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用于早期糖尿病诊断的多肽标志物的制作方法【专利摘要】本发明提供了用于早期糖尿病诊断的多肽标志物，首先选择人外周血高丰度蛋白HSA建立体外模拟糖基化模型，优化条件下酶切，将酶切后的空白对照组样品进行18O标记，与采用16O平行处理的反应组样品1:1(v/v)混合，进行HPLC/ESI-TOF?MS检测。通过对HSA肽段的定量分析，找到最不易被葡萄糖修饰的肽段如SEQ?ID?NO.1所示，作为内标肽段，将易发生糖基化修饰的肽段与内标肽段峰面积之比用以衡量葡萄糖敏感肽的糖基化修饰程度，通过蛋白质组学方法最终发现3条肽段FKDLGEENFK、LDELRDEGK和KVPQVSTPTLVEVSR可作为生物标志物用于糖尿病的早期诊断。【专利说明】用于早期糖尿病诊断的多肽标志物【
技术领域：
】[0001]本发明涉及生物【
技术领域：
】，具体地，涉及用于检测早期糖尿病的多肽标志物及其应用。【
背景技术：
】[0002]糖尿病是一组以慢性血葡萄糖(简称血糖)水平增高为特征的代谢性疾病，是由于胰岛素分泌和(或)作用缺陷所引起。目前，医学上将空腹血糖和糖化血红蛋白水平作为临床诊断糖尿病的直接标准。但对于糖尿病前期的人群来讲，血糖水平并不会明显率先表现出居高不下的状态，而是由于肌体对血糖水平调节能力的下降，表现为血糖水平的忽高忽低。糖化血红蛋白的测定则通常反映人相对长期(8-12周)的血糖状况。通常情况下一旦空腹血糖和糖化血红蛋白的水平达到了病理值，则“患有糖尿病”的结论不太可能出现逆转。虽然胰岛素及其它药物在很大程度上使糖尿病及其并发症得到了有效的控制，但目前糖尿病尚不能完全治愈，因此早期诊断对于糖尿病的治疗起着至关重要的作用。[0003]目前，医学上将空腹血糖和糖化血红蛋白的水平定义为临床诊断糖尿病的直接标准。空腹血糖大于等于7.0mmol/L或者糖化血红蛋白水平大于等于6.5%即可诊断为糖尿病。尽管这一标准是现行权威的诊断标准，但由于性别、年龄，家族病史等不同个体差异的影响，单次空腹糖或糖化血红蛋白水平偏高并不能百分之百的准确预测所有的糖尿病病例，尤其在该疾病的早期阶段。在这种情况下，其它生物标志物的发现和研究应用于糖尿病的早期诊断越来越受到人们的重视。生物标志物可用于监测一个生理或者病理的过程，也可以用于跟踪一个药理反应，一个理想的生物标志物能够鉴定疾病发展的程度、也可有效提高疾病预警的准确性，还可指导疾病的治疗，甚至可以帮助研究人员洞悉疾病的发病机制。[0004]人的血浆蛋白来源于各种组织或细胞的分泌或者泄漏，已有研究表明血浆蛋白的动态变化反映了人的生理或病理状态的变化，因此血浆蛋白质组的变化能很好地指示机体生理或病理状况。血浆蛋白执行着人体的许多生物功能，在人类健康与疾病中有着重要的意义，人类的很多疾病都会引起血浆中蛋白质性质和含量的改变。由于血浆取材容易，且血浆中蛋白具有许多重要的生理功能，血清中某种蛋白浓度的变化往往预示某些疾病的发生。因此，监测血清蛋白浓度对于疾病的早期诊断、病因的阐明及药物疗效的监测方面都具有重要的意义。早期发现的某种蛋白在表达数量、水平及修饰状态上出现的差异，很有可能作为疾病诊断的重要生物标志物。[0005]在蛋白质组学中，最常用的鉴定蛋白的方法之一是基于二维凝胶电泳(two-dimensionalgelelectrophoresis,2DE)技术和质谱联用，通常在一块胶上可以使几千个蛋白得到分离，由于其第一维是等电聚焦，采用PH梯度根据蛋白质等电点的不同使之分离，第二维是聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据蛋白质分子量的大小进行分离，故可直接反映不同蛋白质的等电点和分子量的信息，而且也能反映蛋白质异构体和翻译后修饰等变化。由于2DE是在蛋白水平上进行定量，该技术存在自身难以克服的缺陷，故人们转向在肽段水平上进行定性和定量，进而实现蛋白的定量。基于质谱技术的定量方法大体上可以分为两种，一种是无标记定量技术，另外一种是同位素标记定量技术。基于同位素标记定量技术主要包括体内代谢标记和化学标记两种。体内代谢标记指生物体的外界培养环境中某一种元素或者氨基酸被某一同位素所取代，这样在生物体生长的过程中，同位素逐渐取代自身的天然元素或氨基酸，在蛋白水平或肽段水平上形成质量差。代谢标记主要包括细菌或细胞的15N标记法和细胞培养中氨基酸稳定同位素标记法(StableIsotopeLabelingbyAminoacidsinCellculture,SILAC)。[0006]目前绝大多数生物标志物均处于蛋白水平，常见的检测手段为酶联免疫吸附法(ELISA)0酶具有较高的催化效率，因此ELISA法具有较高的灵敏度，但该方法需要预先知道生物标志物及其相应的特异性抗体，在实际应用中存在一定的挑战。鉴于此，近年来以质谱为基础的定量蛋白质组学的方法越来越多被应用与生物标志物的寻找。然而，与蛋白类生物标志物相比，肽类生物标志物可能更便于采用质谱进行检测，其原因在于，蛋白在体内可能经历多种翻译后修饰，如:磷酸化、糖基化、乙酰化等等。