专利名称：一种筛选抗肠癌药物的方法
技术领域：
本发明涉及一种筛选药物的方法，尤其涉及一种以HIF-1 α为靶点的抗肿瘤药物的筛选方法。
背景技术：
缺氧诱导因子I (hypoxia inducible factor 1，HIF-1)是 HIFs 家族中最先被发现的成员，由对氧敏感的α亚基和稳定表达的β亚基组成的异源二聚体，作为缺氧诱导的、连接在EPO基因低氧反应元件上的一个核因子，在肿瘤细胞增殖代谢、肿瘤血管发生、侵袭转移和对药物治疗的反应中起着关键的调节作用。
HIF-1 α是HIF-1的调节及活性亚基，可被缺氧诱导表达，在细胞浆分泌后转移到细胞核内与HIF-1 β结合，激活下游靶基因，HIF-1的生物效应是主要由HIF-1a亚基介导实现。HIF-1 α基因位于人染色体14q21_q24区，全长3720bp，编码826个氨基酸，分子量为120KD。HIF-1a含4个不同的结构域:(I) bHLH和PAS结构域，参与HIF-1 二聚化和介导DNA结合；(2) N-末端和C-末端的入核信号NLS，介导HIF-1 α转位入核；(3)氧依赖性降解区域0DD，介导HIF-1 α的氧依赖性降解；(4)靠近N-末端的N-TAD和靠近C-末端的^々0，介导!1正-1(1的转录激活。C-TAD和N-TAD之间为抑制结构域，能降低TAD的活性，常氧下该抑制明显，两个入核信号只有C端的NLS才能介导HIF-1a入核。
缺氧状态下，肿瘤为了适应低氧环境，在能量代谢、血管生成、侵袭转移等方面产生了一系列的变化，HIF-1 α就是启动这一系列代谢和生物学行为改变的一个重要因子，在缺氧诱导的基因表达中起关键作用。研究发现，HIF-1 α在肿瘤细胞中参与调控的功能基因多达100种，主要有:(I)调控肿瘤血管新生，如血管内皮生长因子(VEGF)、血管生成素2 (Ang2)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)等；(2)参与糖代谢:糖酵解酶_11、醛缩酶A、葡萄糖载体I和3等；(3)介导肿瘤侵袭、转移:趋化因子受体4 (CXCR4)、间质细胞衍生因子I(SDF1)、转化生长因子β (TGF0 )等；(4)调节细胞凋亡:p53、BNIP3、RTP801等；(5)细胞增殖与分化:IGF2、EPO、TGF、FGF等。
常氧状态时，细胞在脯氨酰羟化酶(PHD)作用下，HIF-1 α中氧依赖降解区域(ODD)多肽序列内保守性的脯氨酸残基被羟化，导致HIF-1a可与VHUVon Hippel Lindau)肿瘤抑制蛋白结 合，通过蛋白酶体泛素化途径被降解。在缺氧状态下，细胞脯氨酰羟化反应受阻，HIF-Ια未能羟基化而不能被VHL识别，因此HIF-Ια不能被泛素化和被蛋白酶体降解，使其在细胞浆内呈指数增长。HIF-1a在胞浆内积聚、活化、转位至核内，与HIF-1 β形成具有转录活性的二聚体HIF-1，通过HIF-1 a C-末端的转录激活区域(C-TAD)诱导辅激活蛋白CBP/p300入核，p300-CBP复合物使HIF-1与CBP/ p300形成大分子复合物，并与受HIF-1 α调控的靶基因的启动子或增强子内的一个或多个低氧应答元件(HRE)上的HIF-1结合位点(5' -TACGTG23')结合，诱导缺氧反应基因的转录。
HIF-1a在结直肠癌、胃癌、卵巢癌、胰腺癌等多种实体瘤中高表达，且转移性肿瘤中的表达比原发性肿瘤明显较高。HIF-1 α的表达与肿瘤分期有关，临床分期越晚HIF-1 a蛋白阳性表达率越高，HIF-1 α在肿瘤的发生发展、侵袭转移和预后中起着关键的作用。目前研究认为，肿瘤缺氧状态下HIF-1 α可以通过与其下游DNA结合，调节靶基因mRNA的表达，但HIF-1a的靶基因多达上百种，被HIF-1 α激活的众多靶基因之间是如何相互作用、互相调节，目前研究的不多。HIF-1a自身活性的调控在很大的程度上决定了肿瘤细胞对氧分压变化及细胞因子应答的敏感性及准确性，而在肿瘤中HIF-1 α调控的信号通路研究仍不够明确。基于HIF-1 α的肿瘤信号转导通路主要与肿瘤组织的缺氧状态密切相关，以HIF-1 α分子为中心的信号转导通路还有很多是未知的。
