专利名称：用质谱技术进行hpv定量的方法
用质谱技术进行HPV定量的方法发明领域
本发明涉及人类乳头瘤病毒(Human Papilloma Virus, HPV)的检测方法，特别是 用质谱进行HPV分型和定量的新方法。
发明背景
人乳头瘤病毒(human papillomavirus，简称HPV)是一种小型、无包膜的DNA病 毒，其具有双链闭环的DNA基因组，大小约为7. 2-81Λ，相对分子量约为5X106。HPV基因组 可分为3个区域非编码的上游调节区；早期开放读码区，包括E6、E7、E1、E2、E4、E5 ；晚期 开放读码区，编码主要衣壳蛋白Ll和小衣壳蛋白L2。根据编码主要衣壳蛋白Ll的开放读 码框(ORF)基因序列的不同，可以对HPV进行分型将Ll区ORF的相似性小于60%的HPV 分为不同的属，相似性在60-70%之间的HPV分为不同的种，相似性在71-89%之间的HPV 则分为不同的型别。目前已鉴定的HPV约有130多型，根据其病毒致病力大�。煞治呶� 型 HPV，如 HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、 HPV59、HPV66、HPV68、HPV73 等，以及低危型 HPV，如 HPV6、HPVl 1、HPV42、HPV43、HPV44 等。 高危型HPV可致宫颈上皮内瘤病变(CN)，多见于高龄妇女，不易自然缓解，与宫颈癌的发生 关系密切。低危型HPV多见于年轻妇女，自然缓解率高。
目前HPV检测技术主要包括第二代杂交捕获技术(HU)，荧光定量PCR、采用基质 辅助激光解吸附/电离飞行时间质谱系统(MALDI-T0F-MS)的质谱检测。其中HC2已成为 临床HPV检测领域的金标准。
第二代杂交捕获技术(HC2)是美国Digene公司发展的、唯一获得FDA批准的可 在临床使用的一种检测HPV DNA的技术。该技术的原理是对抗体捕获信号进行放大和对 化学发光信号进行检测。该方法使用高危型和低危型核糖核酸探针，能检测13种高危型 HPV(HPV 16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59 和 68)，是一种易于操作的液基杂交检 测方法。然而，该方法并不能对HPV进行精确分型，也不能检测多重感染，并且当任何一种 型别的HPV DNA超过阈值时，其检测结果均为阳性。此外，高危型探针还可与其他型别的 HPV(例如HPV 53、66、67和73)发生交叉反应，产生假阳性结果，降低实验特异性。
荧光定量PCR(FQ-PCR)在常规PCR的基础上把基因扩增、分子杂交和光化学融为 一体，使PCR扩增和产物分析的全过程在单管封闭条件下进行，实现了实时动态检测和结 果自动化分析，从根本上解决了扩增产物污染和不能定量的问题。该方法通过探针杂交进 一步提高了 HPV DNA检测的特异性，具有快速、简便、灵敏度高、特异性强等优点，适用于临 床工作和大规模筛查。然而，目前该方法主要针对HPV6、11、16和18感染，易漏诊其他HPV 亚型。同时，与HC2 —样，荧光定量PCR也不能实现对HPV进行精确分型，即不能明确HPV 感染型别。
采用基质辅助激光解吸附/电离飞行时间质谱系统(MALDI-T0F-MS)的质谱检测 可以同时检测HPV型别的一种或几种，并能准确对HPV进行定量，其具有高灵敏度，高特异 性和高通量的特点，且相对于其它的检测方法成本低。然而，目前利用质谱技术定量HPV的 方法主要利用寡核苷酸(oligo)来对HPV DNA样品进行定量，由于oligo价格昂贵、设计复3杂且为一次性使用，因此，该方法在实际生产中的应用受到了很大的限制，无法满足大规模 测序和定量的生产需要。
因此，迫切需要开发成本低，且能够实现HPV分型和定量检测的新方法，以适应我 国现有的大规模测序和定量的生产需要。发明内容
本发明至少部分地基于下述原理根据待检测的HPV型别的碱基序列设计突变质 粒，该突变质�：蠬PV型别特异性DNA片段，并且该DNA片段与该HPV型别的野生型DNA 片段只相异于一个碱基；将该突变质粒作为竞争子与样品混合，并进行采用基质辅助激光 解吸附/电离飞行时间质谱系统(MALDI-T0F-MS)的质谱检测法；根据获得的质谱峰图确定 HPV的型别，并利用质谱分析软件确定各个峰的峰面积数值，从而计算出样品中的HPV与竞 争子的浓度比；根据已知的竞争子的浓度，确定样品中HPV的含量，实现对样品中的HPV进 行定量的目的。