每一种翻译后修饰都可能改变蛋白的分子质量，从而导致质谱这一基于对分子量进行测定的仪器在检测上的困难。相反，若采用多肽作为生物标志物则不存在这个问题。[0007]近年来，糖尿病及其并发症的生物标志物逐渐成为研究的热点之一，目前已经有许多糖尿病生物标志物被广泛报道，例如C反应蛋白、丙氨酸转氨酶、甘油三酯等。这些生物标志物的发现和检测为早期糖尿病及其并发症的发现和治疗提供了有利依据。但在一般情况下，分析过程中的需要添加内标物使得待测物质得以准确定量。但是内标物的寻找也常常成为分析方法的难点之一，主要因为对内标的选择有诸多要求，如:内标物添加至样品中能完全溶解、不与待测组分发生反应，且内标物与待测组分在色谱保留时间上应尽可能接近。若能解决内标肽段溶解性差且容易与其他肽段存在相互反应的问题，对于下一步筛选葡萄糖敏感肽段的糖尿病多肽标志物，用于糖尿病的早期诊断具有重要意义。【
发明内容】[0008]本发明的第一个目的在于提供一种人外周血蛋白HAS中对葡糖糖不敏感的内标肽段。[0009]本发明的第二个目的在于提供用于糖尿病早期诊断的多肽标志物。[0010]本发明的第三个目的在于提供一种基于质谱技术的早期糖尿病诊断试剂盒。[0011]本发明提供的用于检测早期糖尿病的内标多肽，其来源于人血清白蛋白，具有SEQIDN0.1所述的氨基酸序列，m/z=977.4。[0012]本发明提供了上述内标多肽在制备早期糖尿病诊断试剂盒中的应用。[0013]本发明提供了一种筛选上述内标多肽的方法，包括以下步骤:[0014](I)体外糖基化样品的制备，将无菌HSA于50mMpH7.4的PBS缓冲液中配成生理浓度的溶液，分别与4种不同浓度的D-葡萄糖在37°C水浴共同孵育10、20和30天，使得HSA与D-葡萄糖的摩尔比分别为1:10、1:41.5、1:83和1:415;以同样条件下不添加D-葡萄糖溶液的反应体系作为空白对照；[0015]所述HSA的生理浓度为40mM/mL。[0016](2)胰酶消化，将蛋白样品溶于50mMpH8.3的NH4HCO3缓冲液中，向每200μg经糖基化的HSA与空白对照HSA样品中加入20μL含8M尿素的IOmMDTT(二硫苏糖醇)溶液进行变性，于37°C水浴孵育4h，再加入50mMIAA(碘乙酰胺)溶液甲基化封闭氨基酸侧链的活泼基团，于黑暗处反应lh，再加入溶于pH8.3的NH4HCO3缓冲液中的胰蛋白酶，使HSA:胰蛋白酶的质量比=10~125:1，于37°C水浴孵育8~20h;[0017](3)180标记，将冻干后的肽段样品溶于50~150mMpH4.0~7.0的KH2PO4溶液中后再次冻干备用；向未经修饰的HSA-肽段和糖基化HSA-肽段加入分别用H218O和H216O溶解的胰蛋白酶(HSA:胰蛋白酶=I~125:l，w/w)，在37°C水浴中标记8~24小时；[0018](4)对样品分别进行HPLC/ES1-TOFMS定量分析和HPLC/ES1-1onTrapMS定性分析；[0019](5)数据分析与内标肽段的选择，Agilent公司MassHunter软件的MFE算法用于提取HPLC/ES1-TOFMS的数据特征，提取参数:保留时间8.00-45.0Omin;质荷比m/Z300-1800;信噪比阈值S/N5;谱峰数目1000X1000;选中肽同位素分布；PeakPair软件被用于挑选相应肽段的160/180峰对，并计算出160/180峰面积的比值用于肽段的定量分析，若160/180峰面积的比值小于1，则说明未经修饰的HSA来源的肽段被消耗，该肽段拥有易被修饰的糖基化位点，经过糖基化过程，生成了带有糖链修饰的新肽段；若160/180峰面积的比值等于1，则说明该肽段经过与葡萄糖共育并未被消耗，不存在对葡萄糖敏感的糖基化位点；在TOFMS数据中，发现I个葡萄糖不敏感肽段AAFTECCQAADKAACLLPK，m/z=977.4，Rt=28.7均可在每一次质谱检测中稳定地被检测到，质谱信号达到105，肽段的160/180峰面积比例最接近1，且SD值最小0.961±0.077，选择该肽段为内标肽段。[0020]优选地，步骤(2)中，HSA:胰蛋白酶的质量比=50:1，于37°C水浴孵育20h。[0021]优选地，步骤(3)中，肽段样品溶于50mMpH6.0的KH2PO4溶液中后再次冻干备用；HSA:胰蛋白酶=50:1，在37°C水浴中标记20小时[0022]进一步地，步骤(3)还包括在标记完成后，残余的胰蛋白酶需经灭活处理，将样品在沸水中煮10分钟，再按照体积比加入5%的甲酸。[0023]更进一步地，步骤(3)中标记体系尿素浓度控制在2M以下。[0024]在本发明的一个实施例中，步骤(4)中样品定量分析采用AgilentllOO系列高效液相色谱仪串联ES1-TOF(Agilent6210)进行。[0025]优选地，在HPLC/ES1-TOFMS分析之前，样品需经过离心处理，离心条件为17，OOOXgj15min。[0026]其中，步骤(4)所述的HPLC/ES1-TOFMS定量分析的液相色谱条件为:色谱柱为GraceC18柱,300人，2.1mmX150mm;流速0.2mL/min;进样量10μg;所用流动相为:A相为含0.1%甲酸的水溶液；B相为含0.1%甲酸的乙腈溶液。