随着肿瘤机理研究的不断深入，HIF-1 α的相关研究越来越多，其作用机制正逐步被揭示，但也存在着许多不足和问题，需要我们去进一步的深入研究和探讨:针对HIF-1 a基因的靶向治疗，直接从mRNA水平降低HIF-1 α的表达和转录活性是目前研究的热点，但目前只能从细胞培养的实验中得到证实，而临床应用还很困难；HIFs不具有可直接检测的活性，某些化学制剂和天然药物提取物可抑制HIF-1 α的表达，没有发现直接、特异性的以HIF-1a为靶点的药物，目前国外已经开始致力于探寻临床有效的HIF抑制剂，还没有建立标准化的有效的筛选方法。发明内容
针对目前缺乏有效的以HIF-1 α为靶点的抗肿瘤药物筛选方法的问题，本发明提供了一种高效表达HIF-1 α基因的肠癌细胞，以及使用所述高效表达HIF-1 α基因的肠癌细胞筛选药物的方 法。
本发明提供的第一种筛选抗肿瘤药物的方法，步骤包括: 步骤I，培养高效表达HIF-1 α基因的肠癌细胞； 步骤2，检测待测药物对所述细胞生长的抑制作用； 步骤3，根据待测药物抑制作用的大�。卸洗庖┪锸欠裎捎玫目怪琢鲆┪�。
其中，步骤2中检测方法可以是WST法、流式细胞术、MTI法或台盼蓝法。
本发明提供的第二种筛选抗肿瘤药物的方法，步骤包括: 步骤I，培养高效表达HIF-1 α基因的肠癌细胞； 步骤2，检测待测药物对所述细胞中HIF-1 α蛋白表达的影响； 步骤3，根据待测药物影响作用的大�。卸洗庖┪锸欠裎捎玫目怪琢鲆┪�。
其中，步骤2中所述检测方法优选为流式细胞术检测。
本发明提供的第三者筛选抗肿瘤药物的方法，步骤包括: 步骤I，培养高效表达HIF-1 α基因的肠癌细胞； 步骤2，检测待测药物对所述细胞中HIF-1 α基因mRNA表达的影响； 步骤3，根据待测药物影响作用的大�。卸洗庖┪锸欠裎捎玫目怪琢鲆┪�。
其中，步骤2中所述检测方法优选为实时PCR检测。
本发明上述的筛选抗肿瘤药物的方法中，所述高效表达HIF-1 α基因的肠癌细胞的制备方法如下: 步骤1，获取目的基因编码序列，将目的基因与慢病毒表达载体分别进行酶切；其中，所述目的基因为HIF-1 α基因、或该基因天然发生或人工发生的等位基因变异体；所述慢病毒表达载体包含HIV基本元件(如5’ LTR、3’ LTR以及其他辅助元件如WRE)、以及与HIF-1 α基因可操作地连接的调节序列(如启动子，包括pCMV、pUb1、反转录病毒的LTR灯任何在真核细胞中有作用的启动子); 步骤2，将所述目的基因编码序列的酶切产物与慢病毒表达载体进行定向克隆连接，构建得到慢病毒载体重组质粒； 步骤3，提供慢病毒包装系统，与所述重组质粒共转染293T细胞，获得慢病毒载体； 步骤4，慢病毒载体感染肠癌细胞。
其中，所述肠癌细胞选自人结肠癌细胞、结肠腺癌细胞、直肠癌细胞、直肠腺癌细胞、结直肠癌细胞。并有优选为结直肠癌细胞，进一步优选为结直肠癌的贴壁细胞。
上述的慢病毒载体和细胞株的制备方法，其中，获取目的基因的方法为PCR方法钓取目的基因，所用引物含交换配对碱基、Age I酶切位点、表达增强序列，正向引物中还含有HIF-1a基因5’端部分序列，正向引物中还含有HIF-1 α基因3’端部分序列，优选引物如下:SEQ N0.1:CAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGGAGGGCGCCGGCSEQ N0.2:TCACCATGGTGGCGACCGGTGTTAACTTGATCCAAAGCTCTG 上述的慢病毒载体和细胞株的制备方法，其中，步骤I所述酶切为Age I限制性内切酶进行酶切。
上述的慢病毒载体和细胞株的制备方法，其中，步骤2所述定向克隆连接采用T4噬菌体DNA连接酶进行连接。
上述的慢病毒载体和细胞株的制备方法，其中，所述慢病毒表达载体选自pGC-FU载体、或pGC-LV载体、或其他分子生物学领域常用慢病毒表达载体，也可以是在宿主中复制和生存的其他慢病毒表达质粒。
上述的慢病毒载体和细胞株的制备方法，其中，所述慢病毒包装系统还包括包装质粒、包膜蛋白质粒。
其中，所述包装质粒含有H`IV病毒的gag基因、pol基因和rev基因；所述包膜蛋白质粒中含有单纯疱疹病毒来源的VSV-G基因。
本发明上述筛选抗肿瘤药物的方法中，所述高效表达HIF-Ια基因的肠癌细胞保藏号为 CGMCC N0.5261。
本发明以细胞株为细胞对象，筛选基于抑制HIF-1a表达的抗肿瘤药物，具有高效、快速、简便、直观的优点，可用于高通量快速筛选以HIF-1 α为靶点的抗肿瘤药物。
