专利名称：：一种磁小体抗体复合物及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种检测食源性致病菌的抗体复合物及用该抗体组合物检测食源性致病菌的方法，特别是涉及一种磁小体抗体复合物及用其检测食源性致病菌的方法。
背景技术：
：食源性致病菌是引起伤寒、副伤寒、败血症、胃肠炎和食物中毒的首要原因，对人类健康造成极大�：Γ鞘称钒踩闹卮笠�。据WHO估计，全世界每年发生食源性疾病数十亿人。常见的食源性致病菌包括沙门氏菌、大肠杆菌、副溶血弧菌、李斯特菌等。食源性致病菌的检测方法一直以来都是研究关注的焦点。传统的检测方法包括预增菌、选择性增菌和分离鉴定三个步骤，一般需要4-7天，耗时、耗力。随后兴起的其它快速检测技术如免疫荧光试验、基因探针等，仍需预增菌，且其成本高，特异性差，如何建立一种经济，快速，高灵敏度，高特异性的检测方法依然是食品致病菌检测中的瓶颈问题。磁小体(magnetosome，bacterialmagneticnanoparticle，BMPs)是趋磁细菌在体内合成的双层质膜包被的磁性纳米颗粒，主要由Fe304或Fe3S4组成。它们大小均一、晶型稳定，具有单磁畴、顺磁性，可结合各种功能分子，如酶、抗体、细胞、DNA或RNA等，因而在靶向药物、控制释放、酶的固定化、免疫测定、DNA和细胞的分离与分类等领域可望有广泛的应用。CN101434921A中就给出了一种通过培养磁细菌来制备磁小体的方法。而CN1927400A中则公开了一种磁性靶向抗癌药物，其是由磁小体与抗癌化学药物偶联而成的。
发明内容本发明的目的是提供一种磁小体抗体复合物及用其检测食源性致病菌的方法。为达到上述目的，本发明的技术方案提供了一种磁小体抗体复合物，其是由磁小体和能特异性捕获食源性致病菌的特异性抗体偶联而成的。特异性抗体是能够捕获食源性致病菌的抗体，其可以根据食源性致病菌具体种类的不同而不同。所述特异性抗体选自沙门氏菌、大肠杆菌、副溶血弧菌、李斯特菌或绿脓杆菌的单抗或多抗中的一种。其中单抗以抗表面抗原的抗体为佳。从理论上说，所有能产生抗体的物质(如细菌、病毒、蛋白、核酸、多糖等)均可制成此磁小体复合物，用于特异性富集目标待测物后进行检测，适用于快速、痕量检测。本发明的磁小体抗体复合物，其中优选特异性抗体是多抗。上述的偶联剂是可以将磁小体和食源性致病菌抗体偶联的化学试剂，本领域中公知的许多偶联剂都可以使用(只要能够偶联氨基，羟基或者是羧基的偶联剂都可以使用)。例如SPDP、BS3、或生物素-亲和素系统等，其中亲和素优选链霉亲和素。上述的磁小体抗体复合物，优选的偶联剂是3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酉旨(N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithiol)propionate,SPDP)。用偶联剂将磁小体和抗体偶联之后，由于抗体的作用，其能够捕获需要检测的食源性致病菌，从而使检测成为可能。当采用SPDP为偶联剂时，上述磁小体抗体复合物的制备方法包括1)取磁小体，用连接缓冲液悬浮，超声波打散后，加入偶联剂发生反应；其中的连接缓冲液是L-PBS，所用的L-PBS配方为20mMNa3P0412H20，150mMNaCl，ImMEDTA，0.02%NaN3，pH7.5。2)取特异性抗体，用缓冲液溶解，加入偶联剂发生反应；3)将步骤1)中得到的磁小体偶联剂复合物用缓冲液洗涤，然后加入还原剂反应；其中的还原剂为DTT等弱还原剂，可以打开二硫键的还原剂都可以，以反应条件温和的为佳。4)步骤3)反应所得磁小体偶联剂复合物用缓冲液洗涤，然后与步骤2)中所得的抗体偶联剂复合物混合进行反应；5)用磁铁吸附出磁小体抗体复合物。其中，各步骤中使用的缓冲液可以是常规的PBS;步骤1)、步骤2)、步骤3)和步骤4)中的反应条件均为25-37°C，150-200rpm，摇床反应O.5-1小时。当采用不同偶联剂和抗体时，偶联步骤有细微的改变，有时没有还原步骤。但检测原理是相同的。