梯度洗脱条件为:3%B，O—8min;3-40%B,8—35min;40-95%B,35—40min;95%B,40—43min以及95_3%Bfrom43—45min;Postrun为IOmin；ES1-TOFMS条件为:以氮气作为干燥气和雾化气，干燥气流速10L/min;干燥气温度为350°C;雾化器压力为35psi;采用正离子模式；毛细管电压为-3.5kV;毛细管出口电压160V;锥孔电压60V；MS扫描范围为m/z300-1800；[0027]另外，步骤(4)中，对于样品的定性分析，采用HPLC/ES1-1onTrapMS方法分析，样品定性分析的液相色谱条件和质谱ESI离子源条件与上述HPLC/ES1-TOF分析的条件相同；MS扫描范围为m/z300-1800;最大累积时间100ms，MS谱图平均2次；目标质量数900，化合物稳定性100%，阱深100%；MS/MS才有优选方法；隔离宽度4;母离子数2;母离子强度绝对阈值100000，相对阈值0.1%;动态排除2次并在0.5min释放；MS/MS碎裂电压1.2V；MS/MS谱图平均2次。[0028]本发明还提供了一种与上述内标多肽联合使用用于检测早期糖尿病的多肽标志物，其来源于人血清白蛋白，具有SEQIDN0.2所述的氨基酸序列，m/z=614.8。[0029]本发明提供了具有SEQIDN0.2所述的氨基酸序列的多肽在制备糖尿病早期诊断试剂盒中的应用。[0030]本发明提供了一种与上述内标多肽联合使用用于检测早期糖尿病的多肽标志物，其来源于人血清白蛋白，具有SEQIDN0.5所述的氨基酸序列，m/z=537.7。[0031]本发明提供了具有SEQIDN0.5所述的氨基酸序列的多肽在制备糖尿病早期诊断试剂盒中的应用。[0032]本发明提供了一种与上述内标多肽联合使用用于检测早期糖尿病的多肽标志物，其来源于人血清白蛋白，具有SEQIDN0.11所述的氨基酸序列，m/z=820.5。[0033]本发明提供了具有SEQIDN0.11所述的氨基酸序列的多肽在制备糖尿病早期诊断试剂盒中的应用。[0034]本发明提供一种用于诊断早期糖尿病的试剂盒，其工作程序为:(1)采集血液以及获得血浆；(2)将血浆样本按照进行酶切，酶切条件为:向例血浆样品中加入16μL含8Μ尿素的IOmMDTT溶液进行变性，于37°C水浴孵育4h，再加入50mMIAA溶液甲基化封闭氨基酸侧链的活泼基团，于黑暗处反应lh，再加入溶于pH8.3的NH4HCO3缓冲液中的胰蛋白酶，使HSA:胰蛋白酶的质量比=10~125:1，于37°C水浴孵育8~20h;(3)HPLC-ES1-TOFMS检测多肽样品；(4)读取生物标志物肽段(FKDLGEENFK、LDELRDEGK和/或KVPQVSTPTLVEVSR)与内标肽段AAFTECCQAADKAACLLPK的质谱峰面积，分别计算生物标志物肽段和内标肽段质谱峰面积的比值；(5)考察比值所处的范围，判断糖尿病发生的风险程度，对早期糖尿病进行诊断:若肽段FKDLGEENFK(m/z=614.8)与内标肽段离子(m/z=977.4)峰面积之比在0.012-0.026之间，则有样品来源的宿主有较大的罹患糖尿病的风险；若比值在0.034-0.121之间，则有潜在的罹患糖尿病的风险；若比值在0.115-0.330之间，则说明宿主罹患糖尿病的风险较小。若LDELRDEGK(m/z=537.7)与内标肽段AAFTECCQAADKAACLLPK(m/z=977.4)峰面积之比值在0.075-0.609之间，则样品来源的宿主有较大的罹患糖尿病的风险。KVPQVSTPTLVEVSR(m/z=820.5)与内标肽段AAFTECCQAADKAACLLPK(m/z=977.4)的比值中，若比值在0.010-0.031之间，则有较大的罹患糖尿病的风险；若比值在0.021-0.100之间，则有潜在的罹患糖尿病的风险；若比值在0.070-0.289之间，则说明样品来源的宿主罹患糖尿病的风险较小。[0035]本发明还提供了一种体外模型筛选糖尿病多肽标志物的方法，包括以下步骤:[0036](1)体外糖基化样品的制备，将无菌HSA于50mMpH7.4的PBS缓冲液中配成生理浓度的溶液40mM/mL，分别与4种不同浓度的D-葡萄糖在37°C水浴共同孵育10、20和30天，使得HSA与D-葡萄糖的摩尔比分别为1:10、1:41.5、1:83和1:415;以同样条件下不添加D-葡萄糖溶液的反应体系作为空白对照；[0037](2)胰酶消化，将蛋白样品溶于50mMpH8.3的NH4HCO3缓冲液中，向每200μg经糖基化的HSA与空白对照HSA样品中加入20μL含8M尿素的IOmMDTT(二硫苏糖醇)溶液进行变性，于37°C水浴孵育4h，再加入50mMIAA(碘乙酰胺)溶液甲基化封闭氨基酸侧链的活泼基团，于黑暗处反应lh，再加入溶于pH8.3的NH4HCO3缓冲液中的胰蛋白酶，使HSA:胰蛋白酶的质量比=10~125:1，于37°C水浴孵育8~20h;[0038](3)180标记，将冻干后的肽段样品溶于50~150mMpH4.0~7.0的KH2PO4溶液中后再次冻干备用；向未经修饰的HSA-肽段和糖基化HSA-肽段加入分别用H218O和H216O溶解的胰蛋白酶(HSA:胰蛋白酶=1~125:1，w/w)，在37°C水浴中标记8~24小时，标记完成后，残余的胰蛋白酶需经灭活处理，将样品在沸水中煮10分钟，再加入5%的甲酸(v/v)；在HPLC-MS进行分析之前，样品需经过高速离心处理(17，OOOXg,15min)，以确保无不溶物进到HPLC-MS分析系统里。