图1为丹参酮IIA对高效表达HIF-1 α基因的结直肠癌细胞的增殖抑制作用曲线。
具体实施方式
本发明提供了一种筛选抗肿瘤药物的方法，以高效表达HIF-1 α基因的肠癌细胞为细胞对象，下面通过具体实施例，对本发明筛选抗肿瘤药物的方法进行详细的介绍和描述，以使更好的理解本发明范围，但是下述实施例并不限制本发明范围。
制备高效表达HIF-1a基因的结直肠癌细胞 步骤I含HIF-1 α基因的慢病毒载体的构建包装 参照图1和图7，本发明含HIF-1 α基因的慢病毒载体构建包装方法如下: 步骤1.1 pGC-FU载体的线性化 将pGC-FU载体用Age I限制性内切酶进行酶切，体系如下: 纯化的pGC-FU载体2yL 10倍稀释缓冲液Buffer5 μ L 100倍稀释牛血清白蛋白0.5yL Age I限制性内切酶(浓度IOU/μ L) I μ L H2O41.5μ L总体积50 μ L 反应条件:37°C条件下，酶切反应I小时。
步骤1.2 HIF-1a基因(目的基因)片段的获取 I) PCR扩增目的基因 PCR反应体系如下: Template 试剂(IOng/μ L)IuL Primer ( + )0.4 μ L Primer ( — )0.4 μ L 10倍稀释缓冲液2 μ L MgCl20.5 μ L pfu聚合酶(λ 2 μ L dNTP0.8 μ L ddH2014.7 μ L·总体积20 μ L 其中，正向引物Primer ( +):CAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACC^ TGGAGGGCGCCGGC 其中，CAGGATCCCCGGGT为交换配对碱基，ACCGGT为Age I酶切位点，CGCCACC为表达增强序列，A为目的基因5’端部分序列。
反向引物Primer (―): TCACCATGGTGGCGACCGGTGTTAACU TCCAAAGCTCTG 其中，TCACCATGGTGGCG为交换配对碱基，ACCGGT为Age I酶切位点，GTTAACTT为表达增强序列，似为目的基因3’端部分序列。
PCR反应条件: 940C，30 秒一(94°C，30 秒一55°C，30 秒一72°C，5 分钟)X 30 个循环一72°C，10 分钟一4 C保减。
2)目的基因酶切 将上述PCR产物用Age I限制性内切酶进行酶切，酶切反应体系如下: PCR 产物(IOOng/μ L)5μ L10倍稀释缓冲液5 μ L 100倍稀释牛血清白蛋白0.5yL Age I限制性内切酶(浓度IOU/μ L)I μ L H2O38.5 μ L总体积50 μ L 酶切反应条件:37°C，酶切反应I小时。
步骤1.3慢病毒载体重组质粒的构建 将步骤1.1和步骤1.3中的酶切产物进行连接，连接反应体系如下: pGC-FU 载体酶切产物(IOOng/μ L ) IyL 目的基因酶切产物(100ng/yL)IuL DNA连接酶缓冲液I μ L T4噬菌体DNA连接酶I μ L ddH206 μ L总体积IOyL 反应条件:4°C，连接反应12小时。
经过PCR检测、以及测序检测，本发明上述方法制备得到了含人HIFl-1 α基因的慢病毒重组质粒。
步骤1.4慢病毒载体的包装 本实施例中包装体系采用三质粒表达系统，包括包装质粒、包膜蛋白质�：蜕鲜霾街璧玫降穆《局刈橹柿�。
取冻存的293Τ细胞，复苏传代，加入包装质粒、包膜蛋白质�：蜕鲜霾街柚械玫降穆《局刈樵靥澹沧�293Τ细胞。
收集转染48小时的293Τ细胞上清液，4°C离心除去细胞碎片，用0.45 μ m孔径的过滤器过滤上清液得到粗提液。
粗提液进行离心分离，离心力不超过lOOOg，时间不超过2分钟，_80°C保藏。
步骤2制备高效表达HIF-1a基因的肠癌细胞 步骤2.1细胞复苏 冻存的结直肠癌HTC-116细胞迅速放入37°C环境下解冻，离心分离，置于37°C、5%C02环境下培养。
步骤2.2细胞传代 去除旧培养液，加入D-Hank’ s溶液，洗涤细胞生长面，然后去除该溶液。
加入Iml胰酶消化液，37°C消化，至细胞完全消化。加入完全培养基培养。
步骤3慢病毒感染细胞 HTC-116细胞培养至对数周期，进行胰酶消化，制成细胞悬液(细胞数5 X IO6个)。
