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专利名称：重组抗原pp65包被酶标反应板的制法及ELISA检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新的生物制剂HCMVpp65重组蛋白，是一种用于检测HCMV-IgM的ELISA检测试剂盒。
背景技术：
人巨细胞病毒(Human Cytomegalovirus，HCMV)属于人类疱疹病毒β亚科病毒，在人群中的感染极为普遍，呈世界性分布。血清流行病学调查表明，40-100％成人有HCMV抗体；不同国家，不同经济状况，不同的人群，不同的年龄段，HCMV感染率不同，其流行无季节性倾向。在亚洲和非洲90％的人口受感染，其中大多数人在青少年时期即有抗体，说明感染年龄较早，而西方国家其感染发生较晚；低经济收入人群较高经济收入人群感染率高。HCMV是人类先天性感染最常见的病原体之一，对孕妇及胎儿影响巨大，常造成流产、死胎、胎儿畸形、发育迟缓及迟发性中枢神经系统缺陷等疾病。先天性感染的婴儿出生时可无症状，但也有严重者可累及多脏器，甚至死亡。有症状者可见肝脾肿大，黄疸，瘀斑或紫癜，脉络膜视网膜炎，小头畸形等。患儿会出现不同程度的听力、视力减退，意识、运动障碍，智力迟钝等。HCMV已经成为损害儿童健康的重要病原体，因此HCMV的检测成为孕妇和新生儿保健的常规项目之一。HCMV感染可引起机体的免疫功能降低，特别是细胞免疫功能下降，引起多种疾病的发生，如肝炎、器官移植失败等。此外，HCMV可经乳汁、宫颈液、血制品、移植的器官或细胞等进行传播。初次感染后，潜伏于骨髓细胞等；当免疫功能受损时，潜伏的病毒易被激活，导致严重的临床症状，尤其是在发育的胎儿、新生儿、免疫抑制或免疫功能低下的人群中，HCMV感染可引起甚至是致死性的临床症状。
鉴于HCMV对人类的危害性较大，发现患者及时采取措施是保障人口素质及提高人类健康水平的关键。我国每年需要作HCMV检测的人群大约至少有一千多万人次。目前市场上HCMV的各种免疫诊断试剂盒质量参差不齐，既无统一的质量标准，又在无序生产与应用，给HCMV的预防和诊治造成严重障碍。目前关于HCMV体外诊断试剂国内外虽上市，但国外产品价格昂贵，不适合我国国情。而国产试剂盒多采用细胞培养的全病毒粗制抗原检测血清中特异性IgM，病毒产量低，所得病毒抗原纯度较低，且其抗原性可能与其它疱疹病毒有交叉，影响检测结果的准确性；这些试剂盒存在稳定性和重复性较差、灵敏度和特异性不高等缺点。另外，调查对比证实，各厂家生产的产品间存在较大的质量差异，其最小检出量可相差15～30倍。国内检测试剂存在质量差异的主要原因可能与生产厂家质量意识淡漠，缺少质控标准有关。

发明内容
本发明的目的提供一种新的HCMVpp65-IgM型ELISA检测试剂盒。
本发明技术方案如下特异性重组抗原pp65包被反应板的制备方法，通过下列步骤制备而成(1)pp65重组蛋白的获得①HCMV pp65的原核表达以HCMV AD169 DNA为模板，用特异性引物PCR扩增pp65(1006-1521nt)目的基因，目的基因克隆于pET-T0P0原核表达载体，转化Top10感受态细菌。根据氨卞青霉素抗性提取克隆，快速提取转化子的质粒DNA，鉴定，得到与目的片断分子量相一致的片断，判为阳性结果。以PCR阳性克隆提取质粒，载体pET100-pp65-DNA测序，结果表明pp65基因编码序列已正确连入pET100，具有一个516bp完整的开放阅读框(ORF)，与GenBank中pp65基因98％的同源性。推算其蛋白质分子量为22.8KD，pI为4.18。
②pp65重组蛋白鉴定将目的基因的重组质粒PET/pp65转化大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导后，菌体蛋白经SDS-PAGE蛋白电泳及考马斯亮蓝染色显示，与空菌相比，在20～30KD有一条浓染的新增蛋白条带。经Western blotting鉴定，能与pp65单克隆抗体发生强阳性反应，pp65重组蛋白具有较强的免疫原性。
③HCMV pp65重组蛋白的大量表达、纯化经过大量诱导，表达，亲和层析纯化后得到大量pp65重组蛋白。
(2)将pp65重组蛋白作为抗原，用pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释成适宜浓度后按100μl/孔包被96孔酶标板，置湿盒中4℃12～24小时，PBST洗板3次，每次3min，然后拍干；得到抗原pp65包被酶标板。