体系尿素浓度控制在2M以下；[0039](4)HPLC/ES1-TOFMS方法对样品进行定量分析，和用HPLC/ES1-1onTrapMS方法对样品进行定性分析；[0040](5)数据分析与内标肽段的选择，Agilent公司MassHunter软件的MFE算法用于提取HPLC/ES1-TOFMS的数据特征，提取参数:保留时间8.00-45.0Omin;质荷比m/Z300-1800;信噪比阈值S/N5;谱峰数目1000X1000;选中肽同位素分布；PeakPair软件被用于挑选相应肽段的160/180峰对，并计算出160/180峰面积的比值用于肽段的定量分析，若160/180峰面积的比值小于1，则说明未经修饰的HSA来源的肽段被消耗，该肽段拥有易被修饰的糖基化位点，经过糖基化过程，生成了带有糖链修饰的新肽段；若160/180峰面积的比值等于1，则说明该肽段经过与葡萄糖共育并未被消耗，不存在对葡萄糖敏感的糖基化位点；在TOFMS数据中，发现I个葡萄糖不敏感肽段AAFTECCQAADKAACLLPK，m/z=977.4，Rt=28.7均可在每一次质谱检测中稳定地被检测到，质谱信号达到105，肽段的160/180峰面积比例最接近1，且SD值最小0.961±0.077，选择该肽段为内标肽段；[0041](6)分别考察浓度为6.0mM,24.9mM、49.8mM以及249.0mM的葡萄糖溶液，在不同孵育时间10天、20天和30天下HSA糖基化修饰的浓度依赖性，以内标肽段的单同位素峰面积为标准，用其他3反应时间延长或葡萄糖溶液浓度变大而下调的肽段单同位素峰面积之t匕，选择具有质谱信号强度、肽段离子在每次质谱检测中均可被稳定的捕捉到，且在HPLC/ES1-TOFMS和HPLC/ES1-1onTrapMS检测中同时满足相同的保留时间和质荷比的误差在可接受范围内，其中ΔRt=±0.2min,—级质谱Δm/z=±0.3,侧重于表现糖基化修饰具有时间依赖性和浓度依赖性的离子，筛选得到易被修饰的葡萄糖敏感肽段。[0042]上述方法中，在本发明的实施例中，样品HPLC/ES1-TOFMS定量分析采用AgilentllOO系列高效液相色谱仪串联ES1-T0FMS(Agilent6210)进行，样品定性分析采用均AgilentllOO系列高效液相色谱仪串联ES1-1onTrapMSD。[0043]HPLC/ES1-TOFMS分析液相色谱条件为:色谱柱为GraceC18柱(300A，2.1mmX150mm);流速0.2mL/min;进样量IOyg;所用流动相为:A相为含0.1%甲酸的水溶液相为含0.1%甲酸的乙腈溶液。梯度洗脱条件为:3%B，0—8min;3-40%B，8—35min;40-95%B,35—40min;95%B,40—43min以及95_3%Bfrom43—45min;Postrun为IOmin；ES1-TOFMS条件为:以氮气作为干燥气和雾化气(干燥气流速10L/min;干燥气温度为350°C;雾化器压力为35psi);采用正离子模式；毛细管电压为-3.5kV;毛细管出口电压160V;锥孔电压60V；MS扫描范围为m/z300-1800amu；[0044]HPLC/ES1-1onTrapMS分析，样品定性分析的液相色谱条件和质谱ESI离子源条件与上述HPLC/ES1-TOF分析的条件相同；MS扫描范围为m/z300-1800;最大累积时间100ms,MS谱图平均2次；目标质量数900，化合物稳定性100%，阱深100%；MS/MS才有优选方法；隔离宽度4;母离子数2;母离子强度绝对阈值100000，相对阈值0.1%;动态排除2次并在0.5min释放；MS/MS碎裂电压1.2V；MS/MS谱图平均2次。[0045]在过往的研究中，研究者们的传统观点普遍是认为功能性蛋白为低丰度蛋白，因而生物标志物也会来自低丰度蛋白，因而研究思路也往往偏离了本发明的方向。而本发明的主要创新之处在于选择了高丰度蛋白作为研究对象，研究发现，糖基化反应属于非酶催化的化学反应，不具有选择性。因此外周血高丰度蛋白有更高的概率被葡萄糖所修饰，而修饰的程度则反映体内尚未代谢掉的葡萄糖的水平，且血糖的改变也会在蛋白上得到体现，因而可以比测量血糖水平更敏锐的发现罹患糖尿病的趋势，同时规避了低丰度蛋白在检测上的困难，包括难以达到准确定量等不利因素。[0046]本发明筛选并验证得到了一组有效、典型葡萄糖敏感肽段，这既弥补了单一生物标志物特异性不高、准确性欠佳等问题，又创新性的提出了用HSA自身酶切得到葡萄糖不敏感肽段作为内标，以葡萄糖敏感肽段和内标肽段峰面积之比作为糖基化修饰程度指标，这一新思路巧妙地解决了临床样品中存在较大个体差异，而使得相对定量存在较大困难的问题。