专利名称：表征，特别是定量，由从组织再循环到血液循环系统中的血液巨噬细胞从组织中摄取到细 ...的制作方法
表征，特别是定量，由从组织再循环到血液循环系统中的血 液巨噬细胞从组织中摄取到细胞内的分子标志物的方法， 以及用于实施所述方法的分析设备本发明涉及根据权利要求1的前述部分的用于表征，特别是定量血液的单核白细 胞(特别是血液巨噬细胞)的被吞噬的细胞内分子标志物的方法；以及根据权利要求13的 前述部分的用于实施所述方法的分析设备。在全血中，在其表面上表达蛋白⑶14及⑶16(FcyRIII)的细胞是可检测的。 CD14是通常由单核细胞和巨噬细胞表达的细胞表面蛋白。细胞表面蛋白CD16使得细胞 能够结合IgG抗体的恒定(Fe)区，所述CD16以两种同种型存在在NK细胞、巨噬细胞 和所谓的激活的单核细胞的表面上，作为CDiea(FcYRIIIA)；和在嗜中性粒细胞上，作为 CD16b (Fe yRIIIB)。根据传统的学术观点，只有在组织中的巨噬细胞和血液的所谓的“激活的单核 细胞”各自既表达⑶14又表达⑶16。迄今为止的学术观点将血液的⑶14/⑶16-阳性 (CD14+CD16+)细胞绝对地视为“激活的单核细胞”，其(仍)未迁移到组织中，例如到发炎、 感染或肿瘤位置处(Ziegler-Heitbrock，L. ,2007. The CD14+CD16+ bloodmonocytes =Their role in infection and inflammation. J. Leukocyte Biol.81,584-592)。然而更新的发现表明，激活的单核细胞为从组织再循环到血液循环系统中的 巨噬细胞，其在其细胞内吞噬体中包含组织部分，例如上皮蛋白质，所述组织部分例如 源自发炎或肿瘤位置(Herwig，R.，Horninger, W.，Rehder，P.等人，2005. Ability of PSA-positivecirculating macrophages to detect prostatecaneer. Prostate 62, 290-298 ；Leers, M. P. G. ， Nap, M. ， Herwig, R.等 A, 2008. Circulating PSA-containing macrophages as a possible target forthe detection of prostate cancer :A three-colour/five-parameter flow cytometric study on peripheral blood samples. Am. J. Clin. Pathol. 129,649-656)。与天然的 CD 14-阳性、CD 16-阴性(CD14+CD16)单核 细胞群体不同，这些细胞具有完全分化的组织巨噬细胞的形态学特征，并且由其所包含 的(吞噬的)分子未在单核细胞中发现(Leers, Μ. P. G.，Nap, Μ.，Herwig, R.等人，2008. Circulating PSA-containing macrophages as a possible target forthe detection of prostate cancer :A three-colour/five-parameter flow cytometric study on peripheral blood samples. Am. J. Clin. Pathol. 129，649—656)。因此，在方法上，不仅为了分析性地检测，而且还为了分离和富集血液的 CD14+CD16+细胞，可设想研究作为所有CD14+细胞的亚群的CD16+细胞以及研究作为所有 ⑶16+细胞的子集的⑶14+细胞。此外，还已知，激活的单核细胞或血液巨噬细胞具有部分地弱的⑶14表 达(Ziegler-Heitbrock, L. ,2007. The CD14+CD16+ bloodmonocytes :Their role in infection and inflammation. J. Leukocyte Biol. 81，584-592)或者遭受CD14 的完全丧失 (Bazil 禾口 Strominger，1991 Shedding as a mechanism of down-modulationof CD14 on stimulated human monocytes. J. Immunol. 147,1567—1574)。
在其吞噬体中细胞内地包含例如标志物蛋白PSA (前列腺特异性抗原)(其因而称 为imPSA(细胞内巨噬细胞PSA))的血液巨噬细胞的流式细胞术检测可以极其特异地和灵 敏地追踪前列腺疾病的状态，并且在这方面优于传统的对于血清中的PSA的测定(Herwig， R.，Mitteregger，D·，Djavan，B·等人，2008· Detecting prostatecancer by intracellular macrophage prostate-specific antigen (PSA) :A more specific and sensitive marker than conventionalserum total PSA.Eur. J. Clin. Invest· 38，430-437)。细胞的流式细胞术表征的基础是用经荧光染料标记的抗体来标记待检测的目标 分子(“抗原”)。为了进行分析，通过流体动力学聚焦(hydrodynamische Fokussierung) 将处于悬浮中的细胞引导经过具有适当波长的集束激光束。由此，荧光染料被激发从而以 光子的形式发射出能量，所述光子由检测仪来记录。然而，此方法的缺点在于缺乏对于所结合的抗体的量的定量能力，并因此在于缺 乏关于所检测的抗原的量的信息。另一个缺点为流式细胞仪的运行所引起的可观的仪器上 和经济上的花费。本发明的任务在于提出经改进的、简化的和成本低的方法以及分析设备，在其帮 助下可能定量地表征血液的单核白细胞，特别是血液巨噬细胞，包括其的被吞噬的来自组 织的分子标志物，这特别地通过表示为“质量单位/细胞数目”。根据本发明，通过根据权利要求1的方法以及通过根据权利要求13的设备解决了
这一任务。特别地，该任务通过下述方法而得到解决，即表征，特别是定量，由从组织再循环 到血液循环系统中的血液巨噬细胞从组织中摄取到细胞内的分子标志物的方法，其中进行 下列步骤-向全血施加试剂，所述试剂抑制全血的凝集和/或凝结；-从全血中选择和/或富集和/或分离出血液巨噬细胞或包含血液巨噬细胞的白 细胞群体；-进行所选择出的血液巨噬细胞或包含血液巨噬细胞的白细胞群体的渗透化和/ 或穿孔和/或裂解；-在事先对血液巨噬细胞或包含血液巨噬细胞的白细胞群体进行穿孔和/或裂解 之后，定性和定量地测定非-血液巨噬细胞自身的标志物，即源自组织的分子标志物。一个根据本发明而言原则上的考虑在于，检测在血液循环系统的吞噬性单核细胞 中(即在血液巨噬细胞中)的分子标志物(例如上皮蛋白质)，其中按照根据本发明的方法 有利地可能进行直接的和特异性的以及定量的检测。因此，为了使得能够检测血液巨噬细胞中的分子标志物，根据本发明设定，首先从 全血中选择和/或富集和/或分离出血液巨噬细胞，其中此后术语“激活的单核细胞”和“巨 噬细胞”理解为与“血液巨噬细胞”相同。进一步地，应当指出，依照上述的对于imPSA的定 义，所有在本发明范围内所论述的、分别待检测的标志物和标志物片段是被组织中的巨噬 细胞摄取的并且至少部分地被吞噬的分子，其在血液巨噬细胞中在细胞内被检测到。根据本发明的一个优选的实施方式，借助于使用针对表面标志物CD16的抗体的 正选择来进行血液巨噬细胞的选择和/或富集和/或分离。因此，根据本发明，研究所有表达CD16的细胞，以便确保检测所有激活的单核细胞/巨噬细胞。如果希望，根据本发明还设定，优选地在使用针对表面标志物CD16的抗体进行正 选择之后，或者根据一个备选方案还在使用针对表面标志物CD16的抗体进行正选择之前， 使用针对表面标志物CD14的抗体进行正选择。在-CD14+选择之前布置使用针对表面标 志物CD16的抗体进行正-CD16+选择提供了下述根据本发明的优点在第一步就已经排除 了相对于CD16+群体而言大的未分化单核细胞的CD14+群体，所述未分化单核细胞不具有 CD16-表面标志物，并且不是用于表征(特别是定量)由从组织再循环到血液循环系统中的 血液巨噬细胞从组织中摄取到细胞内的分子标志物的根据本发明的方法的目标。以这种方式，有利地确保了，仅选择出⑶14+CD16+细胞，其中应当提及，根据本发 明，在-⑶14+选择之后进行卫-⑶16+选择也是可能的。如果认为其他具有细胞表面蛋白CD16的细胞群体(特别是NK细胞)在随后对于 包含在细胞内吞噬体中的源自组织的分子标志物所进行的分析中是干扰性的，那么可以接 着基于在⑶16+单核细胞中仅由NK细胞表达的表面蛋白⑶56或⑶57或⑶161来进行负 选择。因此，根据本发明可以有利地使用针对表面标志物⑶56和/或⑶57和/或⑶161 的抗体进行负选择，以便排除具有表面标志物CD56和/或CD57和/或CD161的细胞。这 样的负选择可以作为分开的选择步骤来进行实施，或者根据其他有利的实施方式，也可以 与CD16+细胞的正选择同时实施，如下文中所示例性地说明的。此外，根据本发明还设定，使用可偶联的，优选可逆地可偶联的磁珠来进行正或负 选择，以便借助于合适的磁体以极其简单的方式分离各自选择出的细胞。备选地或者在上游或下游的选择步骤中，根据本发明提出，使用偶联在ELISA平 板上的抗体来进行正或负选择，以便根据本发明有利地，一方面提高样品通量，和另一方面 避免待检查的液体从一个容器到另一个容器中的不必要的转移，并避免与之相伴出现的待 检查的细胞的物质损失。此外，依照另一个优选的根据本发明的实施方式设定，在ELISA平板中定量地测 定单核白细胞群体，优选地通过借助于ELISA平板阅读器测量乳酸脱氢酶活性来进行测 定，特别优选地在其中进行分子标志物，特别是非-血液巨噬细胞自身的抗原的定性和定 量测定的同一 ELISA平板之中进行。此外，借助于ELISA平板阅读器和/或化学发光测量仪器来定量地测定非_血 液巨噬细胞自身的、源自组织的分子标志物的存在量，其中根据本发明，作为分子标志物， 特别是组织标志物和/或血清学标志物，使用下列标志物及其组合异常的DNA甲基化， AFP ( α -1-胎蛋白)，AHCY (S-腺苷高半胱氨酸水解酶)，ΑΜΥ2 (胰淀粉酶)，CA 15_3 (同义 词MUC1、EMA、CD227)，CA 19-9, CA 50, CA 72-4 (同义词TAG72)，CA 125 (同义词MUC16)， 降钙素，钙防卫蛋白，CCSA-2 (结肠癌特异性抗原-2~)，CCSP-2 (结肠癌分泌蛋白_2~)，CEA (癌 胚抗原)，CYP24A1，细胞角蛋白(CK) 8及其片段，CK18及其片段，CK19及其片段，CRP (C反应 蛋白)，半胱氨酸蛋白酶抑制剂B，DDH (二氢二醇脱氢酶)，DKK-I (Dikkopf-I)，GP73 (高尔基 体蛋白-73)(同义词:G0LPH2)，HE4(人附睾蛋白4)，HER2/neu，HSP (热激蛋白)_27，Mac_2 BP(Mac-2结合蛋白)，乳腺珠蛋白A，乳腺珠蛋白B，MIA(黑素瘤抑制活性)，MnSOD (锰超氧 化物歧化酶)，PARK7 (同义词DJ-1)，ProGRP (前胃泌素释放肽)，NSE (神经元特异性烯醇化酶)，泛细胞角蛋白，ftx)-MMP (基质金属蛋白酶原)_7，PSA (前列腺特异性抗原)，S100A8， S100A9, S-100 β，SCCAl (鳞状细胞癌抗原1)，SCCA2 (鳞状细胞癌抗原2)，甲状腺球蛋白， UHRFl (具有/包含PHD和环-指结构域的遍在蛋白样蛋白1)，URG4(上调的基因4)，和 YKL-40 (同义词CHI3-L1)。根据本发明，为了实施所述方法，首先向全血掺以抵抗凝集和/或凝结的试剂，例 如肝素或其他合适的抗凝剂，例如柠檬酸盐溶液。根据本发明，进一步地，对巨噬细胞或包含巨噬细胞的白细胞群体进行穿孔或裂 解，例如借助于皂苷处理或用Triton溶液进行的处理。