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专利名称：快速检测猪繁殖与呼吸道综合征病毒的胶体金测试试纸条的制作方法
技术领域：
本实用新型属于预防兽医学检验领域，具体是涉及一种快速检测猪繁殖与呼吸 道综合征病毒的胶体金测试试纸条。
背景技术：
猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome vinis， PRRSV)为动脉炎病毒科动脉炎病毒属成员。它是猪的一种重要传染性疾病 病原，主要引起妊娠期母猪早产、流产，产死胎、弱胎、木乃伊胎，新生仔猪普遍 发生肺炎、生长迟缓和死亡率增加。该病毒最早发现于美国，随后欧洲、亚洲、大 洋洲多个国家和地区均发现了该病毒。1996年，郭宝清等首次报道从流产胎儿中分 离到PRRSV，从而证实我国也存在该病毒。2006年以来，由PRRSV突变株所引起的 "高致病性猪蓝耳病"席巻了中国大部分省份，给养猪业带来了灾难性的经济损失。
为了便于对猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)做出准确的诊断，已经建立多种实验室 诊断方法，如ELISA， RT-PCR，免疫荧光，原位杂交，病毒分离等，但这些诊断 方法需要借助一些特殊仪器的辅助才能完成，稳定性较差、操作麻烦、效率低、需 低温保存、储运不方便，这就限制了这些方法在基层单位的广泛使用。
发明内容
本实用新型的目的是提供一种快速检测猪繁殖与呼吸道综合征病毒的胶体金 测试试纸条，以解决现有技术存在的需要借助一些特殊仪器的辅助才能完成检测， 稳定性较差、操作麻烦、效率低、需低温保存、储运不方便的问题。其采用两条带 显色的胶体金层析法制备，显带颜色为红色线条，能准确检测出样品中猪繁殖与呼 吸道综合征病毒的含量。
本实用新型的技术方案是包括底衬、样品垫、涂覆胶体金颗粒标记抗体的玻 璃纤维膜、包被膜和吸水纸，包被膜的底面粘帖在底衬上面，在该包被膜两端的上 面分别粘帖玻璃纤维膜和吸水纸，在该玻璃纤维膜的另一端的上面粘帖样品垫；在 该包被膜的上面设有检测线和控制线，该检测线包被处理好的猪繁殖与呼吸道综合控制线包被处理好的抗鼠抗体。
本实用新型采用双抗体夹心法，可用来检测血液样品或者棉拭子等处理样品。 与现有检测试剂盒比较，由于对检测线和控制线进行了相应的处理，使其能够产生 特异条带，从而满足现地农户、基层检测的需求。
本实用新型具有高度特异性、灵敏度、检测速度等优点，且不需使用仪器设备， 成本低廉，操作简便，能广泛应用于现地农户、基层及个人对于猪繁殖与呼吸道综 合征病毒的检测。该试纸条可以直接使用，也可以装配在塑料装置中以检测板形式 使用。


图1为本实用新型的侧面结构示意图； 图2为图1的俯视图3为本实用新型检测结果为阳性的示意图(包被膜4表面的检测线6和控制 线7均显色)；
图4为本实用新型检测结果为阴性的示意图(包被膜4表面的控制线7显色而
检测线6不显色)；
图5为试纸条无效的示意图(包被膜4表面的检测线6和控制线7均不显色)。
具体实施方式

