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专利名称：一种快速检测血红蛋白的生物传感器及其测试方法
技术领域：
本发明涉及生化检测技术领域，是一种用于快速检测血红蛋白的生物传感器及其测试方法，通过便携式生化检测仪和生物传感器检测血红蛋白，可以快速获得测试样品中血红蛋白的浓度大小。
背景技术：
血红蛋白俗称血红素，是红细胞中一种含铁的蛋白质，是氧运转环节的核心物质，其主要功能是运输氧和二氧化碳，并对酸性物质起缓冲作用，参与体内的酸碱平衡调节。
一般人体中所含血红蛋白浓度的正常范围是110～160g/L，其中男性含量为120～160g/L，女性为110～150g/L。测定血液试样中的血红蛋白浓度，对于如贫血症等的临床诊断及其采血质量评定是非常重要的。因此，需要一种用于快速测定血红蛋白浓度的传感器及其测试方法。
血红蛋白的测试方法，通常是氰化高铁血红蛋白法，它是通过含铁氰化钾和氰基的溶剂的作用，将血红蛋白转化为氰化高铁血红蛋白，测定540nm附近的吸光度的方法。还有一种常用方法是将血红蛋白转化为氧合血红蛋白，同样测定吸光度的氧合血红蛋白法。这两种方法都需要具有昂贵的分析仪器和复杂的样品制备。因此，一种能简单、快速、精确的测定血红蛋白的生物传感器及其测试方法，就成了急需解决的课题。

发明内容
本发明的一个目的，是要提供一种简单、快速的能用于测定血红蛋白的生物传感器。所提供的血红蛋白生物传感器为一次性使用，它避免交叉感染，且重复性好，不需处理测试样品，制作简单，能批量生产，可以降低成本。
本发明的另一个目的是提供一种测试方法，利用便携式生化检测仪，配合本发明的生物传感器进行血红蛋白浓度的快速检测。这种测试方法不需专业技术人员操作，同时由于便携式生化检测仪小型、便携、价廉，可以应用于临床医学、采血站、采浆站、家庭个人等。
为达到上述目的，本发明的技术解决方案是提供一种快速检测血红蛋白的生物传感器，包括基础电极、绝缘层和封装层，其基础电极包括绝缘性基材，工作电极和假参比电极，基材上表面有沿长度方向上互相平行的两电极一个工作电极和一个假参比电极，在两电极上面，固接有绝缘层，绝缘层中有一槽，为反应沟道，绝缘层上表面固覆有封装层，封装层将反应沟道覆盖；在反应沟道底面有一层修饰层，修饰层上面固接有敏感膜；反应沟道与封装层的内表面构成一进样通道。
所述的快速检测血红蛋白的生物传感器，其所述绝缘性基材，是由聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚酯、聚碳酸酯、聚乙烯、聚丙烯、聚乙烯对苯二甲酸酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯和丙烯晴-丁二烯-苯乙烯中任选一种的聚合物制成。
所述的快速检测血红蛋白的生物传感器，其所述工作电极和假参比电极，由两层结构组成，下层是由铬、钛、镍和镍铬金属中任选一种制成的过渡层，上层是由金、银、铂和钯贵金属中任选一种制成。
所述的快速检测血红蛋白的生物传感器，其所述敏感膜，是由敏感材料制成，敏感材料是由亲水性高分子、电子媒介体、表面活性剂、稳定剂、缓冲液组成；其中，亲水性高分子是由从羧甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羧乙基甲基纤维素、聚乙烯醇、明胶及其衍生物、丙烯酸及其盐、甲基丙烯酸及其盐的聚合物中任选择一种制成，其量为0.2～2wt％，优选为0.5wt％；电子媒介体是由亚甲基蓝、甲苯鞍蓝、甲酚固紫、铁氰酸盐、二茂铁及其衍生物、对笨醌、吩嗪硫酸甲酯、靛酚及其衍生物和β-萘醌-4-磺酸钾中任选一种制成，优选为亚甲基蓝，其量为0.1~10mM，优选为0.5~2mM；或