本发明还至少部分地基于下述原理突变质粒与相应HPV型别的野生型DNA片段 只有一个碱基的差异，即，突变质粒与样品之间的差异尽可能�。虼耍槐渲柿Ｓ胙返� 扩增效率基本上相同。基于此，利用质谱检测中的延伸产物峰的峰面积比值，可以根据竞争 子(突变质粒)的浓度来计算出样品中HPV的含量。
因此，在一个方面，本发明提供了对样品中的HPV进行分型和定量的方法，其包括 以下步骤
(1)构建多个HPV型别的每一个型别的野生质粒和突变质粒，其中各HPV型别的野 生质粒分别包含第一 DNA片段，所述第一 DNA片段能够用于进行针对该型别的特异性扩增； 各HPV型别的突变质粒分别包含第二 DNA片段，所述第二 DNA片段与相同型别的野生质粒 的第一 DNA片段仅在延伸碱基所对应的位点上相异；
(2)将不同浓度的各HPV型别的野生质粒与突变质粒混合，并进行质谱检测法，获 得质谱峰图，从而确定各个HPV型别的野生质�：屯槐渲柿５呐ǘ缺扔胫势追逋贾懈髯缘� 延伸产物峰的峰面积比值的相关性；
(3)将待检测的样品与确定浓度的步骤(1)中构建的各突变质粒混合，并进行质 谱检测法，获得质谱峰图；任选地，在进行步骤C3)之前，对待检测的样品进行稀释；
(4)根据步骤C3)获得的质谱峰图确定所述样品的延伸产物峰的分子量大�。� 而对样品中的HPV进行分型；
(5)在确定样品中的HPV型别后，测定样品的延伸产物峰与相应HPV型别的突变质 粒的延伸产物峰的峰面积比值，从而根据步骤( 获得的相关性确定样品中的HPV的浓度， 对样品中的HPV进行定量。
在一个优选实施方案中，待检测的样品优选是宫颈脱落细胞。在一个优选实施 方案中，待分型和定量的 HPV 是 HPV6、HPVl 1、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV39、HPV45、 HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66 和 HPV68 中的一种或几种。
在一个实施方案中，本发明所使用的质谱检测法包括以下步骤
1)用扩增引物PCR扩增DNA，从而获得扩增产物；
2)任选地，除去步骤1)的扩增产物中的dNTP，优选通过使用SAP酶处理所述扩增；
3)以步骤1)或2)中获得的产物为模板，用延伸引物通过单碱基延伸反应获得延 伸产物；
4)任选地，纯化所述延伸产物，优选通过树脂来进行纯化，从而获得纯化产物；和
5)用基质辅助激光解吸附/电离飞行时间质谱系统对步骤3)或4)的产物进行检 测。
在一个优选实施方案中，本发明所使用的扩增引物的核苷酸序列分别如缺失5' 端前10个碱基的SEQ ID NO :1-21所示，优选所述扩增引物在5'端还包含标签序列，更优 选各扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO :1-21所示。
在一个优选实施方案中，本发明所使用的延伸引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO 22-36 所示。
在又一个优选实施方案中，各HPV型别的突变质粒的延伸碱基分别如表2所示。
在另一个方面，本文提供了根据本发明的突变质粒用于对样品中的HPV进行分型 和定量的用途。在一个优选实施方案中，所述样品优选是宫颈脱落细胞。在一个优选实施 方案中，待分型和定量的 HPV 是 HPV6、HPVl 1、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV39、HPV45、 HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66 和 HPV68 中的一种或几种。
在另一个方面，本文提供了根据本发明的突变质粒用于制备试剂盒的用途，所述 试剂盒用于对样品中的HPV进行分型和定量。在一个优选实施方案中，所述样品优选是宫 颈脱落细胞。在一个优选实施方案中，待分型和定量的HPV是HPV6、HPVl 1、HPV16、HPV18、 HPV31、HPV33、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66 和 HPV68 中的一种 或几种。
在另一个方面，本文还提供了 一种试剂盒，其包含根据本发明的突变质粒。在一个 优选实施方案中，本发明的试剂盒还包含根据本发明的野生质�：�/或根据本发明的扩增 弓丨物和/或根据本发明的延伸引物。
特别地，在本发明中，术语“延伸碱基”是指，在单碱基延伸反应中添加至延伸引物 3'端的碱基。
发明的有益效果
与现有技术相比，本发明的技术方案采用基质辅助激光解吸附/电离飞行时间质 谱(MALDI-T0F-MS)系统，利用质粒实现对HPV的定量，其具有以下显著优点