此外，本发明还提供一种用上述的磁小体抗体复合物检测痕量食源性致病菌的方法，其是将所述的磁小体抗体复合物经包被后，加入待测样品捕获食源性致病菌，经磁铁收集之后，经实时荧光定量PCR检测食源性致病菌的捕获数量，再通过标准曲线计算得出待测品中的食源性致病菌的数量。优选磁小体抗体复合物(BMP-Ab)捕获食源性致病菌的温度为4-37t:，本反应在4t:仍可以进行。其中用于包被磁小体抗体复合物的可以用牛奶或者PEG，优选采用BSA(牛血清白蛋白)，包被效果较好。在加入到待测样品中捕获食源性致病菌时，为了让磁小体更好的分散，可以采用超声波打散步骤，也可以用枪头反复吹打来提高分散效率。优选磁小体抗体复合物的加入量为20-120iig/mL待测样品。优选磁小体抗体复合物(BMP-Ab)捕获食源性致病菌的温度条件为37°C。优选磁小体抗体复合物的加入量为80iig/mL待测样品。其中所述的磁小体抗体复合物可以从大量的样品中捕获目标检测物，而后富集到较小的体积内，以便于检测。本发明中的技术方案成本低，操作简便，灵敏度高，同时縮短了检测时间，能够实现对食源性致病菌的快速高效检测。为食品安全检测和进出口检验检疫部门提供了一种快速、简便、实时监测食源性致病菌的方法。我们还发现采用本发明中的磁小体，抗体复合物在检测食源性致病菌时，能具有较高的特异性/抗干扰性。即使在干扰菌浓度很高的情况下，仍然能检测出痕量的食源性致病菌。图1是实施例1中偶联过程的示意图2是实施例2中磁小体抗体复合物捕获沙门氏菌示意图；图3是实施例3中偶联过程的示意图；图4是实施例4中偶联过程的示意图；图5是实时荧光定量PCR检测磁小体抗体复合物对含6000cfu/mL沙门氏菌的六种样品的捕获情况；图6是实时荧光定』样品的捕获情况；图7是实时荧光定〗样品的捕获情况；图8是实时荧光定』结合的干扰菌株；图9是实时荧光定』PCR检测磁小体抗体复合物对含600cfu/mL沙门氏菌的六种:PCR检测磁小体抗体复合物对含60cfu/mL沙门氏菌的六种PCR检测干扰菌系列稀释液和磁小体_抗体复合物非特异性:PCR检测磁小体抗体复合物分别从纯沙门氏菌悬液，沙门氏菌干扰菌株混合液中捕获得到的沙门氏菌c具体实施例方式下面结合附图，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1用于检测沙门氏菌的磁小体抗体复合物的制备1.取lmg磁小体，用lmL连接缓冲液(L-PBS)悬�。ǔ浞执蛏ⅲ�10yL25mMSPDP，在室温下，于摇床(200rpm)上反应1小时；2.取0.5mg沙门氏菌多抗，用lmLL-PBS缓冲液溶解，与5yL25mMSPDP反应，反应条件同上；3.将步骤1中与SPDP反应后的BMPs-SPDP用10mMPBS洗涤三次，然后加入lmL250mMDTT还原，在与步骤1相同的条件下反应30分钟；4.将步骤3反应所得复合物用10mMPBS缓冲液洗涤三次，然后与步骤2中所得的抗体-SPDP复合物混合，在与步骤1相同的条件下反应1小时，而后用磁铁吸附磁小体抗体复合物。留取上清，测偶联效率用BCA试剂盒检测反应前后抗体浓度差，计算磁小体抗体的偶联效率。偶联效率(iig抗体/mgBMPs)=(Cl-C2)XV/MCl:反应前抗体的浓度；C2:反应后抗体的浓度；V:与磁小体反应的抗体的体积；M:偶联反应中磁小体的质量；Cl，C2由标准曲线Y=kx计算所得，(该标准曲线由BCA试剂盒检测标准蛋白BSA得出，其中Y为0D562，x为样品浓度)计算磁小体的密度为5.2g/cm3lmg磁小体的体积约为:V=m/P=1X10—3g/5.2g.cm—3=1.923X10—4cm3每个磁小体颗粒的体积为(diameter:40nm=40X10—7cm)v=4nr3/3=4X3.14X(2X10—6)3/3=3.35X10—17cm3每毫克磁小体所含的颗粒数nl=V/v=1.923X10—4cm3/3.35X10—17cm3=5.74X1012每毫克抗体中所含的抗体分子为n2=m/MX6.02X1023=10—3/150，000X6.02X1023=4.0X1015得出100iigIgG/mgBMPs—4.0X1014/5.74X1012"70即当偶联效率在200-300ygIgG(抗体)/mgBMPs(磁小体)时，每个磁小体颗粒上大约连接了140-210个抗体分子。