(3)用含10％小牛血清的PBST加满孔(约200μl/孔)，37℃孵育，封闭1h，洗板3次，拍干并密封，即可得到pp65抗原包被酶标反应板。
这种新的HCMVpp65 IgM型ELISA检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒由上述特异性重组抗原pp65包被板、标本稀释液、洗涤液、酶标二抗、显色液、终止液构成。具体分为(1)标本稀释液含10％小牛血清和2％抗人IgG的0.01M pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)；(2)洗涤液含有0.05％Tween 20的磷酸盐缓冲液(PBST)；(3)酶标二抗辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgM单抗；(4)显色液TMB-H2O2尿素溶液；(4)终止液2mol/L H2SO4溶液。
HCMVpp65是参与HCMV病毒基因表达调控，改变宿主细胞代谢，有利于病毒复制的重要蛋白质；pp65蛋白作为HCMV主要被膜磷蛋白，不仅是病毒血症中的主要蛋白抗原，而且是HCMV特异性CTL的最主要靶分子；其既能诱导特异性抗体产生，亦能诱导机体的细胞免疫应答；是Th细胞及T记忆细胞的主要识别及作用抗原。鉴于pp65具有这些重要的功能及良好的抗原性，本发明选取了编码HCMV pp65蛋白的部分序列基因(1006～1521nt)，采用基因重组技术，原核表达，亲和层析后获得一种新的pp65重组蛋白。经过改造过的pp65重组蛋白既保留了其抗原性，又提高了pp65重组蛋白的原核表达量。采用该重组蛋白，本发明成功地用间接ELISA法，方便快速地检出特异性HCMV-IgM，并将该结果与美国BioCheck试剂盒相比较，一致性为97.0％。
本发明试剂盒的检测结果与国产的全病毒--ELISA法及美国BioCheck试剂盒的检测阳性率分别是本法为44％；全病毒--ELISA法50％；美国BioCheck试剂盒45％。特异性本法为98.2％，高于全病毒--ELISA法90.9％，正确指数是92.8％，且与美国BioCheck法有较高一致性，为97.0％。
本发明试剂盒选取HCMV抗原性较强的pp65蛋白的部分序列，通过分析，选择其中的抗原表位和亲水性区域，采用基因重组技术，原核表达，亲和层析后获得一种新的pp65重组蛋白，该抗原不仅具有高特异性，且具有高纯度和高稳定性，在提取纯化后，包板作为试剂盒中的重要组分。与全病毒抗原相比，该重组抗原可规模化、标准化生产，更安全、经济。
具体实施例方式
1、试剂(1)包被液(0.05mol/l，pH9.6的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液)Na2CO31.5g，NaHCO32.9g，Na2N30.2g，加双蒸水至1000ml，调至pH9.6。
(2)标本稀释液(含10％小牛血清和2％抗人IgG的0.01M PBS pH7.4)NaCl 8.0g、KH2PO40.2g、Na2HPO4·12H2O 2.9g、KCl 0.2g，硫柳汞0.1g，加双蒸水至1000ml，调至pH7.4，为PBS。
(3)封闭液(10％小牛血清/PBS溶液)小牛血清100ml，1×PBS(pH7.4)900ml。
(4)洗涤液(PBST，pH7.4)NaCl 8.0g、KH2PO40.2g、Na2HPO4·12H2O 2.9g、KCl 0.2g、Tween 20 0.5ml、硫柳汞0.1g、加双蒸水至1000ml，调至pH7.4。
(5)酶标二抗(HRP*鼠抗人IgM单抗)辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgM单抗，由本室自行生产。
(6)底物液(TMB-H2O2尿素溶液)①底物液A(3、3‘、5、5‘-四甲基联苯胺，TMB)TMB200mg，无水乙醇100ml，加双蒸水至1000ml。
②底物液B缓冲液(0.1mol/L柠檬酸-0.2mol/L磷酸氢二钠缓冲液，pH5.0～5.4)Na2HPO414.60g，柠檬酸9.33g，0.75％过氧化氢尿素6.4ml，加双蒸水至1000ml，调至pH5.0～5.4。
③将底物液A和B按1∶1混合，即成TMB-H2O2尿素应用液。
(7)终止液(2mol/L H2SO4溶液)双蒸水600ml，浓硫酸100ml(缓慢滴加并不断搅拌)，加双蒸水至900ml。
2、主要仪器(1)酶标仪BIO-RAD Model 550(2)ELISA反应板Corning Incorporated costar R 96 Well EIA/RIA plate3、方法酶标二抗最适滴度的选择(1)用100ng/ml人IgM进行包被，洗涤。