1)使用的试剂耗材相对简单且稳定，不需要荧光染料、特殊的酶等价格昂贵的试 剂；
2)反应可以在微量体系中进行，减少了样品和各种消耗品的使用；
3)利用质谱技术，本发明的技术方案能够实现自动化和高通量检测；
4)本发明的技术方案利用质粒进行定量，与使用oligo进行定量的现有技术相 比，成本大大降低，有利于大规模应用；
5)本发明的技术方案能够对样品进行准确定量，其定量结果与荧光定量PCR结果 完全一致，在低成本的基础上保证了准确性。
下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人 员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图5和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说 将变得显然。
附图概述
图1-4中，横坐标表示各延伸引物和产物的分子量大�。渲凶蟊叩男橄弑硎狙� 伸引物分子量所在位置，右边虚线表示延伸产物分子量所在位置；纵坐标表示信号强度。
图1示意性展示了 HPV 58型野生质粒样品的质谱峰图。图中检测到的HPV的型 别为HPV58型，检测碱基(即延伸碱基)为T，代表的是HPV 58型野生质粒样品的峰。
图2示意性展示了 HPV 58型突变质粒样品的质谱峰图。图中检测到的HPV的型 别为HPV58型，检测碱基为G，代表的是HPV 58型突变质粒样品的峰。
图3示意性展示了 HPV 58型突变质粒与野生质粒混合样品的质谱峰图。图中检 测到的HPV的型别为HPV 58型，检测碱基为G的是HPV58型突变质粒的峰，检测碱基为T 的是HPV 58型野生质粒的峰。
图4示意性展示了 HPV 58型样品加入质粒竞争子(即，HPV 58型突变质粒)后 的质谱峰图。图中检测到的HPV的型别为HPV 58型，检测碱基为G的是质粒竞争子(即， HPV 58型突变质粒)的峰，检测碱基为T的是HPV 58型样品的峰。
具体实施方式
在本发明的实施例中，通过使用本发明的方法，实现了对样品中的HPV进行分型 和定量。特别地，样品中待分型和定量的HPV为HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、 HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66 和 HPV68 中的一种或几种。
实施例1 设计并构建突变质�：鸵吧柿�
在本实施例中，设计并构建了上述各个HPV型别的突变质�：鸵吧柿＃杂糜� 后续的质谱检测中。特别地，下面以HPV58为例，设计并构建了 HPV58的突变质�：鸵吧柿�。
使用表1中的HPV 58扩增引物(不含5'端前10个碱基，这10个碱基为标签序 列)，将HPV58的Ll基因片段扩增出来，并将其克隆入PMD-T载体(Takara PMD-T连接试剂 盒)，然后转化入大肠杆菌DH5ci。转化后的大肠杆菌经蓝白斑筛选以及二次扩大培养后， 用于质粒提取。使用质粒提取试剂盒(AXYGEN)提取并纯化质粒。通过DNA测序对质粒进 行鉴定，从而获得HPV 58野生质粒。通过之前描述的方法(NelsonJH，Hawkins GA,Edlund K等人，A novel and rapid PCR based methodfor genotyping human papilloma viruses in clinical samples [J] · Clin Microbiol, 2000, 38 (2) :688-695)，在 HPV 58 野生质粒的 基础上构建HPV58突变质粒。HPV58野生质粒与HPV58突变质粒仅在延伸碱基所对应的位 点上相异，从而HPV 58野生质粒的延伸碱基与HPV58突变质粒的延伸碱基不同。在本实施 例中，HPV58野生质粒的延伸碱基为T，而HPV58突变质粒的延伸碱基为G。
分别测定HPV58的突变质�：鸵吧柿５腛D值，然后根据摩尔公式lng质粒的 拷贝数 [11^+10-9/^2+33(^(载体分子量+插入片断分子量)]*6. 02*1023计算出Ing质 粒的拷贝数。根据计算出的拷贝数将质粒稀释为以下10个浓度100ng，10ng, lng, IO7, IO6, IO5, IO4, IO3, IO2,10 拷贝 /ul。