铁氰酸盐，其量为20～500mM，优选为50~200mM；表面活性剂是从曲拉通X-100、二乙醇酰胺、烷基醇酰胺磷酯盐、醇醚羧酸盐、单烷基磷酸酯、十二烷基磺酸钠和烷基酚聚氧乙烯醚中任选一种制成，其量为0.02~3wt％，优选为0.05~0.5wt％；稳定剂是从琥珀酸钠、柠檬酸三钠、牛血清白蛋白、海藻糖、甲壳素、丝素蛋白中任选一种制成，其量为1~50mM，优选为1~10mM；溶解上述试剂的缓冲液是由磷酸盐缓冲液、柠檬酸缓冲液、乙酸缓冲液、Tris盐酸缓冲液中任选一种制成，其PH优选值为7.4。
所述的快速检测血红蛋白的生物传感器，其所述基材，厚度在0.1~1mm之间，优选为0.2～0.6mm；绝缘层和封装层厚度不同，两者厚度在0.1～0.5mm之间，优选为0.2～0.4mm。
所述的快速检测血红蛋白的生物传感器，其所述修饰层和敏感膜，其制作方法为首先在电极表面反应沟道内修饰一层具有亲水作用的亲水性高分子溶液，将其置于电热鼓风干燥箱内干燥，形成表面修饰层，取出；在修饰层上滴加含有电子媒介体的反应液，再将其置于电热鼓风干燥箱内干燥形成敏感膜，取出，备用。
一种快速检测血红蛋白的测试方法，其所用设备包括快速检测血红蛋白的生物传感器和便携式生化检测仪，其中，生化检测仪的面板上设有电源键、菜单键、试条插槽和液晶显示屏；先将检测仪与传感器的工作电极和假参比电极电连接，使电压加在两个电极上，再测量由于试剂与测试样品之间的生化反应所产生的电流，来确定样品中血红蛋白的浓度值。
所述的测试方法，其首先打开电源键开机，按菜单键翻阅测量信息，当菜单键设置在测血红蛋白时，根据液晶显示屏提示进行操作；当提示插入试条时，将血红蛋白生物传感器的电极引线一端插入检测仪的试条插槽中，插入后与试条电连通，液晶显示屏显示进入提示滴样状态，滴样后，液晶显示屏立即显示进入倒计时测试状态，测试结束后，在液晶显示屏上显示所测样品中血红蛋白的浓度值。


图1是血红蛋白生物传感器的分解立体图；图2是血红蛋白生物传感器的垂直剖视图；图3是不同浓度血红蛋白的循环伏安曲线，其中亚甲基蓝为电子媒介体；图4是不同浓度血红蛋白的电流响应曲线，其中铁氰酸钾为电子媒介体；图5是检测血红蛋白生物传感器的线性相关曲线，铁氰酸钾为电子媒介体；图6是血红蛋白生物传感器测试示意图；图7是便携式生化检测仪外观图。
具体实施例方式
根据本发明的一个实施例，提供了一种制作血红蛋白生物传感器的方法。
请参阅图1、图2，该血红蛋白生物传感器a包括基础电极、敏感膜9、绝缘层4、封装层5。基础电极包括绝缘性基材1，工作电极2和假参比电极3。电极2、3采用贵金属，通过溅射法形成，这种方法简单，能在很大程度上提高传感器a的性能，可以批量生产，其电极2、3的制作详细说明可以参照已申请专利，专利号为200410030214.X，在此不再赘述。
绝缘性基材1是由从聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚酯、聚碳酸酯、聚乙烯、聚丙烯、聚乙烯对苯二甲酸酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯和丙烯晴-丁二烯-苯乙烯等中选择出来的一种聚合物制成，其厚度在0.1~1mm之间，优选0.2～0.6mm，绝缘层4和封装层5与绝缘基材1是同种材料，厚度不同，其厚度在0.1～0.5mm之间，优选0.2～0.4mm。
工作电极2和假参比电极3是由同种材料的贵金属形成，电极2、3由两层结构组成，包括从铬、钛、镍和镍铬等金属中选出来的一种制成的过渡层和从金、银、铂和钯等贵金属中选出来的一种制成的上层。电极2、3的形状参照已申请专利，申请号为02160271.9，它可以采用圆形、方形、条形等各种形状的电极。电极系统可以是两电极的，即工作电极、假参比电极(共用对电极和参比电极)，也可以是三电极的，即工作电极、对电极和参比电极。