本发明提出了定量肽类生物标志物作为临床糖尿病早期诊断的新策略，获得了预防和监测糖尿病的相关指标。这对于糖尿病的早期诊断和有效干预有重大意义和光明的前景。【专利附图】【附图说明】[0047]图1为不同胰蛋白酶与HSA的比例对酶解效率的影响图。[0048]图2为不同酶解时间对酶解效率的影响图。[0049]图3为18O标记与未标记肽段单独分析或l:l(v/v)混合分析质谱图:图3A为HSA酶切所得肽段m/z=537.7经18O标记后的质谱图。其中1^111/2=537.7)为未标记18O原子的肽段的单同位素峰；1:011/2=538.7)为标记一个18O原子的肽段的单同位素峰；I2(m/z=539.7)为标记一个18O原子的肽段的单同位素峰。图3Β1:1(v/v)混合分析时所得肽段(m/z=614.8，z=2)的16O-18O质谱峰对，18O标记与未标记肽段的单同位素峰其质量数相差4Da。图3B显示的是HSA肽段(m/z=614.8,z=2)在18O标记和未标记样品1:1(v/v)混合分析时的质谱图。其160/180峰面积的比值，按照简化后的方法仅计算单同位素的峰面积，应为m/z=614.8的峰面积比上m/z=616.8的峰面积等于0.81。[0050]图4不同尿素浓度对标记比例的影响图，其中图4A可被稳定检测到的57个酶切后HSA肽段，在不同尿素浓度下标记比例的平均值；图4B标记比例值最低的4个肽段，其标记效率对尿素浓度的变化趋势。[0051]图5标记缓冲液pH值、浓度以及酶切终止方式对标记比例的影响图，其中图5A标记缓冲液PH值对标记比例的影响；图5B为KH2PO4-K2HPO4浓度对4个标记比例最低的肽段的影响；图5C为使用甲酸终止酶解对后续标记步骤标记比例的影响。[0052]图6标记时间对标记效率的影响。[0053]图7为优化条件下57个可被稳定检测的HSA肽段标记效率的分布情况。[0054]图8不同孵育时间与不同葡萄糖浓度下的葡萄糖不敏感肽段AAFTECCQAADKAACLLPK的160/180相对峰面积比例。[0055]图9为比较的方法示意图，其中比例I是与葡萄糖共育的葡萄糖敏感肽段与内标肽段的峰面积之比，这一比值越小说明糖基化的程度越高；比例2是对照组葡萄糖敏感肽段与内标肽段的峰面积之比，这一比例用于校正不同肽段之间由于其它因素导致的差异，如离子化效率等；而最终衡量一个葡萄糖敏感肽段的变化的比例为比例I与比例2之比。[0056]图10为HSA与不同浓度葡萄糖溶液发生糖基化反应的情况，图1OA为HSA肽段与葡萄糖溶液共育10天后各肽段的160/180峰面积之比；图1OB为HSA肽段与葡萄糖溶液共育20天后各肽段的160/180峰面积之比；图1OC为HSA肽段与葡萄糖溶液共育30天后各肽段的160/180峰面积之比。[0057]图11软件模拟内标肽段与葡萄糖敏感肽段在HSA空间结构中的位置图。[0058]图12为混合血浆样品中葡萄糖不敏感肽段AAFTECCQAADKAACLLPK在不同孵育时间与不同葡萄糖浓度下的160/180相对峰面积比例。[0059]图13HPLC-MS检测混合血浆样品体外模型中的肽段FKDLGEENFK，其中图13A为HPLC-MS检测混合血浆样本中肽段FKDLGEENFK在不同孵育时间下被不同浓度葡萄糖修饰的情况；图13B为HPLC-MS检测混合血浆样本中肽段在浓度葡萄糖存在下于不同孵育时间被修饰的情况；图13C为肽段FKDLGEENFK在不同孵育时间下与不同浓度葡萄糖共育后经HPLC-MS检测的质谱峰图。[0060]图14是肽段ETYGEMADCCAK与6.0mM葡萄糖共孵育10天的质谱图。[0061]图15HPLC-MS检测混合血浆样品体外模型中的肽段YLYEIAR，其中，其中图15A为HPLC-MS检测混合血浆样本中肽段YLYEIAR在不同孵育时间下被不同浓度葡萄糖修饰的情况；图15B为HPLC-MS检测混合血浆样本中肽段YLYEIAR在浓度葡萄糖存在下于不同孵育时间被修饰的情况；图15C为肽段YLYEIAR在不同孵育时间下与不同浓度葡萄糖共育后经HPLC-MS检测的质谱峰图。[0062]图16HPLC-MS检测混合血浆样品体外模型中的肽段LDELRDEGK，其中图16A为HPLC-MS检测混合血浆样本中肽段LDELRDEGK在不同孵育时间下被不同浓度葡萄糖修饰的情况；图16B为HPLC-MS检测混合血浆样本中肽段LDELRDEGK在浓度葡萄糖存在下于不同孵育时间被修饰的情况；图16C为肽段LDELRDEGK在不同孵育时间下与不同浓度葡萄糖共育后经HPLC-MS检测的质谱峰图。[0063]图17HPLC-MS检测混合血浆样品体外模型中的肽段LSQRFPK，其中图17A为HPLC-MS检测混合血浆样本中目标肽段在不同孵育时间下被不同浓度葡萄糖修饰的情况；图17B为HPLC-MS检测混合血浆样本中目标肽段在浓度葡萄糖存在下于不同孵育时间被修饰的情况；图17C为肽段LSQRFPK在不同孵育时间下与不同浓度葡萄糖共育后经HPLC-MS检测的质谱峰图。