此外，根据本发明，为了测定非-血液巨噬细胞自身的抗原，使用任选地与生物 素、HRP (辣根过氧化物酶)、AP (碱性磷酸酶)或发光染料相缀合的抗体，特别是免疫球 蛋白类别G(IgG)的抗体，和Fab或？(油)2片段，和/或适配体，其特别地选自抗-小鼠 IgG(多克隆的)，抗-兔IgG(多克隆的)，抗-山羊IgG(多克隆的)，抗-大鼠IgG(多 克隆的)，抗-驴IgG(多克隆的)，抗_AFP(克隆AFP-01)，抗_AFP(克隆AFP-11)， 抗-AFP (克隆 4A3)，抗-AFP (克隆 5H7)，抗-AFP (克隆 M803209)，抗-AFP (克隆 M0151611)， 抗-AFP (克隆 M0151608)，抗-AFP (多克隆的)，抗-AHCY (克隆 1E11-1A7)，抗-AHCY (克隆 2F11-1D10)，抗-AHCY (克隆 4H2)，抗-AHCY (克隆 Ml)，抗-AHCY (克隆 M2)，抗-AHCY (多克 隆的)，抗-AMY2 (克隆 6A9/1)，抗-AMY2 (克隆 501)，抗-AMY2 (克隆 503)，抗-AMY2 (克隆 10-102. 5)，抗-AMY2(多克隆的)，抗-CA 15-3/MUC1 (克隆 M2C5)，抗-CA 15-3/MUC1 (克 隆 M9E7)，抗-CA 15-3/MUC1 (克隆 M4H2)，抗-CA 15-3/MUC1 (克隆 M8C9)，抗-CA 15-3/ MUCl (克隆 M10G4)，抗-CA 15-3/MUC1 (克隆 M10H6)，抗-CA 15-3/MUC1 (克隆 M3A106)， 抗-CA 15-3/MUC1 (克隆 C595 (NCRC48))，抗-CA 15-3/MUC1 (克隆 E29)，抗-CA 15-3/ MUCl (多克隆的)，抗-CA 19-9(克隆121SLE)，抗-CA 19-9 (多克隆的)，抗-CA 50(克隆 M991149)，抗-CA 50 (克隆 93)，抗-CA 50 (多克隆的)，抗-CA 72-4/TAG72 (克隆 SPM148)， 抗-CA 72-4/TAG72 (多克隆的)，抗-CA 125/MUC16 (克隆 2F1)，抗-CA 125/MUC16 (克 隆 10G12)，抗-CA 125/MUC16 (克隆 X75)，抗-CA 125/MUC16 (克隆 X325)，抗-CA 125/ MUC16(多克隆的)，抗-降钙素(克隆SP17)，抗-降钙素(克隆13B9)，抗-降钙素(克 隆13f2)，抗-降钙素(克隆MB2)，抗-降钙素(多克隆的)，抗-钙防卫蛋白(克隆 27E10)，抗-钙防卫蛋白(多克隆的)，抗-CCSA-2(多克隆的)，抗-CCSP-2(多克隆的)， 抗-CEA (克隆 Col-I)，抗-CEA (克隆 1C7)，抗-CEA (克隆 1C10)，抗-CEA (克隆 1C11)， 抗-CEA (多克隆的)，抗-CYP24A1 (克隆 1E1)，抗-CYP24A1 (克隆 1F8)，抗-CYP24A1 (多 克隆的)，抗_CK8(克隆24)，抗-CK8(克隆LP;3K)，抗-CK8(多克隆的)，抗-CK18(克隆 DC-10)，抗-CK18 (克隆 DA-7)，抗-CK18 (克隆 LDK18)，抗-CK18 (多克隆的)，抗-CK19 (克 隆 A53-B/A2)，抗-CK19 (克隆 BA17)，抗-CK19 (克隆 236-11221)，抗-CK19 (多克隆的)， 抗-CRP (克隆 232007)，抗-CRP (克隆 2320 )，抗-CRP (克隆 C2)，抗-CRP (克隆 C4)， 抗-CRP (克隆C5)，抗-CRP (克隆C6)，抗-CRP (克隆C7)，抗-CRP (多克隆的)，抗-半胱氨 酸蛋白酶抑制剂B (克隆2F1)，抗-半胱氨酸蛋白酶抑制剂B (克隆池27幻，抗-半胱氨酸 蛋白酶抑制剂B (克�。�-半胱氨酸蛋白酶抑制剂B (克隆RJMW-2E7)，抗-半胱氨 酸蛋白酶抑制剂B(多克隆的)，抗-DDH(克隆T101)，抗-DDH(多克隆的)，抗-DKK-I (克 隆 141135)，抗-DKK-I (多克隆的)，抗-GP73/G0LPH2 (克隆 YA-14)，抗-GP73/G0LPH2 (克隆5B10)，抗-GP73/G0LPH2 (多克隆的)，抗-HE4 (克隆 C-12)，抗-HE4 (多克隆的)，抗-HER2/ neu (克隆 IOC7)，抗-HER2/neu (克隆 I9I9M)，抗-HER2/neu (克隆 NVD10)，抗-HER2/ neu (多克隆的)，抗-HSP-27 (克隆 G3. 1)，抗-HSP-27 (克隆 AF5E5)，抗-HSP-27 (克隆 F-4)，抗-HSP-27 (克隆 2AQ，抗-HSP-27 (多克隆的)，抗 _Mac_2BP (克隆 SP-2)，抗 _Mac_2 BP (多克隆的)，抗-乳腺珠蛋白A(克隆1G8D6，同义词2E7G9)，抗-乳腺珠蛋白A(克隆 304-1A5)，抗-乳腺珠蛋白A (多克隆的)，抗-乳腺珠蛋白B (克隆E-17)，抗-乳腺珠蛋白 B (多克隆的)，抗-MIA (克隆3A6)，抗-MIA (多克隆的)，抗-MMP-7(克隆6A4)，抗-MMP-7(克 隆 176-5F12)，抗-MMP-7 (克隆 141-7B2)，抗-MMP-7 (克隆 377313)，抗-MMP-7 (多克隆 的)，抗-MnSOD (克隆 1AE)，抗-MnSOD (克隆 2A1)，抗-MnSOD (克隆 4F10)，抗-MnSOD (克 隆 23G5)，抗-MnSOD (克隆 37CT127. 5. 11. 6)，抗-MnSOD (多克隆的)，抗-PARK7/DJ-1 (克 隆 IBl 1)，抗-PARKVDJ-l (克隆 1D7)，抗-PARKVDJ-I (克隆 6A65)，抗-PARKVDJ-I (克 隆 3055)，抗-PARK7/DJ-1 (克隆 A-9)，抗-PARK7/DJ-1 (克隆 D-4)，抗-PARK7/DJ-1 (克 隆 E2)，抗-PARK7/DJ-1 (多克隆的)，抗-proGRP (克隆 pGRP5)，抗-proGRP (克隆 E146)， 抗-proGRP (克隆 E172)，抗-GRP (克隆 76-E6)，抗-proGRP (多克隆的)，抗-GRP (多 克隆的)，抗_NSE(克隆1C1)，抗-NSE(克隆5A4)，抗_NSE(克隆5E2)，抗_NSE(克隆 5G10)，抗-NSE(多克隆的)，抗-泛细胞角蛋白(克隆7H8C4)，抗-泛细胞角蛋白(克隆 B311. 1)，抗-泛细胞角蛋白(克隆C11)，抗-泛细胞角蛋白(克隆D-12)，抗-泛细胞角 蛋白(多克隆的)，抗_PSA(克隆ER-PR8)，抗-PSA(克隆181823)，抗_PSA(多克隆的)， 抗-S100A8 (克隆 1B3)，抗-S100A8 (克隆 2C5/4)，抗-S100A8 (克隆 2H2)，抗-S100A8 (克 隆 2Q396A)，抗-S100A8 (克隆 6A614)，抗-S100A8 (克隆 8L627)，抗-S100A8 (克隆 8-5C2)， 抗-S100A8 (克隆 CF-145)，抗-S100A8 (克隆 MRP8 7C12/4)，抗-S100A8 (克隆 S13. 67)， 抗-S100A8 (多克隆的)，抗-S100A9 (克隆 1C10)，抗-S100A9 (克隆 2Q396B)，抗-S100A9 (克 隆4G39)，抗-S100A9 (克隆编号19)，抗-S100A9 (克隆编号134)，抗-S100A9 (克隆 S32. 2)，抗-S100A9 (克隆 S36. 48)，抗-S100A9 (多克隆的)，抗-S-100 β (克隆 SB6)， 抗-S-100 β (克隆 SH-B1)，抗-S-100 β (克隆 SH-B4)，抗-S-100 β (多克隆的)， 抗-SCCAl (克隆 8Η11)，抗-SCCAl (多克隆的)，抗-SCCA2 (克隆 10C12)，抗-SCCA2 (多克 隆的)，抗-SCCA1/2 (克隆Β-9)，抗-SCCA1/2 (多克隆的)，抗-甲状腺球蛋白(克隆5Ε6)， 抗-甲状腺球蛋白(克隆5F9)，抗-甲状腺球蛋白(克隆5G4)，抗-甲状腺球蛋白(克隆 11Α16)，抗-甲状腺球蛋白(克隆ΡΒ2)，抗-甲状腺球蛋白(克隆ΡΒ3)，抗-甲状腺球蛋 白(多克隆的)，抗-UHRFl (克隆1RC1C-10)，抗-UHRFl (克隆3Α11)，抗-UHRFl (多克隆 的)，抗-URG4(多克隆的)，抗-YKL-40/CHI3-L1 (克隆 2011)，抗-YKL-40/CHI3-L1 (克隆 321806)，抗-YKL-40/CHI3-L1 (多克隆的)。因此，总之可以规定，首先通过密度梯度离心来获得所有单核细胞，由此排除 CD16-阳性嗜中性粒细胞。随后，接着进行具有表面蛋白CD14的细胞或者具有表面蛋白 ⑶16的细胞的正选择和富集。备选地，作为替代，可以进行具有表面蛋白⑶56或⑶57或 CD161的细胞的负选择。根据本发明，借助于偶联在磁珠上的、针对细胞表面蛋白⑶14或⑶16或⑶56或 CD57或CD161的抗体，不仅进行具有表面蛋白CD14或CD16的单核细胞的正选择和富集，而 且还进行具有表面蛋白⑶56或⑶57或⑶161的单核细胞的负选择。
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在针对CD14+细胞的正选择或者负选择的情况下，随后为使用针对细胞表面蛋白 CD16的抗体来进行的以细胞正选择为特征的进一步的分离步骤，所述抗体偶联在磁珠上或 者包被在ELISA平板上。在首先针对CD16+细胞的正选择的情况下，随后借助于偶联在磁珠 上或者包被在ELISA平板上的抗体来进行进一步的针对CD14+细胞的细胞正选择，或者随 后使用针对细胞表面蛋白⑶56或⑶57或⑶161的磁性抗体来进行针对⑶56+或⑶57+或 ⑶161+ NK细胞的负选择。备选地，可以在一个方法步骤中同时进行针对⑶16+细胞的正选 择以及针对⑶56+或⑶57+或⑶161+ NK细胞的负选择。在针对⑶16+细胞的正选择的情况 下，备选地可以不进行进一步的选择步骤。随后，通过用穿孔溶液和/或细胞裂解试剂进行处理来破坏现在分离的且富集的 单核白细胞。根据上述方法的一个变化形式，可以事先，更确切地说，紧在细胞裂解之前或 者紧在密度梯度离心之后，在对细胞进行渗透化的情形下添加针对待检测的分子标志物的 抗体。因此，在细胞裂解之后的步骤之一之中，可能定量包含在细胞中的分子标志物。此外，在ELISA平板中，为了弄清所放入的细胞数目，测定裂解物中乳酸脱氢酶 (LDH)的活性，其中可以通过标准来计算出所存在的单核白细胞的量。通过添加指示物质， 可以借助于ELISA阅读器读出由所述酶活性引起的显色反应，并因此进行定量。最后，借助于特异地针对各分子标志物的抗体和/或借助于针对各分子抗体的抗 体，优选地在其中通过测量LDH活性来进行细胞定量的同一 ELISA平板之中，与所检查的标 志物的量成比例地引发酶促显色反应或化学发光信号。可以借助于ELISA平板阅读器或化 学发光检测器，通过标准来定量各分子标志物。最后将结果表示为“细胞内分子标志物的量 或质量单位/细胞数目”。进一步地，通过根据权利要求13的用于实施根据本发明的方法的分析设备解决 了根据本发明的任务。根据本发明，用于实施所述方法的分析设备包含-用于添加试剂的装置，所述试剂抑制全血的凝集和/或凝结(例如，肝素、柠檬酸 盐溶液或其他合适的抗凝剂)；-用于借助于密度梯度离心，对所有在血液样品中存在的单核白细胞进行预选择 或选择和富集的装置；-用于通过使用针对⑶14的抗体来选择和富集⑶14+细胞的装置，所述针对⑶14 的抗体偶联在磁珠或ELISA平板上，任选可逆地偶联在磁性珠或ELISA平板上；-用于通过使用针对⑶16的抗体来选择和富集⑶16+细胞的装置，所述针对⑶16 的抗体偶联在磁珠或ELISA平板上，任选可逆地偶联在磁性珠或ELISA平板上；-任选的用于通过使用偶联在磁珠上的、针对⑶56或⑶57或⑶161的抗体，从单 核白细胞或单核CD16+细胞的集合中排除具有细胞表面标志物CD56或CD57或CD161的NK 细胞的装置；-用于对单核白细胞群体进行穿孔和/或裂解的装置；-用于定量测定单核白细胞群体的装置，所述定量测定在ELISA平板中进行(例 如，借助于ELISA平板阅读器来测量乳酸脱氢酶活性)，更确切地在其中进行分子标志物的 定性和定量测定的同一 ELISA平板之中进行；-用于在先前对血细胞进行穿孔或裂解之后，定性和定量地测定被血液巨噬细胞吞噬的细胞内分子标志物(例如，借助于ELISA平板阅读器、化学发光测量仪器等)的装置。