如图1和图2所示，本实用新型包括在底衬1上顺次相互搭接地粘帖样品垫2、 涂覆约20nm厚的胶体金颗粒标记抗体的玻璃纤维膜3、包被膜4以及吸水纸5而 形成，包被膜4有检测线6和控制线7，检测线6包被猪繁殖与呼吸道综合征病毒 的抗体，控制线7包被抗鼠抗体；通过所述检测线:6和控制线7的显色来定性。
所述的猪繁殖与呼吸道综合征病毒的抗体为高纯度的抗单克隆抗体和/或多克 隆抗体；所述胶体金颗粒标记抗猪繁殖与呼吸道综合征病毒的单克隆抗体。
本实用新型的制备方法是
1、 包被膜4的制备在硝酸纤维素膜上分别喷涂抗猪繁殖与 呼吸道综合征病毒的抗体及抗鼠IgG抗体，并呈两条线上下排列，分别形成检 测线6和控制线7。
检测线6:调试喷膜机，喷液量为25微升/35厘米，用包被缓冲液稀释抗猪繁 殖与呼吸道综合征病毒的单克隆抗体，浓度为70ug/ul，用喷膜机喷涂划线，室温晾干20分钟。
控制线7:调试喷膜机，喷液量为25微升/35厘米，用包被缓冲液稀释抗鼠IgG 多克隆抗体，浓度为2mg/ml，机器划线，两线间隔5mm，应细致均匀，室温晾干20 分钟。37'C封闭60分钟，取出后置37"C烘干处理两小时，封袋备用。
2、 金标抗体(胶体金颗粒标记抗体)的制备用O. 1M碳酸钾调胶体金pH值 至7. 5，按15微克抗体/毫升胶体金加入抗猪繁殖与呼吸道综合征病毒的单克隆抗 体，混匀，静置30分钟，12000卬m离心30分钟，弃上清，沉淀用标记洗涤液洗涤 两次，最后一次其去上清，将沉淀用十分之一初始胶体金体积的金标抗体保存液溶 解，置4X:备用，效期7天；
3、 将制备好的金标抗体涂覆在玻璃纤维膜(或聚酯膜)上，制成涂覆金标抗 体的玻璃纤维膜3。
所述涂覆金标抗体的玻璃纤维膜3可以用普通方法将金标抗原涂覆在玻璃纤 维膜上，也可以通过下述方法得到将标记好的胶体金均匀地铺在玻璃纤维膜上， 每毫升溶液铺10平方厘米，冷冻干燥，封袋，置4"备用。
4、 在底衬1上顺次相互搭接地粘贴样品垫2、涂覆金标抗原的玻璃纤维膜3、 包被膜4以及吸水纸5，得到试纸板，按照要求切割成不同宽度的试纸条。
所述包被缓冲液和封闭液的配方及制备方法是本领域通用的技术。 本实用新型在上述制备方法中所涉及的材料的具体制备方法进一步详细说明 如下
A. 抗原制备采用高纯度的抗猪繁殖与呼吸道综合征病毒的单克隆抗体作为包
被抗原。
B. 抗原膜的制备
包被缓冲液的制备0. 05M pH9. 6碳酸盐缓冲液为包被溶液，0.22u膜过滤， 置4'C备用，效期7天。
封闭液的配置配制0.01M pH7.0磷酸盐缓冲液(PBS)， 0.22u膜滤过，置4 'C备用，效期7天。配制封闭工作液2%BSA， 2%脱脂奶，0.01MpH7.0PBS， 0. 22u 膜滤过，置4"C备用，效期3天。
检测线制备调试喷膜机，喷液量为25微升/35厘米，用包被缓冲液稀释抗猪 繁殖与呼吸道综合征病毒的单克隆抗体，浓度为70ug/ml，机器划线，室温晾干20 分钟。
控制线制备调试喷膜机，喷液量为25微升/35厘米，用包被缓冲液稀释抗鼠IgG多克隆抗体，浓度为2mg/ml，机器划线，两线间隔5mm，应细致均匀，室温晾 干20分钟。37"C封闭60分钟，取出后置37'C烘干处理两小时，封袋备用。
C. 标抗体的制造规程
-氯金酸的配制用双蒸水溶解氯金酸，配成1%溶液，置4'C备用，效期3天。 1000ml 1%氯金酸溶液配方10g氯金酸；1000ml双蒸水。