其偶联过程的示意图如图1所示。实施例2用磁小体抗体复合物(BMP-Ab)检测沙门氏菌悬液将培养过夜的沙门氏菌悬液经IO倍梯度稀释后，取适当稀释度(10—5、10—6、10—7)的沙门氏菌悬液做平板计数。同时各稀释度均取lmL，离心浓縮至lOOiiL，9『C加热10分钟后，离心收集2iiL上清做实时荧光定量PCR。经与平板计数结果对比，便可得出菌体个数与荧光强度之间的标准曲线。图2中给出了磁小体抗体复合物捕获食源性致病菌沙门氏菌的示意图。确定磁小体抗体复合物捕获沙门氏菌的最佳浓度将lmL不同稀释液梯度(10—5、10-6、10-7)的沙门氏菌悬液，分别加入20iig、80iig、120iig的BMP-Ab，用超声波(40-60W)充分打散，室温条件下，在摇床(200rpm)上反应1小时，反应后用磁铁收集磁小体_抗体_沙门氏菌复合物，经PBS缓冲液洗涤后，定容到100iiL，98t:加热10分钟后，离心收集2PL上清做实时荧光定量PCR，结合上述所得标准曲线，即可计算出磁小体抗体复合物所捕获的沙门氏菌的个数，从而得出灵敏度。其捕获效率是所捕获的沙门氏菌与样品中原有的沙门氏菌的比例。经比较，发现80iig/mL的磁小体抗体复合物具有最佳的捕获效率，如表1所示表1磁小体抗体复合物浓度对捕获效率的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>取80iig磁小体抗体复合物，分别与不同稀释度(10—5、10—6、10—7)的沙门氏菌悬液反应，反应温度分别设为室温、37t:，比较两种温度下磁小体抗体复合物对沙门氏菌的捕获效率。试验结果发现，与室温相比，37t:更有利于磁小体抗体复合物对沙门氏菌的捕获。表2温度对捕获效率的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>偶联步骤简述如下1、用ImMBS3lmL悬浮lmgBMPs;2、37。C，反应0.5h-lh，用PBS清洗三次，加入抗体；3、37。C，反应0.5h-lh，收集BMPs_BS3+IgG;4、利用BCA试剂盒检测反应前后抗体的浓度，计算偶联效率。偶联过程的示意图如图3所示。偶联过程的详细步骤为1:用PBS缓冲液配置BS使其浓度为lmM，然后取lmLBS3悬浮lmg磁小体，超声波打散后，37。C，200rpm反应lh;2:磁铁收集反应后的磁小体，去上清，用PBS悬浮，然后再用磁铁收集，去上清，重复清洗三次；3:用lmLlmg/mL绿脓杆菌多抗悬浮步骤2中清洗后的磁小体，超声波打散，37°C，200rpm反应lh;4:磁小体抗体复合物利用磁铁收集，PBS洗三次(如步骤2)，加入封闭液，4t:保存备用；5:利用BCA试剂盒检测偶联前后抗体的浓度，计算偶联效率。实施例4:利用生物素亲和素体系构建磁小体大肠杆菌0157单抗复合物与实施例l相比，其不同在于，体种类为单抗，检测的目标菌为大肠杆菌0157，偶联由两种试剂共同完成，偶联条件不同(偶联时不需要还原剂还原，反应温度为室温)，偶联原理不用(分别用生物素修饰磁小体和抗体，然后利用亲和素作为桥，结合抗体和磁小体上的生物素分子)。生物素(Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin)结构式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>利用生物素亲和素偶联磁小体和抗体步骤简述如下1、用10mMbiotin悬浮lmgBMPs，超声波打散；150-200rpm，37°C，反应30_40min，PBS缓冲液清洗3次，得到BMPs-biotin;同时150-200rpm，37°C，lmLlmg/mL大肠杆菌0157单抗中力t]入27uL10mMbiotin，反应lh。