此外，根据本发明，还可以设定，用于在裂解单核白细胞之前(优选地，在选择和/ 或富集和/或分离出血液巨噬细胞或包含血液巨噬细胞的白细胞群体之前或任选地在这 之后)对其进行固定和渗透化的装置，以便有利地在细胞裂解之前已经进行了针对被吞噬 到细胞内的、待定量的分子标志物的抗体的细胞内结合。下面借助于数个实施例来更详细地阐述本发明实施例1 借助于磁珠来进行⑶14+单核细胞的正选择；在ELISA平板中，进行⑶14+CD16+群 体的正选择、细胞数目测定以及分子标志物(此处为imPSA)的定量。从6ml全血开始，其置于包含聚酯凝胶和0. IM柠檬酸钠溶液的小管中。通过离心 血液(例如，1800Xg, 20分钟)，所有的单核白细胞与血小板一起在凝胶上方分离出来。分离出的细胞用PBS(磷酸盐缓冲盐水)溶液(pH 7. 4)洗涤两次以去除血小板， 所述PBS溶液另外还可以包含0. BSA(牛血清白蛋白)和2mM EDTA(乙二胺四乙酸盐)。将分离出的单核白细胞悬浮在0. 5ml的包含0. 1 % BSA和2mMEDTA但不含Ca2+或 Mg2+离子的PBS溶液(pH 7.4)中，可以取等分试样并保存于2-8°C。向该悬浮液掺以适宜 量的直接在其表面上携带针对细胞表面抗原CD14的抗体的磁珠，例如在250μ 1中IO8个 珠。备选地，可以将该悬浮液与10 μ g与经修饰的DSB-X生物素相缀合的、针对细胞表面抗 原⑶14的抗体一起在摇动或摆动下于2-8°C温育10分钟，随后将该悬浮液离心(350 X g，8 分钟)，在弃去上清液后将细胞重悬浮在0. 5ml的包含0. 1 % BSA和2mM EDTA但不含Ca2+ 或Mg2+离子的PBS溶液(pH 7.4)中。添加适宜量的在其表面上携带链霉抗生物素蛋白的 磁珠，例如在300 μ 1中IO8个珠。在将单核白细胞和磁珠的悬浮液于2_8°C摇动或摆动20分钟之后，借助于合适的 磁体来分离现在结合在磁珠上的细胞，其中弃去上清液。用包含0. 1% BSA的PBS溶液(pH 7.4)洗涤所述珠数次。在使用在其表面上携带针对细胞表面抗原CD14的抗体的磁珠的情 况下，将所述珠悬浮在0. 5ml的包含0. 1 % BSA和2mM EDTA但不含Ca2+或Mg2+离子的PBS 溶液(pH 7.4)中。备选地，在使用与经修饰的DSB-X生物素相缀合的、针对细胞表面抗原 CD14的抗体和在其表面上携带链霉抗生物素蛋白的磁珠的情况下，可以将所述珠重悬浮在 包含经修饰的生物素的细胞释放缓冲液中。将该悬浮液在室温下摇动或摆动10分钟，随后 进行珠与上清液的磁力分离。取上清液，进行离心(350Xg，8分钟)，并悬浮在0.5ml的包 含0. 1 % BSA和2mM EDTA但不含Ca2+或Mg2+离子的PBS溶液(pH 7. 4)中。将确定体积的均质化的悬浮液(最多100 μ 1)移液到96-孔Maxi-Sorp平板的 每个孔中，所述96-孔Maxi-Sorp平板不仅用针对细胞表面抗原CD16的小鼠抗体(例如， 5 μ g/ml的克隆3G8)而且用针对PSA的小鼠抗体(例如，1 μ g/ml的克隆ER-PR8)进行包 被，并进行封闭(例如，用5% FCS(胎牛血清)溶液)。可以制备所述悬浮液的稀释系列。 应将该悬浮液的等分试样留存于2-8°C。密封所述平板(例如，用保鲜膜或铝箔)，并且在 室温下温育1小时或者于2-8°C在冰箱中温育过夜。所述平板用包含0. 1 % BSA和2mM EDTA但不含Ca2+或Mg2+离子的PBS溶液(pH 7. 4)洗涤5次。随后，将50 μ 1的包含Triton和ImM PMSF(苯基甲基磺酰氟)的细胞裂解溶液移液到每个孔中。此外，将所留存的所有单核白细胞的悬浮液的等分试样，或者具 有所有在其表面携带抗原CD14的细胞的珠的等分试样移液到任意数目的(例如各2个) 孔中，并且向其掺以离50 μ 1所相差的体积的包含Triton和ImM PMSF(苯基甲基磺酰 氟)的细胞裂解溶液。此外，作为标准，制备重组PSA的稀释系列，例如在50pg/ml和2ng/ ml之间，在此将50μ 1的各浓度稀释液移液到各自至少两个空闲的孔中。现在将所述平板 于2-8°C放置5分钟，随后在超声波浴中处理5分钟(只将平板的底部浸在水浴中，安置在 紧靠水面之下的筐作为支撑物)。在将平板进行密封并在室温(1小时)或2_8°C (过夜)下进行温育之后，作为标 准，在细胞裂解溶液中制备经校准的LDH-阳性对照的稀释系列，例如从1/2500的稀释度开 始，在此将50μ 1的各浓度稀释液移液到各自至少两个空闲的孔中。随后，向平板的每个经 温育的孔中添加50 μ 1 LDH底物溶液，所述平板用铝箔密封成不透光的，并在室温下放置 30分钟。然后，给所有经温育的孔各掺以50 μ 1终止溶液(1Μ CH3COOH),用针刺破所有大 的气泡，并且在ELISA平板阅读器中在492nm处测量所有孔的光吸收。所测量的吸收的强 度与细胞数目成比例，所述细胞数目基于标准来确定。现在，将所有的孔用包含0. 05%或0. 1% Tween-20的PBS溶液洗涤5次。接着， 将所述孔与来自山羊的、多克隆的、针对PSA的检测抗体(例如以在PBS中0. 5μ g/ml的浓 度)一起在室温下温育1小时。现在，将所有的孔用包含0. 05%或0. 1 % Tween-20的PBS溶液再洗涤5次。添加 针对所述检测抗体的、与HRP(辣根过氧化物酶)相缀合的二抗(例如来自小鼠或兔)，例如 以在PBS溶液(pH 7. 4)中2 μ g/ml的浓度。在室温下的温育时间再次为1小时。在将所有孔再次用包含0. 05%或0. 1% Tween-20的PBS溶液洗涤5次之后，向每 个孔中添加100 μ 1的包含TMB (四甲基联苯胺)的底物溶液。在室温下的温育时间为15 分钟，然后将50 μ 1终止溶液(例如IM H2SO4)移液到各个孔中。最后，在ELISA平板阅读 器中在450nm波长处测量所述孔的光吸收，减去在570nm处的吸收。所测量的吸收的强度 与imPSA的量成比例，所述imPSA的量基于标准来确定。结果表示为，例如pg imPSA/细胞数目(⑶14+⑶16+细胞，或者⑶14+细胞，或者单 核白细胞)。实施例2 借助于磁珠来进行⑶16+单核细胞的正选择；在ELISA平板中，进行⑶14+CD16+群 体的正选择、细胞数目测定以及分子标志物(此处为imPSA)的定量。从6ml全血开始，其置于包含聚酯凝胶和0. IM柠檬酸钠溶液的小管中。通过离心 血液(例如，1800Xg, 20分钟)，所有的单核白细胞与血小板一起在凝胶上方分离出来。分离出的细胞用PBS(磷酸盐缓冲盐水)溶液(pH 7. 4)洗涤两次以去除血小板， 所述PBS溶液另外还可以包含0. BSA(牛血清白蛋白)和2mM EDTA(乙二胺四乙酸盐)。将分离出的单核白细胞悬浮在0. 5ml的包含0. 1 % BSA和2mMEDTA但不含Ca2+或 Mg2+离子的PBS溶液(pH 7.4)中，可以取等分试样并保存于2-8°C。向该悬浮液掺以适宜 量的直接在其表面上携带针对细胞表面抗原CD16的抗体的磁珠，例如在250μ 1中IO8个 珠。备选地，可以将该悬浮液与10 μ g与经修饰的DSB-X生物素相缀合的、针对细胞表面抗 原⑶16的抗体一起在摇动或摆动下于2-8°C温育10分钟，随后将该悬浮液离心(350 X g，8分钟)，在弃去上清液后将细胞重悬浮在0. 5ml的包含0. 1 % BSA和2mM EDTA但不含Ca2+ 或Mg2+离子的PBS溶液(pH 7.4)中。添加适宜量的在其表面上携带链霉抗生物素蛋白的 磁珠，例如在300 μ 1中IO8个珠。在将单核白细胞和磁珠的悬浮液于2_8°C摇动或摆动20分钟之后，借助于合适的 磁体来分离现在结合在磁珠上的细胞，其中弃去上清液。用包含0. 1% BSA的PBS溶液(pH 7.4)洗涤所述珠数次。在使用在其表面上携带针对细胞表面抗原CD16的抗体的磁珠的情 况下，将所述珠悬浮在0. 5ml的包含0. 1 % BSA和2mM EDTA但不含Ca2+或Mg2+离子的PBS 溶液(pH 7.4)中。备选地，在使用与经修饰的DSB-X生物素相缀合的、针对细胞表面抗原 CD16的抗体和在其表面上携带链霉抗生物素蛋白的磁珠的情况下，可以将所述珠重悬浮在 包含经修饰的生物素的细胞释放缓冲液中。将该悬浮液在室温下摇动或摆动10分钟，随后 进行珠与上清液的磁力分离。取上清液，进行离心(350Xg，8分钟)，并悬浮在0.5ml的包 含0. 1 % BSA和2mM EDTA但不含Ca2+或Mg2+离子的PBS溶液(pH 7. 4)中。将确定体积的均质化的悬浮液(最多100 μ 1)移液到96-孔Maxi-Sorp平板的 每个孔中，所述96-孔Maxi-Sorp平板不仅用针对细胞表面抗原CD14的小鼠抗体(例如， 5 μ g/ml的克隆ΜφΡ9 )而且用针对PSA的小鼠抗体(例如，1 μ g/ml的克隆ER-PR8)进行 包被，并进行封闭(例如，用5%FCS(胎牛血清)溶液)。可以制备所述悬浮液的稀释系列。 应将该悬浮液的等分试样留存于2-8°C。密封所述平板(例如，用保鲜膜或铝箔)，并且在 室温下温育1小时或者于2-8°C在冰箱中温育过夜。所述平板用包含0. 1 % BSA和2mM EDTA但不含Ca2+或Mg2+离子的PBS溶液(pH 7. 4)洗涤5次。随后，将50 μ 1的包含Triton和ImM PMSF(苯基甲基磺酰氟)的细胞 裂解溶液移液到每个孔中。此外，将所留存的所有单核白细胞的悬浮液的等分试样，或者具 有所有在其表面携带抗原CD16的细胞的珠的等分试样移液到任意数目的(例如各2个) 孔中，并且向其掺以离50 μ 1所相差的体积的包含Triton和ImM PMSF(苯基甲基磺酰 氟)的细胞裂解溶液。此外，作为标准，制备重组PSA的稀释系列，例如在50pg/ml和2ng/ ml之间，在此将50μ 1的各浓度稀释液移液到各自至少两个空闲的孔中。现在将所述平板 于2-8°C放置5分钟，随后在超声波浴中处理5分钟(只将平板的底部浸在水浴中，安置在 紧靠水面之下的筐作为支撑物)。在将平板进行密封并在室温(1小时)或2_8°C (过夜)下进行温育之后，作为标 准，在细胞裂解溶液中制备经校准的LDH-阳性对照的稀释系列，例如从1/2500的稀释度开 始，在此将50μ 1的各浓度稀释液移液到各自至少两个空闲的孔中。随后，向平板的每个经 温育的孔中添加50 μ 1 LDH底物溶液，所述平板用铝箔密封成不透光的，并在室温下放置 30分钟。然后，给所有经温育的孔各掺以50 μ 1终止溶液(1Μ CH3C00H)，用针刺破所有大 的气泡，并且在ELISA平板阅读器中在492nm处测量所有孔的光吸收。所测量的吸收的强 度与细胞数目成比例，所述细胞数目基于标准来确定。现在，将所有的孔用包含0. 05%或0. 1% Tween-20的PBS溶液洗涤5次。接着， 将所述孔与来自山羊的、多克隆的、针对PSA的检测抗体(例如以在PBS中0. 5 μ g/ml的浓 度)一起在室温下温育1小时。现在，将所有的孔用包含0. 05%或0. 1 % Tween-20的PBS溶液再洗涤5次。添加 针对所述检测抗体的、与HRP(辣根过氧化物酶)相缀合的二抗(例如来自小鼠或兔)，例如以在PBS溶液(pH 7. 4)中2 μ g/ml的浓度。在室温下的温育时间再次为1小时。在将所有孔再次用包含0. 05%或0. Tween-20的PBS溶液洗涤5次之后，向每 个孔中添加100 μ 1的包含TMB (四甲基联苯胺)的底物溶液。在室温下的温育时间为15 分钟，然后将50 μ 1终止溶液(例如IM H2SO4)移液到各个孔中。最后，在ELISA平板阅读 器中在450nm波长处测量所述孔的光吸收，减去在570nm处的吸收。所测量的吸收的强度 与imPSA的量成比例，所述imPSA的量基于标准来确定。结果表示为，例如pg imPSA/细胞数目(⑶14+⑶16+细胞，或者⑶16+细胞，或者单 核白细胞)。