该血红蛋白生物传感器a中，所述的敏感膜9为敏感材料制作。敏感材料是由亲水性高分子、电子媒介体、表面活性剂、稳定剂、缓冲液组成，实施例中提供了两种敏感材料。首先在电极2、3表面反应沟道7内修饰一层具有亲水作用的亲水性高分子，将其置于电热鼓风干燥箱内干燥，形成表面修饰层8，取出；在修饰层8上滴加含有电子媒介体等的反应液，再将其置于电热鼓风干燥箱内干燥形成敏感膜9，取出，保存备用。测试时采用标准的血红蛋白溶液，获得了不同的电流响应曲线及其相关结果。
亲水性高分子是从羧甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羧乙基甲基纤维素、聚乙烯醇、明胶及其衍生物、丙烯酸极其盐、甲基丙烯酸极其盐的聚合物等中选择出来的一种组成，亲水性高分子的量为0~2wt％，实施例中优选为0.5wt％。
电子媒介体是由亚甲基蓝、甲苯鞍蓝、甲酚固紫、铁氰酸盐、二茂铁及其衍生物、对笨醌、吩嗪硫酸甲酯、靛酚及其衍生物和β-萘醌-4-磺酸钾等中选择出的一种，实施例中分别采用了亚甲基蓝和铁氰酸盐作为电子媒介体制成了两种敏感材料，其中亚甲基蓝的量为0.1~10mM，优选0.5~2mM，实施例中优选为1mM；铁氰酸盐的量为20~500mM，优选50~200mM，实施例中优选为100mM。
表面活性剂，它是从曲拉通X-100、二乙醇酰胺、烷基醇酰胺磷酯盐、醇醚羧酸盐、单烷基磷酸酯、十二烷基磺酸钠和烷基酚聚氧乙烯醚等中选择出的一种，表面活性剂的量为0~3wt％，优选0.05~0.5wt％，实施例中优选为0.1wt％。
保持酶活性的稳定剂，它是由从琥珀酸钠、柠檬酸三钠、牛血清白蛋白、海藻糖、甲壳素、丝素蛋白等中选择出的一种，其量为1~50mM，优选1～10mM，实施例中优选为3.4mM。
溶解酶和电子媒介体的溶剂，它可以使用水、磷酸盐缓冲液、柠檬酸缓冲液、乙酸缓冲液、Tris盐酸缓冲液等各种缓冲液，目的是用来保持恒定的PH值，实施例中优选PH值为7.4。
根据本发明的另一实施例，提供了一种利用便携式生化检测仪快速检测血红蛋白的测试方法，在血红蛋白生物传感器系统中，它包括血红蛋白生物传感器和用于显示测试样品中的血红蛋白浓度的检测仪，所述检测仪与传感器的工作电极和假参比电极连接，将工作电压加在两个电极上，测量由于试剂与测试样品之间的反应所产生的电流，来判断血红蛋白的浓度。
实施例1血红蛋白生物传感器a的基本构成如图1所示，为传感器a的分解立体图，它包括绝缘基材1，基材1上表面有沿长度方向上互相平行的两电极一个工作电极2和一个假参比电极3，在两电极上面，固接有和绝缘基材1同种材料的绝缘层4，绝缘层4中有一槽，为反应沟道7，绝缘层4上表面固覆有封装层5，封装层5将反应沟道7覆盖。再如图2所示，是血红蛋白传感器a的垂直剖视图。在反应沟道7底面有一层修饰层8，修饰层8上面固接有敏感膜9；反应沟道7与封装层5的内表面构成一进样通道10。
敏感膜9由敏感材料制成。敏感材料的制作步骤如下取尚未封装封装层5的血红蛋白生物传感器a半成品，首先对反应沟道7底面曝露的电极2、3表面进行活化处理，表面活化技术参照已申请专利，申请号为02154524.3，在此不加赘述，然后滴加0.5wt％的羧甲基纤维素(以下简称CMC)的水溶液7μl到反应沟道7底面，再将其置于37℃的鼓风干燥箱中干燥20分钟，取出，形成CMC修饰层8。经过CMC修饰的电极2、3具有很好的亲水效果，在利用毛细作用力加入测试样品时，测试样品能够快速与敏感膜9接触进行反应。取经过表面修饰的传感器a半成品，滴加含有电子媒介体的敏感材料4μl到修饰层8上，同样将其置于37℃的鼓风干燥箱中干燥20分钟，形成敏感膜9，取出保存备用。其中敏感材料除电子媒介体外，还包括表面活性剂，其含量为0.1wt％；稳定剂，其含量为3.4mM；调节pH值的缓冲液，pH值为7.4。不同电子媒介体其含量不同，这里提供了两种电子媒介体作为优选实施例。