2、利用400ug/mLstr印tavidin悬浮BMPs-biotin;3、200rpm，37°C，反应0.5h，PBS缓冲液清洗3次，得到BMPs-biotin-str印tavidin复合物；4、用BCA试剂盒检测反应前后抗体的浓度，计算偶联效率。偶联过程的示意图如图4所示。偶联过程的详细步骤为1:将lmLlmg/mLBMPs中加入35iiLlOmMNHS-LC-LC-biotin，37°C，200rpm反应0.5h;同时在lmLlmg/mL抗体中加入27iiL10mMNHS-LC-LC-biotin,37°C200rpm，反应lh;2:将1中反应完毕的磁小体用磁铁吸附，去上清后加入PBS清洗，然后超声波打散，再用磁铁吸附，重复清洗2-3次；3:将2中清洗完的磁小体用lmL400yg/mL的亲和素悬�。�37°C150-200rpm避光反应30min;4:反应后，清洗磁小体，如步骤2所述；5:将步骤1中修饰后的抗体与步骤4中的磁小体混合，超声波打散后37°C150-200rpm反应30min_lh;6:用BCA试剂盒检测反应前后抗体浓度，计算偶联效率，计算方法如前所述。实施例5:用实施例1的磁小体抗体复合物检测食品中沙门氏菌选择六种食品，包括鸡蛋、牛奶、猪肉、果汁、菠菜和饼干。各食品均取25g，加入225mL，10mM的PBS缓冲液，经均质机粉碎。然后加入不同浓度的沙门氏菌进行污染，所用沙门氏菌悬液经平板计数和实时荧光定量PCR可以得出各稀释度的菌体浓度。选取污染后沙门氏菌浓度为6000cfu/mL、600cfu/mL、60cfu/mL的样品各lmL进行检测。反应条件是37。C，200rpm摇床，1小时。磁小体抗体复合物检测这三个不同浓度沙门氏菌污染的六种样品的结果分别如图5-7所示，图中grad5、6、7分别是取等体积各浓度沙门氏菌所做的对照。从结果可以看出，当样品中沙门氏菌浓度分别为6000cfu/mL、600cfu/mL、60cfu/mL时，该样品均能检测到样品中的沙门氏菌，并且检测过程中菌体发生了繁殖，更利于沙门氏菌的检测。该方法检测人工污染样品直接检测限是60cfu/mL。另外，增加被检测样品的体积及实时荧光定量PCR模板的体积，仍然能进一步提高检测灵敏度。实施例6:用实施例4的磁小体抗体复合物检测食品中大肠杆菌0157将市场上购买的牛奶用10mM的PBS缓冲液进行10倍梯度稀释，利用实施例4的磁小体抗体复合物检测牛奶中的大肠杆菌0157。然后加入不同浓度的大肠杆菌0157进行污染，所用大肠杆菌悬液经平板计数和实时荧光定量PCR可以得出各稀释度的菌体浓度。选取污染后沙门氏菌浓度为10000cfu/mL、1000cfu/mL、100cfu/mL的样品各lmL进行检领"反应条件是在200rpm摇床中37。C保温30分钟到1小时。然后利用实时荧光定量PCR的方法检测捕获到的大肠杆菌0157。也可以将捕获到的大肠杆菌进行双标签PCR检测，并结合免疫显色反应检测菌体的浓度。实施例7:实施例1的磁小体抗体复合物对沙门氏菌捕获的特异性将沙门氏菌悬液进行10倍梯度稀释，分别取100L10—5、10—6、10—7的稀释液做平板计数，同时各稀释度均取lmL，离心浓縮至100iiL，98t:加热10分钟后，离心，取2yL上清进行实时荧光定量PCR，结合平板计数结果，便可得出菌体个数与荧光强度之间的标准曲线。取10—5、10—6、10—7稀释液分别加入不同浓度的干扰菌株副溶血弧菌，充分混合后，沙门氏菌和干扰菌的浓度比为i:ioo、i:iooou:iooo，各梯度均取imL，与soyg实施例1的磁小体抗体复合物反应。同时干扰菌也按照上述方法通过菌落计数和实时荧光定量PCR得出标准曲线。实验步骤和反应条件与检测沙门氏菌相同，测定捕获效率和灵敏度。图8、图9及表3显示了检测结果，说明该方法具有特异性的吸附沙门氏菌的性质，干扰菌株和磁小体_抗体的非特异性结合很低。如图8所示，梯度(grads)1_6分别是干扰菌10—^lO—6稀释液的实时荧光定量PCR曲线，磁小体-抗体从样品中捕获到的干扰菌与梯度稀释液比较，数量极少；图9中，对照(control)是实时荧光定量PCR检测的捕获前样品中总的沙门氏菌数目所得曲线，而沙门氏菌(sal)组和沙门氏菌+干扰菌株副溶血弧菌(sal+vp)组分别是磁小体-抗体复合物从纯沙门氏菌悬液及沙门氏菌+干扰菌混合液中捕获到的沙门氏菌的实时荧光定量PCR曲线。