实施例3 借助于磁珠，首先进行⑶14+单核细胞的正选择，随后进行⑶14+⑶16+群体的正选 择；在ELISA平板中，进行细胞数目测定以及分子标志物(此处为imPSA)的定量。从6ml全血开始，其置于包含聚酯凝胶和0. IM柠檬酸钠溶液的小管中。通过离心 血液(例如，1800Xg, 20分钟)，所有的单核白细胞与血小板一起在凝胶上方分离出来。分离出的细胞用PBS(磷酸盐缓冲盐水)溶液(pH 7. 4)洗涤两次以去除血小板， 所述PBS溶液另外还可以包含0. BSA(牛血清白蛋白)和2mM EDTA(乙二胺四乙酸盐)。将分离出的单核白细胞悬浮在0. 5ml的包含0. 1 % BSA和2mMEDTA但不含Ca2+或 Mg2+离子的PBS溶液(pH 7.4)中，可以取等分试样，溶解在确定体积的包含Triton和 ImM PMSF (苯基甲基磺酰氟)的细胞裂解溶液中，并且保存于2_8°C。将该悬浮液与10 μ g 与经修饰的DSB-X生物素相缀合的、针对细胞表面抗原CD14的抗体一起在摇动或摆动下于 2_8°C温育10分钟。将所述细胞离心(350 X g，8分钟)，并且在弃去上清液后重悬浮在0. 5ml的包含 0. 1% BSA和2mM EDTA但不含Ca2+或Mg2+离子的PBS溶液(pH 7. 4)中。添加适宜量的在 其表面上携带链霉抗生物素蛋白的磁珠，例如在300μ 1中IO8个珠。然后，将单核白细胞和磁珠的悬浮液于2_8°C摇动或摆动20分钟。在此，用链霉抗 生物素蛋白标记的珠与缀合有DSB-X生物素的抗体相结合，而所述抗体结合在具有表面抗 原⑶14的细胞上。随后，借助于合适的磁体来分离结合在磁珠上的细胞，其中弃去上清液。用包含 0. 1 % BSA和2mM EDTA但不含Ca2+或Mg2+离子的PBS溶液(pH 7. 4)洗涤所述珠数次，并 随后重悬浮在包含经修饰的生物素的细胞释放缓冲液中。将该悬浮液在室温下摇动或摆动 10分钟，随后进行珠与上清液的磁力分离。取上清液，进行离心(350 X g，8分钟)，并悬浮在 0. 5ml的包含0. 1 % BSA和2mM EDTA但不含Ca2+或Mg2+离子的PBS溶液(pH 7. 4)中。取 所述悬浮液的等分试样并进行离心，将粒状沉淀溶解在确定体积的包含Triton和ImM PMSF(苯基甲基磺酰氟)的细胞裂解溶液中，并留存于2-8°C。现在向该细胞悬浮液掺以适宜量的在其表面上携带针对细胞表面抗原⑶16的抗 体的磁珠，例如在100μ 1中4Χ107个珠，并且于2-8°C摇动或摆动20分钟。随后，借助 于合适的磁体来分离结合在磁珠上的细胞，其中弃去上清液。在添加确定体积的包含 Triton和ImM PMSF (苯基甲基磺酰氟)的细胞裂解溶液之前，用包含0. 1% BSA和2mMEDTA 但不含Ca2+或Mg2+离子的PBS溶液(pH 7.4)洗涤具有细胞的珠数次。将裂解物于2_8°C 放置至少5分钟。
现在将所有的细胞裂解物在超声波浴中处理5分钟，使用合适的磁体从相应的 裂解物中去除珠，并再一次进行离心(14000Xg，10分钟)。将确定体积的上清液(最多 100 μ 1)移液到96-孔Maxi-Sorp平板的每个孔中，所述96-孔Maxi-Sorp平板用针对PSA 的小鼠抗体(例如lug/ml的克隆ER-PR8)进行包被，并进行封闭(例如，用5% FCS(胎 牛血清)溶液)。作为PSA-标准，制备重组PSA的稀释系列，例如在50pg/ml和2ng/ml之 间，在此将确定体积的各浓度稀释液移液到各自至少两个空闲的孔中。此外，作为细胞数 目-标准，在细胞裂解溶液中制备经校准的LDH-阳性对照的稀释系列，例如从1/2500的稀 释度开始，在此将50μ1的各浓度稀释液移液到各自至少两个空闲的孔中。密封所述平板 (例如，用保鲜膜或铝箔)，并且在室温下温育1小时。随后，向平板的每个经温育的孔中添加50 μ 1 LDH底物溶液，所述平板用铝箔密封 成不透光的，并在室温下放置30分钟。然后，给所有经温育的孔各掺以50 μ 1终止溶液(1Μ CH3COOH)，用针刺破所有大的气泡，并且在ELISA平板阅读器中在492nm处测量所有孔的光 吸收。所测量的吸收的强度与细胞数目成比例，所述细胞数目基于细胞数目-标准来确定。现在，将所有的孔用包含0. 05%或0. 1% Tween-20的PBS溶液洗涤5次。接着， 将所述孔与来自山羊的、多克隆的、针对PSA的检测抗体(例如以在PBS溶液(pH 7.4)中 0. 5 μ g/ml的浓度)一起在室温下温育1小时。现在，将所有的孔用包含0. 05%或0. 1 % Tween-20的PBS溶液再洗涤5次。添加 针对所述检测抗体的、与HRP(辣根过氧化物酶)相缀合的二抗(例如来自小鼠或兔)，例如 以在PBS溶液(pH 7. 4)中2 μ g/ml的浓度。在室温下的温育时间再次为1小时。在将所有孔再次用包含0. 05%或0. Tween-20的PBS溶液洗涤5次之后，向每 个孔中添加100 μ 1的包含TMB (四甲基联苯胺)的底物溶液。在室温下的温育时间为15 分钟，然后将50 μ 1终止溶液(例如IM H2SO4)移液到各个孔中。最后，在ELISA平板阅读 器中在450nm波长处测量所述孔的光吸收，减去在570nm处的吸收。所测量的吸收的强度 与imPSA的量成比例，所述imPSA的量基于标准来确定。结果表示为，例如pg imPSA/细胞数目(⑶14+⑶16+细胞，或者⑶14+细胞，或者单 核白细胞)。实施例4:借助于磁珠，首先进行⑶16+群体的正选择，随后进行⑶14+⑶16+群体的正选择； 在ELISA平板中，进行细胞数目测定以及分子标志物(此处为imPSA)的定量。从6ml全血开始，其置于包含聚酯凝胶和0. IM柠檬酸钠溶液的小管中。通过离心 血液(例如，1800Xg, 20分钟)，所有的单核白细胞与血小板一起在凝胶上方分离出来。分离出的细胞用PBS(磷酸盐缓冲盐水)溶液(pH 7. 4)洗涤两次以去除血小板， 所述PBS溶液另外还可以包含0. BSA(牛血清白蛋白)和2mM EDTA(乙二胺四乙酸盐)。将分离出的单核白细胞悬浮在0. 5ml的包含0. 1 % BSA和2mMEDTA但不含Ca2+或 Mg2+离子的PBS溶液(pH 7.4)中，可以取等分试样，溶解在确定体积的包含Triton和 ImM PMSF (苯基甲基磺酰氟)的细胞裂解溶液中，并且保存于2_8°C。将该悬浮液与5 μ g 与经修饰的DSB-X生物素相缀合的、针对细胞表面抗原CD16的抗体一起在摇动或摆动下于 2_8°C温育10分钟。将所述细胞离心(350 X g，8分钟)，并且在弃去上清液后重悬浮在0. 5ml的包含
200. 1% BSA和2mM EDTA但不含Ca2+或Mg2+离子的PBS溶液(pH 7. 4)中。添加适宜量的在 其表面上携带链霉抗生物素蛋白的磁珠，例如在50μ 1中2Χ107个珠。然后，将单核白细胞和磁珠的悬浮液于2_8°C摇动或摆动20分钟。在此，用链霉抗 生物素蛋白标记的珠与缀合有DSB-X生物素的抗体相结合，而所述抗体结合在具有表面抗 原⑶16的细胞上。随后，借助于合适的磁体来分离结合在磁珠上的细胞，其中弃去上清液。用包含 0. 1 % BSA和2mM EDTA但不含Ca2+或Mg2+离子的PBS溶液(pH 7. 4)洗涤所述珠数次，并 随后重悬浮在包含经修饰的生物素的细胞释放缓冲液中。将该悬浮液在室温下摇动或摆动 10分钟，随后进行珠与上清液的磁力分离。取上清液，进行离心(350Xg，8分钟)，并悬浮 在0. 5ml的包含0. 1 % BSA和2mM EDTA但不含Ca2+或Mg2+离子的PBS溶液(pH 7. 4)中。 从中取确定体积的该悬浮液并进行离心，将粒状沉淀溶解在确定体积的包含Triton和 ImM PMSF (苯基甲基磺酰氟)的细胞裂解溶液中，并留存于2_8°C。现在向该细胞悬浮液掺以适宜量的在其表面上携带针对细胞表面抗原⑶14的抗 体的磁珠，例如在50 μ 1中2 X IO7个珠，并且于2-8°C摇动或摆动20分钟。随后，借助于合适 的磁体来分离结合在磁珠上的细胞，其中弃去上清液。在添加确定体积的包含Triton 和ImM PMSF (苯基甲基磺酰氟)的细胞裂解溶液之前，用包含0. 1% BSA和2mMEDTA但不 含Ca2+或Mg2+离子的PBS溶液(pH 7.4)洗涤具有细胞的珠数次。将裂解物于2_8°C放置 至少5分钟。现在将所有的细胞裂解物在超声波浴中处理5分钟，使用合适的磁体从相应的 裂解物中去除珠，并再一次进行离心(14000Xg，10分钟)。将确定体积的上清液(最多 100 μ 1)移液到96-孔Maxi-Sorp平板的每个孔中，所述96-孔Maxi-Sorp平板用针对PSA 的小鼠抗体(例如ι μ g/ml的克隆ER-PR8)进行包被，并进行封闭(例如，用5% FCS (胎 牛血清)溶液)。作为PSA-标准，制备重组PSA的稀释系列，例如在50pg/ml和2ng/ml之 间，在此将确定体积的各浓度稀释液移液到各自至少两个空闲的孔中。此外，作为细胞数 目-标准，在细胞裂解溶液中制备经校准的LDH-阳性对照的稀释系列，例如从1/2500的稀 释度开始，在此将50μ 1的各浓度稀释液移液到各自至少两个空闲的孔中。密封所述平板 (例如，用保鲜膜或铝箔)，并且在室温下温育1小时。随后，向平板的每个经温育的孔中添加50 μ 1 LDH底物溶液，所述平板用铝箔密封 成不透光的，并在室温下放置30分钟。然后，给所有经温育的孔各掺以50 μ 1终止溶液(1Μ CH3COOH)，用针刺破所有大的气泡，并且在ELISA平板阅读器中在492nm处测量所有孔的光 吸收。所测量的吸收的强度与细胞数目成比例，所述细胞数目基于细胞数目-标准来确定。现在，将所有的孔用包含0. 05%或0. 1% Tween-20的PBS溶液洗涤5次。接着， 将所述孔与来自山羊的、多克隆的、针对PSA的检测抗体(例如以在PBS溶液(pH 7.4)中 0. 5 μ g/ml的浓度)一起在室温下温育1小时。现在，将所有的孔用包含0.05%或0. 1% Tween-20的PBS溶液再洗涤5次。添加 针对所述检测抗体的、与HRP(辣根过氧化物酶)相缀合的二抗(例如来自小鼠或兔)，例如 以在PBS溶液(pH 7. 4)中2 μ g/ml的浓度。在室温下的温育时间再次为1小时。在将所有孔再次用包含0. 05%或0. Tween-20的PBS溶液洗涤5次之后，向每 个孔中添加100 μ 1的包含TMB (四甲基联苯胺)的底物溶液。在室温下的温育时间为15