[0064]图18HPLC-MS检测混合血浆样品体外模型中的肽段LVTDLTK，其中图18A为HPLC-MS检测混合血浆样本中肽段LVTDLTK在不同孵育时间下被不同浓度葡萄糖修饰的情况；图18B为HPLC-MS检测混合血浆样本中肽段LVTDLTK在浓度葡萄糖存在下于不同孵育时间被修饰的情况；图18C为肽段LVTDLTK在不同孵育时间下与不同浓度葡萄糖共育后经HPLC-MS检测的质谱峰图。[0065]图19HPLC-MS检测混合血浆样品体外模型中的肽段DVFLGMFLYEYAR，其中图19A为HPLC-MS检测混合血浆样本中肽段DVFLGMFLYEYAR在不同孵育时间下被不同浓度葡萄糖修饰的情况；图19B为HPLC-MS检测混合血浆样本中肽段DVFLGMFLYEYAR在浓度葡萄糖存在下于不同孵育时间被修饰的情况；图19C为肽段DVFLGMFLYEYAR在不同孵育时间下与不同浓度葡萄糖共育后经HPLC-MS检测的质谱峰图。[0066]图20HPLC-MS检测混合血浆样品体外模型中的肽段RHPDYSVVLLLR。[0067]图21为HPLC-MS检测混合血浆样本中肽段CCAAADPHECYAK在不同孵育时间下被不同浓度葡萄糖修饰的情况。[0068]图22A为HPLC-MS检测混合血浆样本中肽段CCAAADPHECYAK在浓度葡萄糖存在下于不同孵育时间被修饰的情况。图22B为肽段CCAAADPHECYAK在不同孵育时间下与不同浓度葡萄糖共育后经HPLC-MS检测的质谱峰图。图22CHPLC-MS检测混合血浆样品体外模型中的肽段KVPQVSTPTLVEVSR。[0069]图23HPLC-MS检测混合血浆样品体外模型中的肽段CCTESLVNR。[0070]图24为糖尿病肽类生物标志物临床验证实验流程图。[0071]图25临床样品中内标肽段离子m/z=977.4峰面积信息的获得。[0072]图26临床样品不同组别中检测目标肽段FKDLGEENFK。[0073]图27临床样品不同组别中检测目标肽段YLYEIAR。[0074]图28临床样品不同组别中检测目标肽段LDELRDEGK。[0075]图29临床样品不同组别中检测目标肽段LVTDLTK。[0076]图30HPLC-MS无法实现T2DM临床样品中肽段DVFLGMFLYEYAR的检测。[0077]图31临床样品不同组别中检测目标肽段KVPQVSTPTLVEVSR。[0078]图32糖尿病肽类生物标志物候选物在HSA上空间位置。【具体实施方式】[0079]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。[0080]若未特别指明，实施例中所用的生物化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的仪器耗材均为市售；若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。[0081]实施例1体外建立基于HAS单一蛋白筛选葡萄糖敏感肽段的模拟体内糖基化模型[0082]1、体外糖基化样品的制备[0083]体外糖基化样品的制备基本可依据文献报道的方法【Sattarahmady,N.,etal.,Formationofthemoltenglobule-likestateduringprolongedglycationofhumanserumalbumin.[J].BiochimBiophysActa,2007.1770(6):p.933-42]D将未经修饰的人血清白蛋白(HAS)(纯度≥96%，购自北京拜尔迪生物技术有限公司)于50mMPBS(pH7.4)缓冲液中配成生理浓度的溶液(40mM/mL)，分别与4种不同浓度的D-葡萄糖在37°C水浴共同孵育10天、20天和30天，使得HSA与D-葡萄糖的摩尔比分别为1:10、1:41.5、1:83和1:415。4个葡萄糖浓度分别依据生理葡萄糖浓度(~12.05%糖基化位点覆盖率)、理论50%糖基化位点覆盖率、理论100%糖基化位点覆盖率以及葡萄糖过量5倍而设计。每个浓度和孵育时间下分别制备三个平行样品，以同样条件下不添加D-葡萄糖溶液的反应体系作为空白对照。所有溶液事先均经过无菌处理，方法如下:在超净工作台中，使用0.2μm无菌针头式过滤器(PALL,Φ13mm,Supor亲水性聚醚砜膜)过滤除菌，将样品转入经无菌处理的离心管中，密封。且共育过程中，使用对二甲苯作为抑菌剂对溶液进行液封。孵育结束后的样品，经冷冻干燥后储存于_80°C冰箱中备用。[0084]2、胰蛋白酶消化条件的考察及优化[0085]实现完全酶解及保持酶解效率的稳定性是本发明的基础，有必要对酶解条件进行优化，主要针对以下两个方面。[0086]2.1考察最佳的HSA与胰蛋白酶比例[0087]为了了解最适宜的酶解时胰蛋白酶与HSA的比例,在固定了酶解时间为24h(保证充分酶解)的前提下，分别采用了trypsin:HSA=1:125、1:100、1:50、1:25以及1:10(w/w)五个条件进行测试，结果如图1所示:[0088]在HSA酶解后进行HPLC/ES1-TOF分析时，随机选择了不同保留时间的肽段峰面积计算蛋白的酶解效率，在对比胰酶用量对酶切进行的影响时，每个比例下的进样均选择相同的肽段。