(2)将酶标抗人IgM单抗用稀释液作一系列稀释后分别加入已包被的孔中，保温、洗涤。
(3)加底物显色。加酸终止反应后，读取吸光度(A)，取A值在1.0时的酶标抗体稀释度，作为酶标二抗的最适滴度为1∶1000。
棋盘滴定法选择包被抗原最适滴度(1)用包被液将抗原作一系列稀释后进行包被，洗涤。
(2)将强阳性参考血清、弱阳性参考血清和阴性参考血清用稀释液按10倍递增系列稀释，加样，保温，洗涤。
(3)加按最适滴度稀释的酶标抗人IgM单抗，保温，洗涤。
(4)加底物显色，加酸终止反应后读取A值。
(5)选择强阳性参考血清的A值为0.8～1.0间、阴性参考血清的A值小于0.1的包被抗原的稀释度作为最适滴度为20～40μg/孔。
特异性重组抗原pp65包被反应板的制备方法(1)将pp65蛋白质抗原用pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释后包被96孔板，100μl/孔，置湿盒中4℃ 12～24小时，PBST洗板3次，每次3min，然后拍干；得到酶标板。
(2)用含10％小牛血清的PBS加满孔，37℃孵育，封闭1h，洗板3次后密封。该板即可得到抗原pp65包被酶标反应板。
试剂盒的构成所述试剂盒由特异性重组抗原pp65包被酶标反应板、标本稀释液、洗涤液、显色液、终止液构成，具体组分为(1)标本稀释液含10％小牛血清和2％抗人IgG的0.01M PBS(pH7.4)；(2)酶标二抗辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgM单抗；(3)显色液TMB-H2O2系统；(4)终止液2mol/L H2SO4。
利用上述试剂盒采用ELISA法检测血清中HCMV IgM(1)待检血清，加入1∶100稀释的待检血清到包被好的酶标反应板，100μl/孔，37℃孵育1h，洗板3次；(2)加酶标物，加入HRP(辣根过氧化酶)标记的鼠抗人IgM单抗，100μl/孔，37℃孵育40min，(3)显色，洗板后每孔加入TMB-H2O2系统底物100μl，37℃或室温避光显色15分钟；(4)每孔加入2mol/L H2SO450μl，终止反应；(5)结果判断，空白孔调零，读取450nm波长处吸光度，即OD 450值。
(6)计算结果，将待检标本血清平均OD值(P)除以阴性血清平均OD值(N)，求得P/N值，P/N≥2.1为阳性，P/N＜2.1为阴性。
权利要求
1.重组抗原pp65包被酶标反应板的制法，通过下列步骤制备而成(1)、以HCMV AD169 DNA为模板，扩增UL1006-1521nt基因，与克隆表达试剂TOPO-pET连接，转化BL21(DE3)StarTM，表达大量纯化pp65蛋白；(2)、将pp65蛋白抗原用pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释后包被96孔板，100μl/孔，置湿盒中4℃ 12～24小时，PBST洗板3次，每次3min，然后拍干；(3)、用含10％小牛血清的PBS加满孔，37℃孵育，封闭1h，洗板3次后密封；该板即为pp65抗原pp65包被酶标反应板，可用于HCMV pp65-IgM的特异性检测用。
2.应用重组抗原pp65包被酶标反应板的ELISA检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒由特异性重组抗原pp65包被反应板、标本稀释液、洗涤液、显色液、终止液构成，具体组份为(1)、标本稀释液含10％小牛血清和2％抗人IgG的0.01M PBS(pH7.4)；(2)酶标二抗HRP*鼠抗人IgM单抗；(3)、显色液TMB-H2O2系统(4)、终止液2mol/LH2SO4溶液。
全文摘要
本发明涉及一种新的重组抗原pp65包被酶标反应板的制法及ELISA检测试剂盒，其关键技术之处主要在于，用基因工程方法制备特异性重组抗原——HCMV pp65。该抗原在提取纯化后，包板作为试剂盒中的重要组成，另外，通过鼠—鼠杂交瘤技术制备的抗人IgM单克隆抗体，单克隆抗体经辣根过氧化物酶标记后即可用于试剂盒的组装。建立敏感快速的ELISA抗体捕获血清中HCMV特异性IgM抗体的方法，具有高特异性，高稳定性。试剂盒主要供实验室研究和临床诊断使用。
文档编号G01N33/543GK1651918SQ20051003766
公开日2005年8月10日 申请日期2005年1月8日 优先权日2005年1月8日
发明者王明丽 申请人:王明丽