21分钟，然后将50 μ 1终止溶液(例如IM H2SO4)移液到各个孔中。最后，在ELISA平板阅读 器中在450nm波长处测量所述孔的光吸收，减去在570nm处的吸收。所测量的吸收的强度 与imPSA的量成比例，所述imPSA的量基于标准来确定。结果表示为，例如pg imPSA/细胞数目(⑶14+⑶16+细胞，或者⑶16+细胞，或者单 核白细胞)。实施例5:借助于磁珠进行CD16+群体的正选择；在ELISA平板中，进行细胞数目测定以及分 子标志物(此处为imPSA)的定量。从6ml全血开始，其置于包含聚酯凝胶和0. IM柠檬酸钠溶液的小管中。通过离心 血液(例如，1800Xg, 20分钟)，所有的单核白细胞与血小板一起在凝胶上方分离出来。分离出的细胞用PBS(磷酸盐缓冲盐水)溶液(pH 7. 4)洗涤两次以去除血小板， 所述PBS溶液另外还可以包含0. 1%BSA(牛血清白蛋白)和2mM EDTA(乙二胺四乙酸盐)。将分离出的单核白细胞悬浮在0. 5ml的包含0. 1% BSA和2mMEDTA但不含Ca2+或 Mg2+离子的PBS溶液(pH 7.4)中，可以取等分试样，溶解在确定体积的包含Triton和 ImM PMSF (苯基甲基磺酰氟)的细胞裂解溶液中，并且保存于2_8°C。向该悬浮液掺以适宜 量的、在其表面上携带针对细胞表面抗原CD16的抗体的磁珠，例如在50 μ 1中2 X IO7个珠。 备选地，可以将5 μ g与经修饰的DSB-X生物素相缀合的、针对细胞表面抗原CD16的抗体在 摇动或摆动下于2-8°C温育10分钟，随后添加适宜量的、在其表面上携带链霉抗生物素蛋 白的磁珠，例如在50 μ 1中2 X IO7个珠。然后，将单核白细胞和磁珠的悬浮液于2-8°C摇动或摆动20分钟。在此，与抗体 相偶联的珠或者用链霉抗生物素蛋白标记的珠与在其表面上携带抗原CD16的细胞或者与 缀合有DSB-X生物素的抗体相结合，所述缀合有DSB-X生物素的抗体结合在具有表面抗原 ⑶16的细胞上。随后，借助于合适的磁体来分离结合在磁珠上的细胞，其中弃去上清液。用包含 0. 1 % BSA和2mM EDTA但不含Ca2+或Mg2+离子的PBS溶液(pH 7. 4)洗涤所述珠数次，并 且随后溶解在确定体积的包含If^jTriton和ImM PMSF(苯基甲基磺酰氟)的细胞裂解溶液 中，并留存于2-8°C。现在将所有的细胞裂解物在超声波浴中处理5分钟，使用合适的磁体从相应的 裂解物中去除珠，并再一次进行离心(14000Xg，10分钟)。将确定体积的上清液(最多 100 μ 1)移液到96-孔Maxi-Sorp平板的每个孔中，所述96-孔Maxi-Sorp平板用针对PSA 的小鼠抗体(例如lug/ml的克隆ER-PR8)进行包被，并进行封闭(例如，用5% FCS(胎 牛血清)溶液)。作为PSA-标准，制备重组PSA的稀释系列，例如在50pg/ml和2ng/ml之 间，在此将确定体积的各浓度稀释液移液到各自至少两个空闲的孔中。此外，作为细胞数 目-标准，在细胞裂解溶液中制备经校准的LDH-阳性对照的稀释系列，例如从1/2500的稀 释度开始，在此将50μ1的各浓度稀释液移液到各自至少两个空闲的孔中。密封所述平板 (例如，用保鲜膜或铝箔)，并且在室温下温育1小时。随后，向平板的每个经温育的孔中添加50 μ 1 LDH底物溶液，所述平板用铝箔密封 成不透光的，并在室温下放置30分钟。然后，给所有经温育的孔各掺以50 μ 1终止溶液(1Μ CH3COOH)，用针刺破所有大的气泡，并且在ELISA平板阅读器中在492nm处测量所有孔的光吸收。所测量的吸收的强度与细胞数目成比例，所述细胞数目基于细胞数目-标准来确定。现在，将所有的孔用包含0. 05%或0. 1% Tween-20的PBS溶液洗涤5次。接着， 将所述孔与来自山羊的、多克隆的、针对PSA的检测抗体(例如以在PBS溶液(pH 7.4)中 0. 5 μ g/ml的浓度)一起在室温下温育1小时。现在，将所有的孔用包含0.05%或0. 1% Tween-20的PBS溶液再洗涤5次。添加 针对所述检测抗体的、与HRP(辣根过氧化物酶)相缀合的二抗(例如来自小鼠或兔)，例如 以在PBS溶液(pH 7. 4)中2 μ g/ml的浓度。在室温下的温育时间再次为1小时。在将所有孔再次用包含0.05%或0. Tween-20的PBS溶液洗涤5次之后，向每 个孔中添加100 μ 1的包含TMB (四甲基联苯胺)的底物溶液。在室温下的温育时间为15 分钟，然后将50 μ 1终止溶液(例如IM H2SO4)移液到各个孔中。最后，在ELISA平板阅读 器中在450nm波长处测量所述孔的光吸收，减去在570nm处的吸收。所测量的吸收的强度 与imPSA的量成比例，所述imPSA的量基于标准来确定。结果表示为，例如pg imPSA/细胞数目(⑶16+细胞，或者单核白细胞)。实施例6:借助于磁珠，进行⑶16+群体的正选择，随后进行⑶16+⑶56—或⑶16+⑶57—或 ⑶16+CD161_群体的负选择；在ELISA平板中，进行细胞数目测定以及分子标志物(此处为 imPSA)的定量。从6ml全血开始，其置于包含聚酯凝胶和0. IM柠檬酸钠溶液的小管中。通过离心 血液(例如，1800Xg, 20分钟)，所有的单核白细胞与血小板一起在凝胶上方分离出来。分离出的细胞用PBS(磷酸盐缓冲盐水)溶液(pH 7. 4)洗涤两次以去除血小板， 所述PBS溶液另外还可以包含0. 1%BSA(牛血清白蛋白)和2mM EDTA(乙二胺四乙酸盐)。将分离出的单核白细胞悬浮在0. 5ml的包含0. 1% BSA和2mMEDTA但不含Ca2+或 Mg2+离子的PBS溶液(pH 7.4)中，可以取等分试样，溶解在确定体积的包含Triton和 ImM PMSF (苯基甲基磺酰氟)的细胞裂解溶液中，并且保存于2_8°C。向该悬浮液掺以适宜 量的、在其表面上携带针对细胞表面抗原CD16的抗体的磁珠，例如在50 μ 1中2 X IO7个珠。 备选地，可以将5 μ g与经修饰的DSB-X生物素相缀合的、针对细胞表面抗原CD16的抗体在 摇动或摆动下于2-8°C温育10分钟，随后添加适宜量的、在其表面上携带链霉抗生物素蛋 白的磁珠，例如在50 μ 1中2 X IO7个珠。然后，将单核白细胞和磁珠的悬浮液于2_8°C摇动或摆动20分钟。在此，与抗体 相偶联的珠或者用链霉抗生物素蛋白标记的珠与在其表面上携带抗原CD16的细胞或者与 缀合有DSB-X生物素的抗体相结合，所述缀合有DSB-X生物素的抗体结合在具有表面抗原 ⑶16的细胞上。随后，借助于合适的磁体来分离结合在磁珠上的细胞，其中弃去上清液。用包含 0. 1 % BSA和2mM EDTA但不含Ca2+或Mg2+离子的PBS溶液(pH 7. 4)洗涤所述珠数次，并 随后重悬浮在包含经修饰的生物素的细胞释放缓冲液中。将该悬浮液在室温下摇动或摆动 10分钟，随后进行珠与上清液的磁力分离。取上清液，进行离心(350Xg，8分钟)，并悬浮 在0. 5ml的包含0. 1 % BSA和2mM EDTA但不含Ca2+或Mg2+离子的PBS溶液(pH 7. 4)中。 从中取确定体积的该悬浮液并进行离心，将粒状沉淀溶解在确定体积的包含Triton和 ImM PMSF (苯基甲基磺酰氟)的细胞裂解溶液中，并留存于2_8°C。
现在向该细胞悬浮液掺以适宜量的在其表面上携带针对细胞表面抗原⑶56或 ⑶57或⑶161的抗体的磁珠，例如在50 μ 1中2X IO7个珠。备选地，可以将5 μ g与经修饰 的DSB-X生物素相缀合的、针对细胞表面抗原CD56或CD57或CD161的抗体在摇动或摆动 下于2-8°C温育10分钟，随后添加适宜量的、在其表面上携带链霉抗生物素蛋白的磁珠，例 如在50μ 1中2X IO7个珠。在于2_8°C进行20分钟的摇动或摆动后，借助于合适的磁体来分离结合在磁珠上 的细胞，其中留存上清液。用包含0.1% BSA和2mMEDTA但不含Ca2+或Mg2+离子的PBS溶 液(PH 7.4)洗涤具有细胞的珠数次，将洗涤溶液添加至上清液并且也留存，弃去所述珠。 离心所述上清液溶液(350Xg，8分钟)，向细胞粒状沉淀添加确定体积的包含Triton 和ImM PMSF(苯基甲基磺酰氟)的细胞裂解溶液。将裂解物于2_8°C放置至少5分钟。现在将所有的细胞裂解物在超声波浴中处理5分钟，并再一次进行离心 (14000Xg, 10分钟)。将确定体积的上清液(最多100 μ 1)移液到96-孔Maxi-Sorp平 板的每个孔中，所述96-孔Maxi-Sorp平板用针对PSA的小鼠抗体(例如1 μ g/ml的克隆 ER-PR8)进行包被，并进行封闭(例如，用5% FCS(胎牛血清)溶液)。作为PSA-标准，制 备重组PSA的稀释系列，例如在50pg/ml和2ng/ml之间，在此将确定体积的各浓度稀释液 移液到各自至少两个空闲的孔中。此外，作为细胞数目-标准，在细胞裂解溶液中制备经校 准的LDH-阳性对照的稀释系列，例如从1/2500的稀释度开始，在此将50 μ 1的各浓度稀释 液移液到各自至少两个空闲的孔中。密封所述平板(例如，用保鲜膜或铝箔)，并且在室温 下温育1小时。随后，向平板的每个经温育的孔中添加50 μ 1 LDH底物溶液，所述平板用铝箔密封 成不透光的，并在室温下放置30分钟。然后，给所有经温育的孔各掺以50 μ 1终止溶液(1Μ CH3COOH)，用针刺破所有大的气泡，并且在ELISA平板阅读器中在492nm处测量所有孔的光 吸收。所测量的吸收的强度与细胞数目成比例，所述细胞数目基于细胞数目-标准来确定。现在，将所有的孔用包含0. 05%或0. 1% Tween-20的PBS溶液洗涤5次。接着， 将所述孔与来自山羊的、多克隆的、针对PSA的检测抗体(例如以在PBS溶液(pH 7.4)中 0. 5 μ g/ml的浓度)一起在室温下温育1小时。现在，将所有的孔用包含0.05%或0. 1% Tween-20的PBS溶液再洗涤5次。添加 针对所述检测抗体的、与HRP(辣根过氧化物酶)相缀合的二抗(例如来自小鼠或兔)，例如 以在PBS溶液(pH 7. 4)中2 μ g/ml的浓度。在室温下的温育时间再次为1小时。在将所有孔再次用包含0. 05%或0. Tween-20的PBS溶液洗涤5次之后，向每 个孔中添加100 μ 1的包含TMB (四甲基联苯胺)的底物溶液。在室温下的温育时间为15 分钟，然后将50 μ 1终止溶液(例如IM H2SO4)移液到各个孔中。最后，在ELISA平板阅读 器中在450nm波长处测量所述孔的光吸收，减去在570nm处的吸收。所测量的吸收的强度 与imPSA的量成比例，所述imPSA的量基于标准来确定。结果表示为，例如pgimPSA/细胞数目(CD16+CD56-或CD16+CD57-或CD16+CD16r细 胞，或者CD16+细胞，或者单核白细胞)。实施例7:借助于磁珠，进行⑶56—或⑶57—或⑶16Γ群体的负选择，随后进行⑶16+⑶56—或 ⑶16+CD57—或⑶16+⑶16Γ群体的正选择；在ELISA平板中，进行细胞数目测定以及分子标志物(此处为imPSA)的定量。从6ml全血开始，其置于包含聚酯凝胶和0. IM柠檬酸钠溶液的小管中。通过离心 血液(例如，1800Xg, 20分钟)，所有的单核白细胞与血小板一起在凝胶上方分离出来。分离出的细胞用PBS(磷酸盐缓冲盐水)溶液(pH 7. 4)洗涤两次以去除血小板， 所述PBS溶液另外还可以包含0. 1%BSA(牛血清白蛋白)和2mM EDTA(乙二胺四乙酸盐)。将分离出的单核白细胞悬浮在0. 5ml的包含0. 1% BSA和2mMEDTA但不含Ca2+ 或Mg2+离子的PBS溶液(pH 7.4)中，可以取等分试样，溶解在确定体积的包含Triton 和ImM PMSF(苯基甲基磺酰氟)的细胞裂解溶液中，并且保存于2-8°C。向该悬浮液掺以 适宜量的、在其表面上携带针对细胞表面抗原CD56或CD57或CD161的抗体的磁珠，例如在 50 μ 1中2X IO7个珠。备选地，可以将5 μ g与经修饰的DSB-X生物素相缀合的、针对细胞 表面抗原⑶56或⑶57或⑶161的抗体在摇动或摆动下于2-8°C温育10分钟，随后添加适 宜量的、在其表面上携带链霉抗生物素蛋白的磁珠，例如在50μ1中2Χ107个珠。然后，将单核白细胞和磁珠的悬浮液于2_8°C摇动或摆动20分钟。在此，与抗体相 偶联的珠或者用链霉抗生物素蛋白标记的珠与在其表面上携带抗原CD56或CD57或CD161 的细胞或者与缀合有DSB-X生物素的抗体相结合，所述缀合有DSB-X生物素的抗体结合在 具有表面抗原⑶56或⑶57或⑶161的细胞上。随后，借助于合适的磁体来分离结合在磁珠上的细胞，其中留存上清液。用包含 0. 1 % BSA和2mM EDTA但不含Ca2+或Mg2+离子的PBS溶液(pH 7. 4)洗涤所述珠数次，将 洗涤溶液添加至上清液并且也留存，弃去所述珠。离心所述上清液溶液(350Xg，8分钟)， 将粒状沉淀悬浮在0. 5ml的包含0. 1 % BSA和2mM EDTA但不含Ca2+或Mg2+离子的PBS溶 液(pH 7.4)中。从中取确定体积的该悬浮液并进行离心，将粒状沉淀溶解在确定体积的包 含Triton和ImM PMSF(苯基甲基磺酰氟)的细胞裂解溶液中，并留存于2_8°C。现在向该细胞悬浮液掺以适宜量的在其表面上携带针对细胞表面抗原⑶16的抗 体的磁珠，例如在50 μ 1中2 X IO7个珠。备选地，可以将5 μ g与经修饰的DSB-X生物素相 缀合的、针对细胞表面抗原CD16的抗体在摇动或摆动下于2-8°C温育10分钟，随后添加适 宜量的、在其表面上携带链霉抗生物素蛋白的磁珠，例如在50μ1中2Χ107个珠。在于2_8°C进行20分钟的摇动或摆动后，借助于合适的磁体来分离结合在磁珠上 的细胞，其中弃去上清液。用包含0. 1 % BSA和2mMEDTA但不含Ca2+或Mg2+离子的PBS溶 液(pH 7.4)洗涤具有细胞的珠数次，并且随后溶解在确定体积的包含Triton和ImM PMSF(苯基甲基磺酰氟)的细胞裂解溶液中，并于2-8°C放置至少5分钟。现在将所有的细胞裂解物在超声波浴中处理5分钟，并再一次进行离心 (14000Xg, 10分钟)。将确定体积的上清液(最多100 μ 1)移液到96-孔Maxi-Sorp平 板的每个孔中，所述96-孔Maxi-Sorp平板用针对PSA的小鼠抗体(例如1 μ g/ml的克隆 ER-PR8)进行包被，并进行封闭(例如，用5% FCS(胎牛血清)溶液)。作为PSA-标准，制 备重组PSA的稀释系列，例如在50pg/ml和2ng/ml之间，在此将确定体积的各浓度稀释液 移液到各自至少两个空闲的孔中。此外，作为细胞数目-标准，在细胞裂解溶液中制备经校 准的LDH-阳性对照的稀释系列，例如从1/2500的稀释度开始，在此将50 μ 1的各浓度稀释 液移液到各自至少两个空闲的孔中。密封所述平板(例如，用保鲜膜或铝箔)，并且在室温 下温育1小时。