在图1中，横坐标为胰蛋白酶用量从少到多的5个比例，纵坐标为胰蛋白酶与HSA不同比例下,HSA酶解效率与trypsin:HSA=l:50(w/w)时酶解效率的比值。从图1所示的结果来看，随着胰蛋白酶用量的增加，酶解效率从trypsin:HSA=1:125至1:50(w/w)逐渐增加，当胰蛋白酶的用量超过trypsin:HSA=l:50(w/w)时,酶解效率不随胰酶用量的增多而提高，因此过多的胰酶使用量只能带来胰酶的浪费。经过考察，最佳的胰蛋白酶与HSA比例为I:50(w/w)ο[0089]2.2考察最佳的酶解时间[0090]将HSA变性、封闭，加入胰酶之后在37°C水浴孵育，按设计的时间点取样，进样至HPLC/ES1-TOFMS，按照肽段的峰面积计算酶解效率，情况如图2所示。[0091]图2的横坐标表示不同取样时间点,纵坐标为不同酶解时间下,HSA酶解效率与酶解16小时酶解效率的比值。从图2所示的结果来看，随着酶解时间的延长，酶解效率从0.5h至16h逐渐增加，当酶解时间超过16h以后，无论孵育时间延长多久，酶解效率不再随时间的延长而提高，而是稳定在一个平衡的状态。但是，最终的实验方案将酶解时间定为20h，这是为了确保HSA得到充分的酶解。[0092]3,18O标记条件的考察及优化[0093]用分步法分别实现蛋白的酶解和酶解后肽段的18O标记。在第一步的酶解过程中，需要引入尿素作为变性剂，使得蛋白结构变松散，有利于酶切位点的识别，而尿素会滞留在反应体系内，对接下来的18O标记过程具有一定的干扰作用。因此需考察标记反应时体系内的尿素浓度对标记效率的影响。标记缓冲液的条件也需要被考察，包括缓冲液的PH值及其浓度。PH值直接关系到催化标记反应的胰酶的活性，因此pH值的选择可能对标记效率有很大影响。此外，标记时间对18O标记效率也具有一定影响，时间过短达不到最大标记比例；时间过长亦不会对提高标记效率起到有利作用。最终，还要对优化条件在完成的18O标记的标记质量进行评估，以确定可达到稳定且高效率的标记。[0094]不同的肽段由于其氨基酸序列不同，会有空间结构上的差异，以至于被胰酶催化进行18O标记的活性也不同，因此不同种类的肽段的标记效率也存在差异。但尽管如此，标记作为一个可逆反应，不同肽段在达到标记平衡时所能获得的最大标记比例是相同的。其原因在于，当达到标记平衡时，标记比例不再取决于胰酶催化的活性，而只与H218O纯度有关。对于本发明使用的97%的!12180而言，达到标记平衡时所标记上2个18O的最大比例为:97%X97%=94.09%。标记的速率不同，到达最大标记比例所用的时间就不同。[0095]肽段经过18O标记后，由于无法实现完全标记因而存在三种类型的肽段:未标记上18O原子的肽段、标记上一个18O原子的肽段和标记上两个18O原子的肽段，如图3A所示。在本发明中，标记比例指的是标记上两个18O原子的肽段占总肽段的百分比；而相对标记效率指的是标记比例与理论最大标记效率的相对比值。于是在本发明中，标记效率被定义为相对标记比例。为了简化计算，拟采用单同位素峰的峰面积来计算标记比例，计算方法如下:【权利要求】1.一种用于早期糖尿病诊断的内标多肽，其特征在于，其来源于人血清白蛋白，具有SEQIDN0.1所述的氨基酸序列。2.权利要求1所述的内标多肽在制备早期糖尿病诊断试剂盒中的应用。3.一种筛选权利要求1所述内标多肽的方法，其特征在于，包括以下步骤:(1)体外糖基化样品的制备，将无菌HSA于50mMpH7.4的PBS缓冲液中配成生理浓度的溶液，分别与4种不同浓度的D-葡萄糖在37°C水浴共同孵育10、20和30天，使得HSA与D-葡萄糖的摩尔比分别为1:10、1:41.5、1:83和1:415;以同样条件下不添加D-葡萄糖溶液的反应体系作为空白对照；(2)胰酶消化，蛋白样品溶于50mMpH8.3的NH4HCO3缓冲液中，向每200μg经糖基化的HSA与空白对照HSA样品中加入20μL含8M尿素的IOmMDTT溶液进行变性，于37°C水浴孵育4h，再加入50mMIAA溶液甲基化封闭氨基酸侧链的活泼基团，于黑暗处反应lh，再加入溶于PH8.3的NH4HCO3缓冲液中的胰蛋白酶，使HSA:胰蛋白酶的质量比=10~125:1，于37°C水浴孵育8~20h;(3)180标记，将冻干后的肽段样品溶于50~150mMpH4.0~7.0的KH2PO4溶液中后冻干备用；向未经修饰的HSA-肽段和糖基化HSA-肽段加入分别用H218O和H216O溶解的胰蛋白酶，HSA:胰蛋白酶质量比=1~125:1，在37°C水浴中标记8~24小时；(4)HPLC/ES1-T0FMS方法对样品进行定量分析和用HPLC/ES1-1onTrapMS方法对样品进行定性分析；(5)数据分析与内标肽段的选择,Agilent公司MassHunter软件的MFE算法用于提取HPLC/ES1-TOFMS的数据特征，提取参数:保留时间8.00-45.0Omin;质荷比m/z300_1800；信噪比阈值S/N5;谱峰数目1000X1000;选中肽同位素分布；PeakPair软件被用于挑选相应肽段的160/180峰对，并计算出160/180峰面积的比值用于肽段的定量分析，若160/180峰面积的比值小于1，则说明未经修饰的HSA来源的肽段被消耗，该肽段拥有易被修饰的糖基化位点，经过糖基化过程，生成了带有糖链修饰的新肽段；若160/180峰面积的比值等于1，则说明该肽段经过与葡萄糖共育并未被消耗，不存在对葡萄糖敏感的糖基化位点；在--MS数据中，发现I个葡萄糖不敏感肽段AAFTECCQAADKAACLLPK，m/z=977.4，Rt=28.7min均可在每一次质谱检测中稳定地被检测到，质谱信号达到105，肽段的160/180峰面积比例最接近1，且SD值最小0.961±0.077，选择该肽段为内标肽段。