柠檬酸三纳的配置用双蒸水溶解柠檬酸三纳，配成1%溶液，置4'C备用， 效期3天。
0. 1M碳酸钾的配制用双蒸水配制，0.22u膜滤过，置4。C备用，效期7天。 1000ml 0. 1M碳酸钾溶液配方:13. 8g碳酸钾；1000ml双蒸水。
3XPEG-20000的配制用双蒸水配制，0. 22u膜滤过，置4。C备用，效期7天。 1000ml 3XPEG溶液配方:30g PEG-20000; 1000ml双蒸水。
标记洗涤液的配制2%BSA， 0. OIM pH7. 0 PBS溶液，0. 22u膜滤过，置4。C备 用，效期两周。1000ml标记洗涤液的配制20g BSA;1000ml 0. 01M pH7. 0 PBS溶 液。
金标抗体保存液的配制:1%BSA， 0.5%脱脂奶，5/万NaN3， 0.1% Tween-20， 0. 01M pH 7. 0 PBS溶液，0. 22u膜滤过，置4。C备用，效期15天，1000ml金标抗 体保存液的配置:10g BSA;5g脱脂奶；0. 5g NaN3;lml Tween-20; 1000 ml 0. OIM pH 7. 0 PBS溶液。
胶体金的烧制用双蒸水将1%氯金酸稀释成0.01%，置电炉煮沸，按每IOO 毫升0.01%氯金酸加入4毫升1%柠檬酸三纳，继续煮沸，直到液体呈亮红色即停 止加热，冷却至室温后补足失水。外观应纯净，透亮，无沉淀和漂浮物。
金标抗体的制备用0. 1M碳酸钾调胶体金pH值至7. 6，按10微克抗体/毫升 胶体金加入抗猪繁殖与呼吸道综合征病毒的单克隆抗体，混匀，静置30分钟， 12000rpm离心三十分钟，弃上清，沉淀用标记洗涤液洗涤两次，最后一次弃去上 清，将沉淀用十分之一初始胶体金体积的金标抗体保存液溶解，置fC备用，效期 一周。
D. 金条抗体的干燥
将标记好的胶体金均匀地铺在玻璃纤维膜上，每毫升溶液铺10平方厘米，干 燥，封袋，置4"C备用。
E. 金标抗体包被的玻璃纤维膜宽度的确定
将胶体金玻璃纤维膜裁成4毫米、5毫米、6毫米规格，与包被膜组成测试条，每条宽4毫米。选择能检出室内质控样本，无非特异性反应的金标玻璃纤维膜宽度 定为使用宽度。
F. 金标抗体玻璃纤维膜的裁切
根据滴配实验确定的宽度，将金标抗体玻璃纤维膜进行裁切，置干燥房间备用。
G. 吸水纸的裁切
用裁纸机将吸水纸切成35厘米长，4.2厘米宽，置于干燥房间备用。
H. 玻璃纤维膜的裁切这是没有标记抗体的玻璃纤维膜，其起到引导液体流动 通路的作用。
将玻璃纤维模切成长35厘米，宽2厘米的长条，置于干燥房间备用。
I. 大板的粘贴
按要求把包被膜4、吸水纸5、已经涂覆在玻璃纤维膜的冻干金标抗体、玻璃 纤维膜3粘贴在塑料底板上，组成大板。组装车间温度控制在25。C，湿度20%-30 % 。
J.切条
用切条机将大板切成单头份，每份宽度3毫米，随机抽检，灵敏度能检出室内 质控，条带显色程度达到一个"+ "号，无非特异性条带。 K.封装与组盒
将1份已切好的试纸条与一包干燥剂封装在铝箔塑料袋内，放入试剂盒，与4-20
"c避光保存。
本实用新型所述的一种快速检测猪繁殖与呼吸道综合征病毒的胶体金测试试 纸条，采用高纯度的抗猪繁殖与呼吸道综合征病毒的单克隆抗体作为包被抗原进行 特异的猪繁殖与呼吸道综合征病毒检查。其原理是试纸条中含均匀分布的胶体金标 记猪繁殖与呼吸道综合征病毒的单克隆抗体，抗猪繁殖与呼吸道综合征病毒的抗体