随后，向平板的每个经温育的孔中添加50 μ 1 LDH底物溶液，所述平板用铝箔密封 成不透光的，并在室温下放置30分钟。然后，给所有经温育的孔各掺以50 μ 1终止溶液(1Μ CH3COOH)，用针刺破所有大的气泡，并且在ELISA平板阅读器中在492nm处测量所有孔的光 吸收。所测量的吸收的强度与细胞数目成比例，所述细胞数目基于细胞数目-标准来确定。现在，将所有的孔用包含0. 05%或0. 1% Tween-20的PBS溶液洗涤5次。接着， 将所述孔与来自山羊的、多克隆的、针对PSA的检测抗体(例如以在PBS溶液(pH 7.4)中 0. 5 μ g/ml的浓度)一起在室温下温育1小时。现在，将所有的孔用包含0.05%或0. 1% Tween-20的PBS溶液再洗涤5次。添加 针对所述检测抗体的、与HRP(辣根过氧化物酶)相缀合的二抗(例如来自小鼠或兔)，例如 以在PBS溶液(pH 7. 4)中2 μ g/ml的浓度。在室温下的温育时间再次为1小时。在将所有孔再次用包含0. 05%或0. Tween-20的PBS溶液洗涤5次之后，向每 个孔中添加100 μ 1的包含TMB (四甲基联苯胺)的底物溶液。在室温下的温育时间为15 分钟，然后将50 μ 1终止溶液(例如IM H2SO4)移液到各个孔中。最后，在ELISA平板阅读 器中在450nm波长处测量所述孔的光吸收，减去在570nm处的吸收。所测量的吸收的强度 与imPSA的量成比例，所述imPSA的量基于标准来确定。结果表示为，例如pgimPSA/细胞数目(CD16+CD56-或CD16+CD57-或CD16+CD16r细 胞，或者CD56_或CD57_或CD161_细胞，或者单核白细胞)。实施例8:借助于磁珠来进行⑶56_或⑶57_或⑶161_群体的负选择；在ELISA平板中，进行 ⑶16+CD56_或⑶16+⑶57_或⑶16+CD161_群体的正选择、细胞数目测定以及分子标志物(此 处为imPSA)的定量。从6ml全血开始，其置于包含聚酯凝胶和0. IM柠檬酸钠溶液的小管中。通过离心 血液(例如，1800Xg, 20分钟)，所有的单核白细胞与血小板一起在凝胶上方分离出来。分离出的细胞用PBS(磷酸盐缓冲盐水)溶液(pH 7. 4)洗涤两次以去除血小板， 所述PBS溶液另外还可以包含0. BSA(牛血清白蛋白)和2mM EDTA(乙二胺四乙酸盐)。将分离出的单核白细胞悬浮在0. 5ml的包含0. 1% BSA和2mMEDTA但不含Ca2+ 或Mg2+离子的PBS溶液(pH 7.4)中，可以取等分试样，溶解在确定体积的包含Triton 和ImM PMSF(苯基甲基磺酰氟)的细胞裂解溶液中，并且保存于2-8°C。向该悬浮液掺以 适宜量的、在其表面上携带针对细胞表面抗原CD56或CD57或CD161的抗体的磁珠，例如在 50 μ 1中2X IO7个珠。备选地，可以将5 μ g与经修饰的DSB-X生物素相缀合的、针对细胞 表面抗原⑶56或⑶57或⑶161的抗体在摇动或摆动下于2-8°C温育10分钟，随后添加适 宜量的、在其表面上携带链霉抗生物素蛋白的磁珠，例如在50μ1中2Χ107个珠。然后，将单核白细胞和磁珠的悬浮液于2_8°C摇动或摆动20分钟。在此，与抗体相 偶联的珠或者用链霉抗生物素蛋白标记的珠与在其表面上携带抗原CD56或CD57或CD161 的细胞或者与缀合有DSB-X生物素的抗体相结合，所述缀合有DSB-X生物素的抗体结合在 具有表面抗原⑶56或⑶57或⑶161的细胞上。随后，借助于合适的磁体来分离结合在磁珠上的细胞，其中留存上清液。用包含 0. 1 % BSA和2mM EDTA但不含Ca2+或Mg2+离子的PBS溶液(pH 7. 4)洗涤所述珠数次，将 洗涤溶液添加至上清液并且也留存，弃去所述珠。离心所述上清液溶液(350Xg，8分钟)，将粒状沉淀悬浮在0. 5ml的包含0. 1 % BSA和2mM EDTA但不含Ca2+或Mg2+离子的PBS溶 液(pH 7.4)中。将确定体积的细胞悬浮液(最多100 μ 1)移液到96-孔Maxi-Sorp平板的每个孔 中，所述96-孔Maxi-Sorp平板不仅用针对细胞表面抗原CD16的小鼠抗体(例如，5 μ g/ml 的克隆3G8)而且用针对PSA的小鼠抗体(例如，1 μ g/ml的克隆ER-PR8)进行包被，并进行 封闭(例如，用5% FCS(胎牛血清)溶液)。可以制备所述悬浮液的稀释系列。应将该悬 浮液的剩余体积留存，但暂时不冷冻。密封所述平板(例如，用保鲜膜或铝箔)，并且在室温 下温育1小时或者于2-8°C在冰箱中温育过夜。所述平板用包含0. 1 % BSA和2mM EDTA但不含Ca2+或Mg2+离子的PBS溶液(pH 7. 4)洗涤5次。随后，将50μ 1的包含1Triton和ImM PMSF(苯基甲基磺酰氟)的细 胞裂解溶液移液到每个孔中。此外，将25 μ 1所留存的所有在其表面上不携带抗原CD56或 CD57或CD161的细胞的悬浮液移液到任意数目的(例如2个)孔中，并且向其掺以相同体 积的包含Triton和ImM PMSF(苯基甲基磺酰氟)的细胞裂解溶液。此外，作为标准， 制备重组PSA的稀释系列，例如在50pg/ml和2ng/ml之间，在此将50 μ 1的各浓度稀释液 移液到各自至少两个空闲的孔中。现在将所述平板于2-8°C放置5分钟，随后在超声波浴中 处理5分钟(只将平板的底部浸在水浴中，安置在紧靠水面之下的筐作为支撑物)。在将平板进行密封并在室温(1小时)或2_8°C (过夜)下进行温育之后，作为标 准，在细胞裂解溶液中制备经校准的LDH-阳性对照的稀释系列，例如从1/2500的稀释度开 始，在此将50μ 1的各浓度稀释液移液到各自至少两个空闲的孔中。随后，向平板的每个经 温育的孔中添加50 μ 1 LDH底物溶液，所述平板用铝箔密封成不透光的，并在室温下放置 30分钟。然后，给所有经温育的孔各掺以50 μ 1终止溶液(1Μ CH3COOH),用针刺破所有大 的气泡，并且在ELISA平板阅读器中在492nm处测量所有孔的光吸收。所测量的吸收的强 度与细胞数目成比例，所述细胞数目基于标准来确定。现在，将所有的孔用包含0. 05%或0. 1% Tween-20的PBS溶液洗涤5次。接着， 将所述孔与来自山羊的、多克隆的、针对PSA的检测抗体(例如以在PBS溶液(pH 7.4)中 0. 5 μ g/ml的浓度)一起在室温下温育1小时。现在，将所有的孔用包含0.05%或0. 1% Tween-20的PBS溶液再洗涤5次。添加 针对所述检测抗体的、与HRP(辣根过氧化物酶)相缀合的二抗(例如来自小鼠或兔)，例如 以在PBS溶液(pH 7. 4)中2 μ g/ml的浓度。在室温下的温育时间再次为1小时。在将所有孔再次用包含0.05%或0. Tween-20的PBS溶液洗涤5次之后，向每 个孔中添加100 μ 1的包含TMB (四甲基联苯胺)的底物溶液。在室温下的温育时间为15 分钟，然后将50 μ 1终止溶液(例如IM H2SO4)移液到各个孔中。最后，在ELISA平板阅读 器中在450nm波长处测量所述孔的光吸收，减去在570nm处的吸收。所测量的吸收的强度 与imPSA的量成比例，所述imPSA的量基于标准来确定。结果表示为，例如pgimPSA/细胞数目(CD16+CD56-或CD16+CD57-或CD16+CD16r细 胞，或者CD56_或CD57_或CD161_细胞，或者单核白细胞)。实施例9:借助于一次使用磁珠来进行⑶16+⑶56—或⑶16+⑶57—或⑶16+CD161—群体的正选 择；在ELISA平板中，进行细胞数目测定以及分子标志物(此处为imPSA)的定量。
从6ml全血开始，其置于包含聚酯凝胶和0. IM柠檬酸钠溶液的小管中。通过离心 血液(例如，1800Xg, 20分钟)，所有的单核白细胞与血小板一起在凝胶上方分离出来。分离出的细胞用PBS(磷酸盐缓冲盐水)溶液(pH 7. 4)洗涤两次以去除血小板， 所述PBS溶液另外还可以包含0. BSA(牛血清白蛋白)和2mM EDTA(乙二胺四乙酸盐)。将分离出的单核白细胞悬浮在0. 5ml的包含0. 1% BSA和2mMEDTA但不含Ca2+或 Mg2+离子的PBS溶液(pH 7.4)中，可以取等分试样，溶解在确定体积的包含Triton和 ImM PMSF(苯基甲基磺酰氟)的细胞裂解溶液中，并且保存于2_8°C。向该悬浮液掺以5yg 与经修饰的DSB-X生物素相缀合的、针对细胞表面抗原CD16的抗体以及掺以等量的(5yg) 与生物素相缀合的、针对细胞表面抗原CD56或CD57或CD161的抗体。将该悬浮液在摇动 或摆动下于2-8°C温育10分钟，随后添加适宜量的、在其表面上携带链霉抗生物素蛋白的 磁珠，例如在50 μ 1中2 X IO7个珠。然后，将单核白细胞和磁珠的悬浮液于2_8°C摇动或摆动20分钟。在此，用链霉抗 生物素蛋白标记的珠与缀合有生物素以及缀合有DSB-X生物素的抗体相结合，而所述抗体 结合在具有表面抗原⑶56或⑶57或⑶161或者具有表面抗原⑶16的细胞上。随后，借助于合适的磁体来分离结合在磁珠上的细胞，其中弃去上清液。用包含 0. 1 % BSA和2mM EDTA但不含Ca2+或Mg2+离子的PBS溶液(pH 7. 4)洗涤所述珠数次，弃 去洗涤溶液，随后将所述珠重悬浮在包含经修饰的生物素的细胞释放缓冲液中。将该悬浮 液在室温下摇动或摆动10分钟，随后进行珠与上清液的磁力分离。取仅包含0016+0056_或 ⑶16+CD57—或⑶16+CD161—细胞的上清液，进行离心(350Xg,8分钟)，将粒状沉淀溶解在确 定体积的包含Triton和ImMPMSF (苯基甲基磺酰氟)的细胞裂解溶液中，并于2_8°C放 置至少5分钟。现在将所有的细胞裂解物在超声波浴中处理5分钟，并再一次进行离心 (14000Xg, 10分钟)。将确定体积的上清液(最多100 μ 1)移液到96-孔Maxi-Sorp平 板的每个孔中，所述96-孔Maxi-Sorp平板用针对PSA的小鼠抗体(例如1 μ g/ml的克隆 ER-PR8)进行包被，并进行封闭(例如，用5% FCS(胎牛血清)溶液)。作为PSA-标准，制 备重组PSA的稀释系列，例如在50pg/ml和2ng/ml之间，在此将确定体积的各浓度稀释液 移液到各自至少两个空闲的孔中。此外，作为细胞数目-标准，在细胞裂解溶液中制备经校 准的LDH-阳性对照的稀释系列，例如从1/2500的稀释度开始，在此将50 μ 1的各浓度稀释 液移液到各自至少两个空闲的孔中。密封所述平板(例如，用保鲜膜或铝箔)，并且在室温 下温育1小时。随后，向平板的每个经温育的孔中添加50 μ 1 LDH底物溶液，所述平板用铝箔密封 成不透光的，并在室温下放置30分钟。然后，给所有经温育的孔各掺以50 μ 1终止溶液(1Μ CH3COOH)，用针刺破所有大的气泡，并且在ELISA平板阅读器中在492nm处测量所有孔的光 吸收。所测量的吸收的强度与细胞数目成比例，所述细胞数目基于细胞数目-标准来确定。现在，将所有的孔用包含0. 05%或0. 1% Tween-20的PBS溶液洗涤5次。接着， 将所述孔与来自山羊的、多克隆的、针对PSA的检测抗体(例如以在PBS溶液(pH 7.4)中 0. 5 μ g/ml的浓度)一起在室温下温育1小时。现在，将所有的孔用包含0.05%或0. 1% Tween-20的PBS溶液再洗涤5次。添加 针对所述检测抗体的、与HRP(辣根过氧化物酶)相缀合的二抗(例如来自小鼠或兔)，例如