比较可以得出干扰菌株的加入，并没有显著影响到磁小体-抗体复合物对沙门氏菌的捕获效率。表3是通过实时荧光定量PCR结果计算所得的各处理的捕获效率及捕获的沙门氏菌的数目。表3磁小体抗体复合物分别对纯沙门氏菌悬液，沙门氏菌和干扰菌混合液的捕获效率<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>由以上实施例可以看出，本发明实施例通过采用偶联剂偶联磁小体和特异性抗体制成的磁小体抗体复合物能够有效捕获食源性致病菌，并具有良好的捕获效率，从而能够对其进行快速的痕量检测；而且使用该磁小体抗体复合物在捕获食源性致病菌时，即使存在较高浓度的干扰菌株，也不会对捕获结果产生显著影响。因此其具有较高的精确度和准确性。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。权利要求一种磁小体抗体复合物，其特征在于，其是由磁小体和能特异性捕获食源性致病菌的特异性抗体偶联而成的。2.如权利要求1所述的磁小体抗体复合物，其特征在于，所述特异性抗体选自沙门氏菌、大肠杆菌、副溶血弧菌、李斯特菌或绿脓杆菌的单抗或多抗中的一种。3.如权利要求1或2所述的磁小体抗体复合物，其特征在于，所述特异性抗体是多抗。4.如权利要求1-3任一项所述的磁小体抗体复合物，其特征在于，偶联采用的偶联剂是SPDP、BS3或生物素-亲和素系统。5.如权利要求1-4任一项所述的磁小体抗体复合物，其特征在于，每个磁小体颗粒上有140-210个抗体分子。6.—种制备权利要求1所述的磁小体抗体复合物的方法，其步骤包括1)取磁小体，用连接缓冲液悬�。ù蛏⒑螅尤肱剂练⑸从Γ�2)取特异性抗体，用缓冲液溶解，加入偶联剂发生反应；3)将步骤1)中得到的磁小体偶联剂复合物用缓冲液洗涤，然后加入还原剂反应；4)步骤3)反应所得磁小体偶联剂复合物用缓冲液洗涤，然后与步骤2)中所得的抗体偶联剂复合物混合进行反应；5)用磁铁吸附出磁小体抗体复合物。7.如权利要求6所述的磁小体抗体复合物的制备方法，其特征在于步骤1)、步骤2)、步骤3)和步骤4)中的反应条件均为25-37°C，150-200rpm，摇床反应0.5-1小时。8.—种用权利要求l-5任一项所述的磁小体抗体复合物来检测样品中痕量食源性致病菌的方法，其包括将所述的磁小体抗体复合物经包被后，加入到待测样品捕获食源性致病菌，经磁铁收集后，经实时荧光定量PCR检测食源性致病菌的捕获数量，再通过标准曲线计算得出待测品中的食源性致病菌的数量。9.如权利要求8所述的检测方法，其中磁小体抗体复合物捕获食源性致病菌的温度为4-37°C;磁小体抗体复合物的加入量为20-120iig/mL待测样品。10.如权利要求8或9中所述的检测方法，其中磁小体抗体复合物捕获食源性致病菌的温度为37°C;磁小体抗体复合物的加入量为80iig/mL待测样品。全文摘要本发明提供了一种磁小体抗体复合物，及使用该复合物快速检测痕量食源性致病菌的方法。本发明利用偶联剂将能捕获食源性致病菌的抗体偶联在磁小体膜上形成磁小体-抗体复合物(BMP-Ab)，然后用该复合物来捕获样品中的沙门氏菌等食源性致病菌，结合实时荧光定量PCR检测食源性致病菌。本发明中的技术方案成本低，操作简便，灵敏度高，同时缩短了检测时间，能够实现对食源性致病菌的快速高效检测。此外本发明的方法还具有较高的特异性/抗干扰性，即使在干扰菌浓度很高的情况下，仍然能快速检测出痕量的食源性致病菌。文档编号G01N33/569GK101788558SQ201010112129公开日2010年7月28日申请日期2010年2月11日优先权日2010年2月11日发明者姜伟,张惠媛,张昕,李爱华,李颖,王珍芳,田杰生申请人:中国农业大学;中华人民共和国北京出入境检验检疫局
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