1)用亚甲基蓝为电子媒介体时，浓度含量为1mM，用其做基相溶液测得的不同浓度血红蛋白的循环伏安曲线如图3，I、II、III、IV分别代表0μM、50μM、100μM、200μM的血红蛋白的循环伏安曲线。反应原理为
2)用铁氰酸钾做为电子媒介体时，其浓度含量为100mM，用其做基相溶液测得的不同浓度血红蛋白的循环伏安曲线如图4，其中1、2、3、4、5分别代表0μM、500μM、1000μM、2000μM、3000μM血红蛋白的电流响应曲线。这种传感器具有很好的线性相关性(如图5)和重复性，分别能达到0.995和2.3％，反应可以在60秒内达到稳态，适合临床医学、采血站、采浆站、家庭个人等的快速检测。
反应原理为
最后，用封装层5在绝缘层4上面进行封装，完成血红蛋白生物传感器a的制作。测试样品通过毛细作用力从传感器a侧边供给进样通道10，样品迅速铺满整个反应区，测试样品中的血红蛋白与敏感膜9接触，进行反应，产生与血红蛋白浓度相对应的电流，为了获得实验响应曲线，采用电化学工作站进行检测(实际临床应用中使用实施例2所述测试方法)，电化学工作站的工作电极与传感器a的工作电极2相连，电化学工作站的参比电极和对电极短接，然后与传感器a的假参比电极3相连，为测试系统加一工作电压，根据所产生的电流输出信号来检测血红蛋白浓度的大小。
实施例2如图6所示，是用便携式生化检测仪b连接血红蛋白生物传感器a进行测试的方法示意图，固定有敏感膜9的传感器a与便携式生化检测仪b相连接，其中，见图7，生化检测仪b的面板上设有电源键14、菜单键13、试条插槽11和液晶显示屏12；电极引线6与便携式生化检测仪b结合时，其具体操作如下首先打开电源键14开机，按菜单键13可以翻阅测量信息，当菜单键13设置在测血红蛋白时，根据液晶显示屏12提示进行操作。当提示插入试条时，将血红蛋白生物传感器a的电极引线6一端插入检测仪b的试条插槽11中，插入后试条电连通，液晶显示屏12显示进入提示滴样状态，滴样后，液晶显示屏12立即显示进入倒计时测试状态，测试结束后，在液晶显示屏12上显示所测样品中血红蛋白的浓度值。
以上发明公开了本发明的若干种方法和材料。而参照附图可以很好地理解本发明的优选实施例。优选实施例只是为了说明的目的，而不是对本发明的限制。在上述说明的基础上可以对本发明作许多改进和改变。因此，在所附权利要求书的范围内，本发明可以有不是上述的其他实现方式。比如，采用三电极系统，用贵金属铂做电极材料，直接固定敏感材料等的方法。
权利要求
1.一种快速检测血红蛋白的生物传感器，包括基础电极、绝缘层和封装层，其特征在于基础电极包括绝缘性基材，工作电极和假参比电极，基材上表面有沿长度方向上互相平行的两电极一个工作电极和一个假参比电极，在两电极上面，固接有绝缘层，绝缘层中有一槽，为反应沟道，绝缘层上表面固覆有封装层，封装层将反应沟道覆盖；在反应沟道底面有一层修饰层，修饰层上面固接有敏感膜；反应沟道与封装层的内表面构成一进样通道。
2.如权利要求1所述的快速检测血红蛋白的生物传感器，其特征在于所述绝缘性基材，是由聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚酯、聚碳酸酯、聚乙烯、聚丙烯、聚乙烯对苯二甲酸酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯和丙烯晴-丁二烯-苯乙烯中任选一种的聚合物制成。