28以在PBS溶液(pH 7. 4)中2 μ g/ml的浓度。在室温下的温育时间再次为1小时。在将所有孔再次用包含0. 05%或0. Tween-20的PBS溶液洗涤5次之后，向每 个孔中添加100 μ 1的包含TMB (四甲基联苯胺)的底物溶液。在室温下的温育时间为15 分钟，然后将50 μ 1终止溶液(例如IM H2SO4)移液到各个孔中。最后，在ELISA平板阅读 器中在450nm波长处测量所述孔的光吸收，减去在570nm处的吸收。所测量的吸收的强度 与imPSA的量成比例，所述imPSA的量基于标准来确定。结果表示为，例如pgimPSA/细胞数目(CD16+CD56-或CD16+CD57-或CD16+CD16r细 胞，或者单核白细胞)。实施例10 如在实施例3、4、5、6、7和9中所描述的，借助于磁珠来分离CD14+CD16+或者CD16+ 或者⑶16+⑶56-或⑶16+⑶57-或⑶16+CD16r群体；在此之前或在此之后添加针对分子标 志物(此处为imPSA)的抗体，在对细胞进行透透化的情形下；在ELISA平板中，进行细胞数 目测定以及分子标志物(此处为imPSA)的定量。对于根据实施例9来分离⑶16+⑶56-或⑶16+⑶57—或⑶16+CD16r群体所描述的 实施过程从6ml全血开始，其置于包含聚酯凝胶和0. IM柠檬酸钠溶液的小管中。通过离心 血液(例如，1800Xg, 20分钟)，所有的单核白细胞与血小板一起在凝胶上方分离出来。分离出的细胞用PBS(磷酸盐缓冲盐水)溶液(pH 7. 4)洗涤两次以去除血小板， 所述PBS溶液另外还可以包含0. 1%BSA(牛血清白蛋白)和2mM EDTA(乙二胺四乙酸盐)。将分离出的单核白细胞悬浮在0. 5ml的包含0. 1% BSA和2mMEDTA但不含Ca2+或 Mg2+离子的PBS溶液(pH 7. 4)中，并向其掺以5 μ g与经修饰的DSB-X生物素相缀合的、针 对细胞表面抗原CD16的抗体以及掺以等量的(5yg)与生物素相缀合的、针对细胞表面抗 原⑶56或⑶57或⑶161的抗体。将该悬浮液在摇动或摆动下于2-8°C温育10分钟。在 用PBS溶液(pH 7. 4)进行的洗涤步骤后，将所述细胞悬浮在0. 5ml固定试剂(例如的 福尔马林溶液)中，在10分钟后用PBS溶液(pH 7.4)进行洗涤，然后接纳在100 μ 1渗透 化介质中，并且与针对PSA的、缀合有HRP (辣根过氧化物酶)或生物素的小鼠抗体(例如
1μ g/ml的克隆ER-PR8) —起温育大约20分钟。然后，所述细胞用PBS溶液(pH 7. 4)进 行洗涤，并悬浮在0. 5ml的包含0. 1 % BSA和2mM EDTA但不含Ca2+或Mg2+离子的PBS溶液 (pH 7.4)中；可以取等分试样，溶解在确定体积的包含Triton和ImM PMSF(苯基甲基 磺酰氟)的细胞裂解溶液中，并保存于2-8°C。随后，添加适宜量的、在其表面上携带链霉 抗生物素蛋白的磁珠，例如在50μ1中2X IO7个珠。备选地，在这一方案的该位置处可以 不进行用固定试剂和渗透化介质处理细胞，其中在获取等分试样(其溶解在确定体积的包 含Triton和ImM PMSF (苯基甲基磺酰氟)的细胞裂解溶液中，并保存于2_8°C )之后， 立即将所述细胞与适宜量的、在其表面上携带链霉抗生物素蛋白的磁珠(例如在50μ 1中
2X IO7个珠)一起进行温育。然后，将单核白细胞和磁珠的悬浮液于2_8°C摇动或摆动20分钟。在此，用链霉抗 生物素蛋白标记的珠与缀合有生物素以及缀合有DSB-X生物素的抗体相结合，而所述抗体 结合在具有表面抗原⑶56或⑶57或⑶161或者具有表面抗原⑶16的细胞上。随后，借助于合适的磁体来分离结合在磁珠上的细胞，其中弃去上清液。用包含
290. 1 % BSA和2mM EDTA但不含Ca2+或Mg2+离子的PBS溶液(pH 7. 4)洗涤所述珠数次，弃 去洗涤溶液，随后将所述珠重悬浮在包含经修饰的生物素的细胞释放缓冲液中。将该悬浮 液在室温下摇动或摆动10分钟，随后进行珠与上清液的磁力分离。取仅包含0016+0056_或 ⑶16+CD57—或⑶16+^161—细胞的上清液，并进行离心(350 X g，8分钟)。假如已经在对细 胞进行渗透化的情形下添加了针对imPSA的抗体，在弃去上清液后将粒状沉淀溶解在确定 体积的包含Triton和ImM PMSF (苯基甲基磺酰氟)的细胞裂解溶液中，并于2_8°C放 置至少5分钟。否则，在弃去上清液后将粒状沉淀悬浮在0. 5ml固定试剂(例如1 %的福尔 马林溶液)中，在10分钟后用PBS溶液(pH7. 4)进行洗涤，然后接纳在100 μ 1渗透化介质 中，并且与针对PSA的、缀合有HRP (辣根过氧化物酶)或生物素的小鼠抗体(例如lyg/ml 的克隆ER-PR8) —起温育大约20分钟。然后，所述细胞用PBS溶液(pH 7.4)进行洗涤，并 且溶解在确定体积的包含Triton和ImMPMSF (苯基甲基磺酰氟)的细胞裂解溶液中， 并于2-8°C放置至少5分钟。现在将所有的细胞裂解物在超声波浴中处理5分钟，并再一次进行离心 (14000 Xg, 10分钟)。将确定体积的上清液(最多100 μ 1)移液到96-孔Maxi-Sorp平板 的每个孔中，所述96-孔Maxi-Sorp平板用多克隆的针对小鼠免疫球蛋白的抗体(在使用 缀合有HRP的、针对PSA的抗体的情况下)，例如以2 μ g/ml的浓度，或者用抗生物素蛋白或 链霉抗生物素蛋白(在使用缀合有生物素的、针对PSA的抗体的情况下)进行包被，并进行 封闭(例如，用5% FCS(胎牛血清)溶液)。作为标准，制备与HRP(辣根过氧化物酶)或 生物素相缀合的小鼠抗体克隆ER-PR8的稀释系列，在此将确定体积的各浓度稀释液移液 到各自至少两个空闲的孔中。由此，可以反向计算出所结合的imPSA的量。此外，作为细胞 数目-标准，在细胞裂解溶液中制备经校准的LDH-阳性对照的稀释系列，例如从1/2500的 稀释度开始，在此将50μ1的各浓度稀释液移液到各自至少两个空闲的孔中。密封所述平 板(例如，用保鲜膜或铝箔)，并且在室温下温育1小时。随后，向平板的每个经温育的孔中添加50 μ 1 LDH底物溶液，所述平板用铝箔密封 成不透光的，并在室温下放置30分钟。然后，给所有经温育的孔各掺以50 μ 1终止溶液(1Μ CH3COOH)，用针刺破所有大的气泡，并且在ELISA平板阅读器中在492nm处测量所有孔的光 吸收。所测量的吸收的强度与细胞数目成比例，所述细胞数目基于细胞数目-标准来确定。现在，将所有的孔用包含0. 05%或0. 1% Tween-20的PBS溶液洗涤5次，并且在 使用与HRP相缀合的、针对PSA的抗体的情况下，向其掺以100 μ 1的包含TMB (四甲基联苯 胺)的底物溶液。在使用与生物素相缀合的、针对PSA的抗体的情况下，首先与缀合有HRP 的、多克隆的、针对小鼠免疫球蛋白的抗体(例如以0.5 μ g/ml的浓度)一起温育1小时，然 后将所有的孔用包含0. 05%或0. 1% Tween-20的PBS溶液洗涤5次。使用包含TMB的底 物溶液的温育时间在室温下为15分钟，然后将50 μ 1终止溶液(例如IM H2SO4)移液到各 个孔中。最后，在ELISA平板阅读器中在450nm波长处测量所述孔的光吸收，减去在570nm 处的吸收。所测量的吸收的强度与imPSA的量成比例，所述imPSA的量基于标准来确定。结果表示为，例如pgimPSA/细胞数目(CD16+CD56-或CD16+CD57-或CD16+CD16r细 胞，或者单核白细胞)。在此处需要提及，所有上述示例性地说明了 imPSA的定量的实施例，还可明确地 用于表征所有其他上述的(特别是在权利要求9中所述及的)分子标志物，并且对于这些标志物的定量与imPSA的定量类似地进行。此外，需要指出，为了测定各分子标志物或者其 各表位，使用分别与这些标志物和/或表位相关的抗体。 在此处需要指出，从本身单独来看或以各组合形式，所有上面所描述的部分，特别 是在附图
中所描绘的细节，被声明对于本发明来说是实质性的。由此进行的变动是本领域 技术人员所熟悉的。
权利要求
1.表征，特别是定量，由从组织再循环到血液循环系统中的血液巨噬细胞从组织中摄 取到细胞内的分子标志物的方法，其特征在于下列步骤-向全血施加试剂，所述试剂抑制全血的凝集和/或凝结；-从全血中选择和/或富集和/或分离出血液巨噬细胞或包含血液巨噬细胞的白细胞 群体；-进行所选择出的血液巨噬细胞或包含血液巨噬细胞的白细胞群体的穿孔和/或裂 解，任选地，在事先对所选择出的血液巨噬细胞或包含血液巨噬细胞的白细胞群体进行可 选的渗透化之后；-在事先对血液巨噬细胞或包含血液巨噬细胞的白细胞群体进行穿孔和/或裂解之 后，定性和定量地测定被吞噬的、非-血液巨噬细胞自身的标志物，即源自组织的分子标志 物。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于，借助于使用针对表面标志物CD16的抗体的正 选择来进行血液巨噬细胞的选择和/或富集和/或分离。
3.根据权利要求2的方法，其特征在于，优选地，在使用针对表面标志物CD16的抗体进 行正选择之后或任选地在这之前，使用针对表面标志物CD14的抗体进行正选择。
4.根据前述权利要求之一的方法，其特征在于，使用针对表面标志物CD56和/或CD57 和/或CD161的抗体进行负选择，以便排除具有表面标志物CD56和/或CD57和/或CD161 的细胞。
5.根据前述权利要求之一的方法，其特征在于，使用可偶联的，优选可逆地可偶联的磁 珠来进行正或负选择。
6.根据前述权利要求1-4之一的方法，其特征在于，使用偶联在ELISA平板上的抗体来 进行正或负选择。
7.根据前述权利要求之一的方法，其特征在于，在ELISA平板中定量地测定单核白细 胞群体，优选地通过借助于ELISA平板阅读器测量乳酸脱氢酶活性来进行测定，特别优选 地在其中进行分子标志物，特别是非-血液巨噬细胞自身的抗原的定性和定量测定的同一 ELISA平板之中进行。
8.根据前述权利要求之一的方法，其特征在于，借助于ELISA平板阅读器和/或化学发 光测量仪器来定量地测定被吞噬的、非-血液巨噬细胞自身的、源自组织的分子标志物的存在量。
9.根据前述权利要求之一的方法，其特征在于，作为分子标志物，特别是组织标志物和 /或血清学标志物，使用下列标志物及其组合-异常的DNA甲基化；-八？？…-！-胎蛋白)；-AHCY (S-腺苷高半胱氨酸水解酶)；-AMY2 (胰淀粉酶)；-CA 15-3(同义词MUC1、EMA、CD227)；-CA 19-9 ；-CA 50 ；-CA 72-4(同义词TAG72)；-CA 125(同义词MUC16)； -降钙素； -钙防卫蛋白；-CCSA-2 (结肠癌特异性抗原-2)； -CCSP-2(结肠癌分泌蛋白-2)； -CEA (癌胚抗原)； -CYP24A1 ；-细胞角蛋白(CK)S及其片段； -CK18及其片段； -CK19及其片段； -CRP(C反应蛋白)； -半胱氨酸蛋白酶抑制剂B; -DDH (二氢二醇脱氢酶)； -DKK-I(Dikkopf-I)；-GP73(高尔基体蛋白-73)(同义词G0LPH2)；-HE4(人附睾蛋白4);-HER2/neu ；-HSP (热激蛋白)-27 ；-Mac-2 BP (Mac-2 结合蛋白)；-乳腺珠蛋白A ；-乳腺珠蛋白B;-MIA (黑素瘤抑制活性)；-MnSOD (锰超氧化物歧化酶)；-PARK7(同义词DJ-1)；-ftx)GRP (前胃泌素释放肽)；-NSE (神经元特异性烯醇化酶)；-泛细胞角蛋白；-Pro-MMP (基质金属蛋白酶原)-7 ；-PSA (前列腺特异性抗原)；-S100A8 ；-S100A9 ；-S-100 β ；-SCCAl (鳞状细胞癌抗原1)； -SCCA2 (鳞状细胞癌抗原2)； -甲状腺球蛋白；-UHRFl (具有/包含PHD和环-指结构域的遍在蛋白样蛋白1)； -URG4(上调的基因4)；和 -YKL-40 (同义词CHI3-L1)。
10.根据前述权利要求之一的方法，其特征在于，使用肝素或其他合适的抗凝剂作为抵抗凝集和/或凝结的试剂。
11.根据前述权利要求之一的方法，其特征在于，借助于皂苷处理或用Triton溶液进 行的处理来对巨噬细胞或包含巨噬细胞的白细胞群体进行穿孔或裂解。