及抗鼠IgG抗体分别固定于硝酰膜上并呈两条线上下排列，抗鼠IgG抗体在上方为 阴性对照，抗猪繁殖与呼吸道综合征病毒的抗体在下方为检测线。所述检测线和控 制线通过控制胶体金颗粒的大小与多少，得到颜色不同深浅的检测线和控制线从而 确定猪繁殖与呼吸道综合征病毒的有无。当被检样中含有猪繁殖与呼吸道综合征病 毒的抗原时，猪繁殖与呼吸道综合征病毒先和金标记的猪繁殖与呼吸道综合征病毒 的抗体进行特异性吸附，形成Ag-Ab3复合物。由于微孔滤膜的毛细管作用和层析 作用，反应复合物沿硝酰膜向前移动，待行至抗a猪繁殖与呼吸道综合征病毒的抗 体线时，形成Aba-Ag-AbP-Au复合物而富集在包被线上，最终形成一条红色沉淀线，是为猪繁殖与呼吸道综合征病毒的阳性反应。而试纸条上无关的金标记鼠IgG 继续上行至抗鼠IgG抗体处，与之形成红色标记的抗原抗体复合物是为阴性对照。 用于检测时，观察检测线6和控制线7的显色和形状来判断阳性还是阴性。如
图3，当检测线6和控制线7均显色时，结果为阳性；如图4所示，当控制线7显 色而检测线6不显色时，结果为阴性。图5为试纸条无效的示意图(包被膜4表面 的检测线6和控制线7均不显色)。
权利要求1、一种快速检测猪繁殖与呼吸道综合征病毒的胶体金测试试纸条，其特征在于包括底衬(1)、样品垫(2)、涂覆胶体金颗粒标记抗体的玻璃纤维膜(3)、包被膜(4)和吸水纸(5)，包被膜(4)的底面粘帖在底衬(1)上面，在该包被膜(4)两端的上面分别粘帖玻璃纤维膜(3)和吸水纸(5)，在该玻璃纤维膜(3)的另一端的上面粘帖样品垫(2)；在该包被膜(4)的上面设有检测线(6)和控制线(7)，该检测线(6)包被处理好的猪繁殖与呼吸道综合征病毒的抗体，该控制线(7)包被处理好的抗鼠抗体。
2、 根据权利要求1所述的快速检测猪繁殖与呼吸道综合征病毒的胶体金测试 试纸条，其特征在于所述的猪繁殖与呼吸道综合征病毒的抗体为高纯度的抗单克 隆抗体和/或多克隆抗体；所述胶体金颗粒标记抗体为抗猪繁殖与呼吸道综合征病 毒的单克隆抗体；抗猪繁殖与呼吸道综合征病毒的抗体及抗鼠IgG抗体分别固定于 硝酰膜上并呈两条线上下排列，构成所述的检测线(6)和控制线(7)。
专利摘要一种快速检测猪繁殖与呼吸道综合征病毒的胶体金测试试纸条，包括底衬、样品垫、涂覆金标抗体的玻璃纤维膜、包被膜和吸水纸，包被膜的底面粘帖在底衬上面，在该包被膜两端的上面分别粘帖玻璃纤维膜和吸水纸，在该玻璃纤维膜的另一端的上面粘帖样品垫；在该包被膜的上面设有检测线和控制线，该检测线包被猪繁殖与呼吸道综合征病毒的抗体，该控制线包被抗鼠抗体。该试纸条具有高度特异性、灵敏度、检测速度等优点，且不需使用仪器设备，成本低廉，操作简便，能广泛应用于现地农户、基层及个人对于猪繁殖与呼吸道综合征病毒的检测。
文档编号G01N33/577GK201397334SQ20092015067
公开日2010年2月3日 申请日期2009年5月18日 优先权日2009年5月18日
发明者崔尚金 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所