3.如权利要求1所述的快速检测血红蛋白的生物传感器，其特征在于所述工作电极和假参比电极，由两层结构组成，下层是由铬、钛、镍和镍铬金属中任选一种制成的过渡层，上层是由金、银、铂和钯贵金属中任选一种制成。
4.如权利要求1所述的快速检测血红蛋白的生物传感器，其特征在于所述敏感膜，是由敏感材料制成，敏感材料是由亲水性高分子、电子媒介体、表面活性剂、稳定剂、缓冲液组成；其中，亲水性高分子是由从羧甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羧乙基甲基纤维素、聚乙烯醇、明胶及其衍生物、丙烯酸及其盐、甲基丙烯酸及其盐的聚合物中任选择一种制成，其量为0.2～2wt％；电子媒介体是由亚甲基蓝、甲苯鞍蓝、甲酚固紫、铁氰酸盐、二茂铁及其衍生物、对笨醌、吩嗪硫酸甲酯、靛酚及其衍生物和β-萘醌-4-磺酸钾中任选一种制成，优选为亚甲基蓝，其量为0.1~10mM，优选为0.5~2mM；或铁氰酸盐，其量为20～500mM；表面活性剂是从曲拉通X-100、二乙醇酰胺、烷基醇酰胺磷酯盐、醇醚羧酸盐、单烷基磷酸酯、十二烷基磺酸钠和烷基酚聚氧乙烯醚中任选一种制成，其量为0.02~3wt％；稳定剂是从琥珀酸钠、柠檬酸三钠、牛血清白蛋白、海藻糖、甲壳素、丝素蛋白中任选一种制成，其量为1~50mM；溶解上述试剂的缓冲液是由磷酸盐缓冲液、柠檬酸缓冲液、乙酸缓冲液、Tris盐酸缓冲液中任选一种制成，其PH优选值为7.4。
5.如权利要求1所述的快速检测血红蛋白的生物传感器，其特征在于所述基材，其厚度在0.1～1mm之间；绝缘层和封装层厚度不同，两者厚度在0.1～0.5mm之间。
6.如权利要求1所述的快速检测血红蛋白的生物传感器，其特征在于所述修饰层和敏感膜，其制作方法为首先在电极表面反应沟道内修饰一层具有亲水作用的亲水性高分子溶液，将其置于电热鼓风干燥箱内干燥，形成表面修饰层，取出；在修饰层上滴加含有电子媒介体的反应液，再将其置于电热鼓风干燥箱内干燥形成敏感膜，取出，备用。
7.一种快速检测血红蛋白的测试方法，其特征在于所用设备包括快速检测血红蛋白的生物传感器和便携式生化检测仪，其中，生化检测仪的面板上设有电源键、菜单键、试条插槽和液晶显示屏；先将检测仪与传感器的工作电极和假参比电极电连接，使电压加在两个电极上，再测量由于试剂与测试样品之间的生化反应所产生的电流，来确定样品中血红蛋白的浓度值。
8.如权利要求7所述的测试方法，其特征在于首先打开电源键开机，按菜单键翻阅测量信息，当菜单键设置在测血红蛋白时，根据液晶显示屏提示进行操作；当提示插入试条时，将血红蛋白生物传感器的电极引线一端插入检测仪的试条插槽中，插入后与试条电连通，液晶显示屏显示进入提示滴样状态，滴样后，液晶显示屏立即显示进入倒计时测试状态，测试结束后，在液晶显示屏上显示所测样品中血红蛋白的浓度值。
全文摘要
本发明一种用于快速检测血红蛋白的生物传感器及其测试方法，涉及生化检测技术领域。包括血红蛋白生物传感器和用于检测血红蛋白的便携式生化检测仪；其中血红蛋白生物传感器包括基础电极、敏感膜、绝缘层、封装层，即在绝缘性基材上利用微机械加工技术形成的工作电极和假参比电极，覆盖绝缘层制作电极沟道，电极经过表面活化技术处理后，滴加亲水性高分子溶液形成亲水性高分子层，再将敏感材料固定在亲水性高分子层上形成敏感膜层，再用封装层对传感器进行封装。当含有被分析物血红蛋白的测试样品从侧面加入进样通道后，测试样品与敏感膜接触发生反应，用便携式生化检测仪可快速检测到由于敏感膜与血红蛋白之间的反应产生的电流输出信号。
文档编号G01N27/413GK1710418SQ20041004830
公开日2005年12月21日 申请日期2004年6月17日 优先权日2004年6月17日
发明者姜利英, 蔡新霞, 刘春秀, 罗贤波, 李华清 申请人:中国科学院电子学研究所