12.根据前述权利要求之一的方法，其特征在于，为了测定非-血液巨噬细胞自身的抗 原，使用任选地与生物素、HRP (辣根过氧化物酶)、AP (碱性磷酸酶)或发光染料相缀合的 抗体，特别是免疫球蛋白类别G(IgG)的抗体，和Fab或F(ab)2片段，和/或适配体，其特别 地选自-抗-小鼠IgG(多克隆的)； -抗-兔IgG(多克隆的)； -抗-山羊IgG(多克隆的)； -抗-大鼠IgG(多克隆的)； -抗-驴IgG(多克隆的)； -抗-AFP (克隆 AFP-01)； -抗-AFP (克隆 AFP-11)； -抗-AFP (克隆 4A3)； -抗-AFP (克隆 5H7)； -抗-AFP (克隆 M803209)； -抗-AFP(克隆 MOl5I6Il)； -抗-AFP (克隆 MOl5I6O8)； -抗-AFP (多克隆的)； -抗-AHCY (克隆 1E11-1A7)； -抗-AHCY (克隆 2F11-1D10)； -抗-AHCY (克隆 4H2)； -抗-AHCY (克隆 Ml)； -抗-AHCY (克隆 M2)； -抗-AHCY(多克隆的)； -抗 _AMY2(克隆 6A9/1)； -抗 _AMY2(克隆 501)； -抗 _AMY2(克隆 503)； -抗 _AMY2(克隆 10-102.5)； -抗_AMY2(多克隆的)；抗-CA15--3/,MUCl (克隆 M2C5)；抗-CA15--3/,MUCl (克隆 M9E7)；抗-CA15--3/,MUCl (克隆 M4H2)；抗-CA15--3//MUCl (克隆 M8C9)；抗-CA15--3/,MUCl (克隆 M10G4)；抗-CA15--3/,MUCl (克隆 M10H6)；抗-CA15--3/,MUCl (克隆 M3A106)；抗-CA15--3//MUCl (克隆 C595 (NCRC48))-抗-CA 15-3/MUC1 (克隆 E^)； -抗-CA 15-3/MUC1 (多克隆的)； -抗-CA 19-9(克隆 121SLE)； -抗-CA 19-9(多克隆的)； -抗-CA 50(克隆 M991149)； -抗-CA 50 (克隆 93)； -抗-CA 50(多克隆的)； -抗-CA 72-4/TAG72 (克隆 SPM148)； -抗-CA 72-4/TAG72 (多克隆的)； -抗-CA 125/MUC16 (克隆 2F1)； -抗-CA 125/MUC16(克隆 10G12)； -抗-CA 125/MUC16 (克隆 X75)； -抗-CA 125/MUC16 (克隆 X325)； -抗-CA 125/MUC16 (多克隆的)； -抗-降钙素(克隆SP17)； -抗-降钙素(克隆13B9)； -抗-降钙素(克隆13f2)； -抗-降钙素(克隆24B2)； -抗-降钙素(多克隆的)； -抗-钙防卫蛋白(克隆27E10)； -抗-钙防卫蛋白(多克隆的)； -抗-CCSA-2(多克隆的)； -抗-CCSP-2(多克隆的)； -抗-CEA (克隆 Col-I)； -抗-CEA (克隆 1C7)； -抗-CEA (克隆 1C10)； -抗-CEA (克隆 ICl 1)； -抗-CEA(多克隆的)； -抗-CYPMAl (克隆 1E1)； -抗-CYPMAl (克隆 IF8)； -抗-CYP24A1 (多克隆的)； -抗_CK8(克隆M); -抗 _CK8(克隆 LPD ； -抗_CK8(多克隆的)； -抗 _CK18(克隆 DC-10)； -抗 _CK18(克隆 DA-7)； -抗 _CK18(克隆 LDK18)； -抗_CK18(多克隆的)； -抗-CK19 (克隆 A53-B/A2)；抗-CK19(克隆 BA17)；抗-CK19(克隆 236-11221)；抗-CK19(多克隆的)；抗-CRP (克隆 232OO7)；抗-CRP (克隆 232024)；抗-CRP (克隆 C2)；抗-CRP (克隆 C4)；抗-CRP (克隆 C5)；抗-CRP (克隆 C6)；抗-CRP (克隆 C7)；抗-CRP(多克隆的)；抗-半胱氨酸蛋白酶抑制剂B (克隆2F1)；抗-半胱氨酸蛋白酶抑制剂B (克隆8k275)；抗-半胱氨酸蛋白酶抑制剂B (克隆B-02)；抗-半胱氨酸蛋白酶抑制剂B (克隆RJMW-2E7)抗-半胱氨酸蛋白酶抑制剂B(多克隆的)；抗-DDH(克隆 T101)；抗-DDH(多克隆的)；抗-DKK-I (克隆 141135)；抗-DKK-I (多克隆的)；抗-GP73/G0LPH2 (克隆 YA-14)；抗-GP73/G0LPH2(克隆 5B10)；抗-GP73/G0LPH2(多克隆的)；抗-HE4(克隆 C-12)；抗_HE4(多克隆的)；抗-HER2/neu (克隆 IOC7)；抗-HER2/neu (克隆 191924)；抗-HER2/neu (克隆 N3/D10)；抗-HER2/neu (多克隆的)；抗-HSP-27(克隆 G3. 1)；抗-HSP-27(克隆 AF5E5)；抗-HSP-27(克隆 F-4)；抗-HSP-27(克隆 2A5)；抗-HSP-27(多克隆的)；抗-Mac-2 BP (克隆 SP-2)；抗-Mac-2 BP(多克隆的)；抗-乳腺珠蛋白A (克隆1G8D6，同义词2E7G9)抗-乳腺珠蛋白A(克隆304-1A5)；抗-乳腺珠蛋白A(多克隆的)；-抗-乳腺珠蛋白B(克隆E-17)； -抗-乳腺珠蛋白B(多克隆的)； -抗-MIA (克隆 3A6)； -抗-MIA(多克隆的)； -抗-MMP_7(克隆 6A4)； -抗-MMP-7 (克隆 I76-5Fl2)； -抗-MMP_7(克隆 141-7B2)； -抗-MMP_7(克隆 377313)； -抗-MMP_7(多克隆的)； -抗-MnSOD (克隆 1AE)； -抗-MnSOD (克隆 2A1)； -抗-MnSOD (克隆 4F10)； -抗-MnSOD (克隆 23G5)； -抗-MnSOD (克隆 37CT127. 5. 11. 6)； -抗-MnSOD (多克隆的)； -抗-PARK7/DJ-1 (克隆 IBl 1)； -抗-PARKVDJ-l (克隆 ID7)； -抗-PARK7/DJ-1 (克隆 6A65)； -抗-PARKVDJ-l (克隆 3O55)； -抗-PARK7/DJ-1 (克隆 A-9)； -抗-PARK7/DJ-1 (克隆 D-4)； -抗-PARK7/DJ-1 (克隆 E2)； -抗-PARK7/DJ-1 (多克隆的)； -抗-proGRP (克隆 pGRP5)； -抗-proGRP (克隆 E146)； -抗-proGRP (克隆 E172)； -抗-GRP (克隆 76-E6)； -抗-proGRP (多克隆的)； -抗-GRP (多克隆的)； -抗-NSE (克隆 1C1)； -抗-NSE (克隆 5A4)； -抗-NSE (克隆 5E2)； -抗-NSE (克隆 5G10)； -抗-NSE (多克隆的)； -抗-泛细胞角蛋白(克隆7H8C4)； -抗-泛细胞角蛋白(克隆B311. 1)； -抗-泛细胞角蛋白(克隆Cll)； -抗-泛细胞角蛋白(克隆D-12)； -抗-泛细胞角蛋白(多克隆的)；-抗-PSA (克隆 ER-PR8)； -抗-PSA (克隆 181823)； -抗-PSA(多克隆的)； -抗 _S100A8(克隆 1B3)； -抗 _S100A8(克隆 2C5/4)； -抗 _S100A8(克隆 2H2)； -抗 _S100A8(克隆 2Q396A)； -抗-SlOOA8 (克隆 6A614)； -抗 _S100A8(克隆 8L627)； -抗 _S100A8(克隆 8-5C2)； -抗 _S100A8(克隆 CF-145)； -抗-S100A8(克隆 MRP8 7C12/4)； -抗 _S100A8(克隆 S13. 67)； -抗_S100A8(多克隆的)； -抗-SlOOA9 (克隆 1C10)； -抗 _S100A9(克隆 2Q396B)； -抗 _S100A9(克隆 4G9)； -抗_S100A9(克隆编号19)； -抗_S100A9(克隆编号134)； -抗 _S100A9(克隆 S32. 2)； -抗-S100A9 (克隆 S36. 48)； -抗_S100A9(多克隆的)； -抗-3-100 0(克隆586); -抗-3-100 3(克隆5!1-81); -抗-3-100 3(克隆5!1-84); -抗-S-100 β (多克隆的)； -抗-SCCAl (克隆 8Η11)； -抗-SCCAl (多克隆的)； -抗 _SCCA2(克隆 10C12)； -抗_SCCA2(多克隆的)； -抗 _SCCAl/2(克隆 B-9)； -抗_SCCAl/2(多克隆的)； -抗-甲状腺球蛋白(克隆5E6)； -抗-甲状腺球蛋白(克隆5F9)； -抗-甲状腺球蛋白(克隆5G4)； -抗-甲状腺球蛋白(克隆11A16)； -抗-甲状腺球蛋白(克隆PB2)； -抗-甲状腺球蛋白(克隆PB3)； -抗-甲状腺球蛋白(多克隆的)；-抗-UHRFl (克隆 1RC1C-10)； -抗-UHRFl (克隆 3A11)； -抗-UHRFl (多克隆的)； -抗_URG4(多克隆的)； -抗-YKL-40/CHI3-L1 (克隆 2011)； -抗-IL-40/CHI3-L1 (克隆 321806)； -抗-YKL-40/CHI3-L1 (多克隆的)。
13.用于分离和表征血液的单核白细胞，特别是血液巨噬细胞的设备，其包含 -用于添加试剂的装置，所述试剂抑制全血的凝集和/或凝结；-用于借助于密度梯度离心，从全血中预选择和富集单核白细胞，特别是血液巨噬细胞 的装置；-用于通过针对⑶14的抗体来选择和富集⑶14+细胞的装置，所述针对⑶14的抗体偶 联在磁珠或ELISA平板上，任选可逆地偶联在磁性珠或ELISA平板上；-用于通过针对⑶16的抗体来选择和富集⑶16+细胞的装置，所述针对⑶16的抗体偶 联在磁珠或ELISA平板上，任选可逆地偶联在磁性珠或ELISA平板上；-用于借助于皂苷溶液或Triton溶液来对单核白细胞群体，特别是血液巨噬细胞进行 穿孔或裂解的装置；-用于通过使用用于测定LDH(乳酸脱氢酶)活性的测试来定量地测定单核白细胞群 体，特别是血液巨噬细胞的装置，所述定量测定在ELISA平板中进行，更确切地在其中进行 分子标志物的定性和定量测定的同一 ELISA平板之中进行；-用于在先前对血液的单核白细胞，特别是巨噬细胞进行穿孔或裂解之后，借助于 ELISA平板阅读器和/或化学发光测量仪器来定性和定量地测定被血液巨噬细胞吞噬的细 胞内分子标志物的装置。
14.根据权利要求13的设备，其特征在于，用于通过使用偶联在磁珠上的、针对CD56或 CD57或CD161的抗体，从单核白细胞特别是CD16+白细胞的集合中排除具有细胞表面标志 物⑶56或⑶57或⑶161的NK细胞(天然杀伤细胞)的装置。
15.根据权利要求13或14之一的设备，其特征在于，用于在裂解单核白细胞之前对其 进行固定和渗透化的装置，以便针对细胞内的、被吞噬的分子标志物的抗体在细胞裂解之 前进行细胞内结合，优选地，所述固定和渗透化在选择和/或富集和/或分离出血液巨噬细 胞或包含血液巨噬细胞的白细胞群体之前或任选地在这之后进行。
全文摘要
本发明涉及表征，特别是定量，由从组织再循环到血液循环系统中的血液巨噬细胞从组织中摄取到细胞内的分子标志物的方法，其中进行下列步骤向全血施加试剂，所述试剂抑制全血的凝集和/或凝结；从全血中选择和/或富集和/或分离出血液巨噬细胞或包含血液巨噬细胞的白细胞群体；进行所选择出的血液巨噬细胞或包含血液巨噬细胞的白细胞群体的穿孔和/或裂解，任选地，在事先进行渗透化之后；在事先对血液巨噬细胞或包含血液巨噬细胞的白细胞群体进行穿孔和/或裂解之后，定性和定量地测定非-血液巨噬细胞自身的标志物，即源自组织的分子标志物。本发明还涉及用于实施所述方法的设备。
文档编号G01N33/50GK102138071SQ200980133748
公开日2011年7月27日 申请日期2009年8月4日 优先权日2008年8月4日
发明者W·布罗泽克 申请人:辛米德研究有限公司
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