将细胞悬液接种于6孔板，37°C、5%C02环境下培养，待细胞融合度达到约30%。加入步骤I中制备的慢病毒载体进行瞬时转染，感染 3天。
本实施例中制备的高效表达HIF-1 α基因的肠癌细胞，保藏号为CGMCC N0.5261。
筛选抗肿瘤药物 以丹参酮IIA为例，将培养于含有10%新生牛血清、100U/ml青霉素、100 μ g/ml链霉素Mycoy’s 5A完全培养基(37°C 5% CO2、饱和湿度)的高效表达HIF-1 a人结直肠癌HCT-116细胞，按I X IO4个细胞/孔在96孔板中接种指数生长期的细胞，每孔100 ii L，共12个复 L。接种6小时后，分别加入不同浓度的丹参酮1从，使其终浓度为2、4、8、16、32、641111101/L0培养24、48、72h后，每孔加入20 y L的WST检测试剂，继续培养4h后于630nm和450nm双波长检测各板培养液的OD值。结果显示(图1)，丹参酮IIA对高效表达HIF-1 a的人结直肠癌HCT_116细胞具有明显的抑制作用，其抑制作用呈时间和剂量依赖关系，说明丹参酮IIA是一种有效地抗肿瘤药物，并且抗肿瘤效果对时间和剂量有依赖关系，4 32 u M浓度范围内对剂量依赖关系尤为明显，上述结果与临床验证结果相一致。通过上 述描述，本领域技术人员能够理解的是，通过实时PCR、WST法、流式细胞术、MTI法或台盼蓝法检测细胞在待测药物存在条件下的存活或生长情况、药物对HIF-1 a蛋白或mRNA表达的影响程度，也能够进行药物的筛选。与现有的药物筛选方法相比，更为直观、快速。以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
权利要求
1.一种筛选抗肿瘤药物的方法，其特征在于，步骤包括:步骤I，培养高效表达HIF-1 α基因的肠癌细胞；步骤2，检测待测药物对所述细胞生长的抑制作用；步骤3，根据待测药物抑制作用的大�。卸洗庖┪锸欠裎捎玫目怪琢鲆┪�。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2中检测方法为MTI法、WST法。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞保藏号为CGMCCN0.5261。
4.一种筛选抗肿瘤药物的方法，其特征在于，步骤包括:步骤I，培养高效表达HIF-1 α基因的肠癌细胞；步骤2，检测待测药物对所述细胞中HIF-1 α蛋白表达的影响；步骤3，根据待测药物影响作用的大�。卸洗庖┪锸欠裎捎玫目怪琢鲆┪�。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤2中所述检测方法为流式细胞术。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述细胞保藏号为CGMCCN0.5261。
7.一种筛选抗肿瘤药物的方法，其特征在于，步骤包括:步骤I，培养高效表达HIF-1 α基因的肠癌细胞；步骤2，检测待测药物对所述细胞中HIF-1 α基因mRNA表达的影响；步骤3，根据待测药物影响作用的大�。卸洗庖┪锸欠裎捎玫目怪琢鲆┪�。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤2中所述检测方法为实时PCR检测。
9.根据权利要求7所述 的方法，其特征在于，所述细胞保藏号为CGMCCN0.5261。
全文摘要
本发明提供了一种以HIF-1α为靶点的抗肿瘤药物的筛选方法，以高效表达HIF-1α基因的肠癌细胞为细胞对象，筛选基于抑制HIF-1α表达的抗肿瘤药物，具有高效、快速、简便、直观的优点，可用于高通量快速筛选以HIF-1α为靶点的抗肿瘤药物。
文档编号G01N33/68GK103146801SQ201110402898
公开日2013年6月12日 申请日期2011年12月7日 优先权日2011年12月7日
发明者李琦, 范忠泽, 周利红, 王炎, 殷佩浩, 慈书俊, 周宁, 李克桑, 秦建民, 陈星竹, 吴琼 申请人:上海市普陀区中心医院
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