标准菌株制作标准菌悬液，用细胞ATP释放剂Ec进行处理后加入荧光素酶－荧光素试剂，检测发光值(CPM)。同法，将标准菌悬液用消毒剂作用后采用ATP清除剂结合微孔滤膜过滤，检测滤膜发光值(CPM)。同时作系列标准ATP浓度及对应的CPM值取对数后的线性回归方程，再利用标准菌株ATP含量与细胞数量的换算系数(K)求出消毒剂处理前后的标准微生物菌悬液的活菌数量，评估消毒剂的消杀效果。利用本发明评估一种消毒剂的消毒效果仅需要1～3h，极大提高了评估的效率，大幅度缩短了评估时间，而且有效地克服了非目标细胞ATP对测定的干扰。
文档编号G01N21/76GK1680803SQ20041002679
公开日2005年10月12日 申请日期2004年4月8日 优先权日2004年4月8日
发明者吴清平, 吴慧清, 张菊梅, 李程思 申请人:广东省微生物研究所, 广州环凯生物技术有限公司
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