将浓度为105，IO4, IO3, IO2,10拷贝/ul的HPV58突变质�：鸵吧柿＝兄势准觳馐笛椋匀范℉PV检测的灵敏度。质谱检测实验的结果显示，HPV58突变质�：鸵吧柿� 的检测灵敏度均为100拷贝/ul (参见图1和2)。图1和2分别显示了 HPV58野生质�：� 突变质粒在质谱峰图中的延伸产物峰(对应的分子量分别为7226. 730和7242. 73)。通过类似的方法，使用表1中的扩增引物和表2中的延伸引物，设计并构建各个 HPV型别的突变质�：鸵吧柿�。表1 针对各个HPV型别的Ll区PCR扩增引物。
权利要求
1.用于对样品中的HPV进行分型和定量的方法，其包括以下步骤(1)构建多个HPV型别的每一个型别的野生质�：屯槐渲柿＃渲懈鱄PV型别的野生 质粒分别包含第一DNA片段，所述第一 DNA片段能够用于进行针对该型别的特异性扩增；各 HPV型别的突变质粒分别包含第二 DNA片段，所述第二 DNA片段与相同型别的野生质粒的第 一 DNA片段仅在延伸碱基所对应的位点上相异；(2)将不同浓度的各HPV型别的野生质粒与突变质粒混合，并进行质谱检测法，获得质 谱峰图，从而确定各个HPV型别的野生质�：屯槐渲柿５呐ǘ缺扔胫势追逋贾懈髯缘难由� 产物峰的峰面积比值的相关性；(3)将待检测的样品与确定浓度的步骤(1)中构建的各突变质粒混合，并进行质谱检 测法，获得质谱峰图；任选地，在进行步骤C3)之前，对待检测的样品进行稀释；(4)根据步骤C3)获得的质谱峰图确定所述样品的延伸产物峰的分子量大�。佣� 样品中的HPV进行分型；(5)在确定样品中的HPV型别后，测定样品的延伸产物峰与相应HPV型别的突变质粒的 延伸产物峰的峰面积比值，从而根据步骤( 获得的相关性确定样品中的HPV的浓度，对样 品中的HPV进行定量；其中，优选所述样品是宫颈脱落细胞，优选待分型和定量的HPV是HPV6、HPV11、HPV16、 HPV18、HPV31、HPV33、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66 和 HPV68 中 的一种或几种；其中，优选所述质谱检测法包括以下步骤1)用扩增引物PCR扩增DNA，从而获得扩增产物；2)任选地，除去步骤1)的扩增产物中的dNTP，优选通过使用SAP酶处理所述扩增产物 来除去dNTP ；3)以步骤1)或2)中获得的产物为模板，用延伸引物通过单碱基延伸反应获得延伸产物；4)任选地，纯化所述延伸产物，优选通过树脂来进行纯化，从而获得纯化产物；和5)用基质辅助激光解吸附/电离飞行时间质谱系统对步骤3)或4)的产物进行检测； 进一步优�。隼┰鲆锏暮塑账嵝蛄蟹直鹑缛笔�5'端前10个碱基的SEQ ID NO1-21所示，优选所述扩增引物在5'端还包含标签序列，更优选各扩增引物的核苷酸序列 分别如SEQ ID NO :1-21所示；优选所述延伸引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO :22-36所 示；优选各HPV型别的突变质粒的所述延伸碱基分别如表2所示。
2.权利要求1中定义的突变质粒用于对样品中的HPV进行分型和定量的用途，优选 所述样品是宫颈脱落细胞，优选待分型和定量的HPV是HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、 HPV33、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66 和 HPV68 中的一种或几种。
3.权利要求1中定义的突变质粒用于制备试剂盒的用途，所述试剂盒用于对样品中 的HPV进行分型和定量，优选所述样品是宫颈脱落细胞，优选待分型和定量的HPV是HPV6、 HPVl 1、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66 和HPV68中的一种或几种。
4.一种试剂盒，其包含权利要求1中定义的突变质粒，优选其还包含权利要求1中定义 的野生质�：�/或权利要求1中定义的扩增引物和/或权利要求1中定义的延伸引物。
全文摘要
本发明提供了一种分型和定量样品中的HPV的新方法，其包括以下步骤设计HPV型别特异性突变质粒和野生质粒；构建数学模型以确定HPV型别特异性突变质粒与野生型质粒的浓度比例与质谱峰图中相应的峰面积比值的相关性；对样品中的HPV进行分型和定量。本发明还提供了用于该方法的试剂盒。
文档编号G01N27/62GK102033099SQ20101052631
公开日2011年4月27日 申请日期2010年10月27日 优先权日2010年10月27日
发明者韦清, 韩颖鑫 申请人:深圳华大基因科技有限公司
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