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(3)还包括在标记完成后，残余的胰蛋白酶需经灭活处理，将样品在沸水中煮10分钟，再按照体积比加入5%的甲酸。5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(3)中标记体系尿素浓度控制在2M以下。6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，在HPLC/ES1-TOFMS分析之前，样品需经过离心处理，离心条件为17,OOOXg,15min。7.一种与权利要求1所述内标多肽联合使用用于检测早期糖尿病的多肽标志物，其特征在于，其来源于人血清白蛋白，具有SEQIDN0.2所述的氨基酸序列。8.一种与权利要求1所述内标多肽联合使用用于检测早期糖尿病的多肽标志物，其特征在于，其来源于人血清白蛋白，具有SEQIDN0.5所述的氨基酸序列。9.一种与权利要求1所述内标多肽联合使用用于检测早期糖尿病的多肽标志物，其特征在于，其来源于人血清白蛋白，具有SEQIDN0.11所述的氨基酸序列。10.一种体外模型筛选糖尿病多肽标志物的方法，其特征在于，包括以下步骤:(1)体外糖基化样品的制备，将无菌HSA于50mMpH7.4的PBS缓冲液中配成生理浓度的溶液，分别与4种不同浓度的D-葡萄糖在37°C水浴共同孵育10、20和30天，使得HSA与D-葡萄糖的摩尔比分别为1:10、1:41.5、1:83和1:415;以同样条件下不添加D-葡萄糖溶液的反应体系作为空白对照；(2)胰酶消化，将蛋白样品溶于50mMpH8.3的NH4HCO3缓冲液中，向每200μg经糖基化的HSA与空白对照HSA样品中加入20μL含8M尿素的IOmMDTT溶液进行变性，于37°C水浴孵育4h，再加入50mMIAA溶液甲基化封闭氨基酸侧链的活泼基团，于黑暗处反应lh，再加入溶于PH8.3的NH4HCO3缓冲液中的胰蛋白酶，使HSA:胰蛋白酶的质量比=10~125:1，于37°C水浴孵育8~20h;(3)180标记，将冻干后的肽段样品溶于50~150mMpH4.0~7.0的KH2PO4溶液中后再次冻干备用；向未经修饰的HSA-肽段和糖基化HSA-肽段加入分别用H218O和H216O溶解的胰蛋白酶(HSA:胰蛋白酶质量比=1~125:1，在37°C水浴中标记8~24小时；(4)HPLC/ES1-TOFMS方法对样品进行定量分析，和用HPLC/ES1-1onTrapMS方法对样品进行定性分析；(5)数据分析与内标肽段的选择,Agilent公司MassHunter软件的MFE算法用于提取HPLC/ES1-TOFMS的数据特征，提取参数:保留时间8.00-45.0Omin;质荷比m/z300_1800；信噪比阈值S/N5;谱峰数目1000X1000;选中肽同位素分布；PeakPair软件被用于挑选相应肽段的160/180峰对，并计算出160/180峰面积的比值用于肽段的定量分析，若160/180峰面积的比值小于1，则说明未经修饰的HSA来源的肽段被消耗，该肽段拥有易被修饰的糖基化位点，经过糖基化过程，生成了带有糖链修饰的新肽段；若160/180峰面积的比值等于1，则说明该肽段经过与葡萄糖共育并未被消耗，不存在对葡萄糖敏感的糖基化位点；在--MS数据中，发现I个葡萄糖不敏感肽段AAFTECCQAADKAACLLPK，m/z=977.4，Rt=28.7均可在每一次质谱检测中稳定地被检测到，质谱信号达到105，肽段的160/180峰面积比例最接近I，且SD值最小0.961±0.077，选择该肽段为内标肽段；(6)分别考察浓度为6.0mM,24.9mM、49.8mM以及249.0mM的葡萄糖溶液，在不同孵育时间10天、20天和30天下HSA糖基化修饰的浓度依赖性，以内标肽段的单同位素峰面积为标准，用其他3反应时间延长或葡萄糖溶液浓度变大而下调的肽段单同位素峰面积之t匕，选择具有质谱信号强度、肽段离子在每次质谱检测中均可被稳定的捕捉到，且在HPLC/ES1-TOFMS和HPLC/ES1-1onTrapMS检测中同时满足相同的保留时间和质荷比的误差在可接受范围内，其中ΔRt=±0.2min,—级质谱Δm/z=±0.3,侧重于表现糖基化修饰具有时间依赖性和浓度依赖性的离子，筛选得到易被修饰的葡萄糖敏感肽段。【文档编号】G01N30/02GK103897035SQ201410090215【公开日】2014年7月2日申请日期:2014年3月12日优先权日:2013年9月4日【发明者】邓玉林,张玫申请人:北京理工大学