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专利名称：一种复方氨基酸(15)双肽(2)注射液的分析方法
技术领域：
本发明涉及氨基酸的高效液相色谱分析方法，尤其涉及一种复方氨基酸(15)双肽
(2)注射液的高效液相色谱分析方法。
背景技术：
由于氨基酸分析在生命科学、食品科学和临床医学等领域研究中的重要作用，因此，对氨基酸分析方法的研究与改进将会继续得到人们的重视。目前对氨基酸的分析方法主要有柱后衍生高效阳离子交换色谱法、高效阴离子交换色谱一积分脉冲安培检测法及柱前衍生反相高效液相色谱法。柱后衍生高效阳离子交换色谱法是利用氨基酸在酸性条件下形成阳离子而在阳离子交换柱中分离，分离后的氨基酸用茚三酮衍生、紫外可见光度检测器检测，此技术商品化形式氨基酸分析仪已在20世纪60年代初问世。这类仪器和装置的缺点是设备操作复杂，价格昂贵且应用范围比较单一，不能同时分离多种复合氨基酸，分析时间长。高效阴离子交换色谱一积分脉冲安培检测法是基于氨基酸分子中的羧基在强碱性介质中可以形成阴离子，而氨基酸分子中的氨基在强碱性介质中通过施加一定的电位，可在贵金属电极表面发生氧化反应，从而实现氨基酸的阴离子交换色谱分离和积分脉冲检测的一项技术。此技术所采用的积分脉冲安培检测器稳定性差，且分析时间较长。柱前衍生反相高效液相色谱法是首先将氨基酸与衍生化试剂进行反应，然后在反相色谱体系下分离分析衍生化产物的一项技术。此技术分离度高、选择性好及灵敏快速，且与局限于氨基酸分析的自动分析仪不同，高效液相色谱仪的适用性极广。复方氨基酸(15)双肽(2)注射液为15种氨基酸和2种二肽组成的灭菌水溶液，处方为每IOOOml含有L-丙氨酸(C3H7NO2) 16. 00g, L-精氨酸(C6H14N4O2) 11. 30g, L-天冬氨酸(C4H7NO4)3. 40g，L-谷氨酸(C5H9N04)5 . 60g，L-组氨酸(C6H9N3O2)6. 80g，L-异亮氨酸(C6H13NO2)5. 60g，L-亮氨酸(C6H13NO2 )7. 90g，L-赖氨酸醋酸盐(C6H14N2O2 -C2H4O2 )12. 70g，L_ 蛋氨酸(C5H11NO2S)5. 60g，L-苯丙氨酸(C9H11NO2) 5. 85g，L-脯氨酸(C5H9NO2) 6. 80g，L_ 丝氨酸(C3H7NO3) 4. 50g，L-苏氨酸(C4H9NO3) 5. 60g, L-色氨酸(C11H12N2O2) I. 90g, L-缬氨酸(C5H11NO2) 7. 30g 甘氨酰-谷氨酰胺.H2O (C7H13N3O4-H2O) 30. 27g，甘氨酰-酪氨酸*2H20 3. 45g，(相当于甘氨酸0. 94g;酪氨酸 2. 28g)。该产品含18种人体必须或非必须氨基酸组成的肠外营养注射剂，根据患者肠外营养的需要提供相应的氨基酸，其中甘氨酸、谷氨酰胺、酪氨酸三种氨基酸以甘氨酰-谷氨酰胺、甘氨酰-酪氨酸的双肽形式存在。两种双肽(甘氨酰-谷氨酰胺、甘氨酰-酪氨酸)用于提供谷氨酰胺和酪氨酸以促进蛋白质的合成，在体内直接完全分解为甘氨酸、谷氨酰胺、酪氨酸三种游离氨基酸。由于复方氨基酸(15)双肽(2)注射液中成分复杂，对其各组分进行定量分析较为困难，目前还没有文献报道能够完成该产品中各组分的含量的分析检测。叶晓林等人在《复方氨基酸(15)双肽(2)注射液中两组分的含量测定》(中国药业，2008年07期)中报道了用反相高效液相色谱法测定复方氨基酸(15)双肽(2)注射液中两种二肽，即甘氨酰-谷氨酰胺(GQ)和甘氨酰-酪氨酸(GY)的含量，该文献公开的方法，使用乙腈与0. 05mol/L的磷酸二氢钠溶液(用磷酸调节PH值至2. 2)作为流动相，采用了梯度淋洗法，并且还采用了 FDNB(2，4-二硝基氟苯)进行了柱前衍生化处理，该方法检测方法复杂，操作步骤多，而且不能同时检测出十五种氨基酸的含量。陆明等人在《药物分析杂志》，2011年05期中报道先用强酸型离子交换树脂处理样品，除去复方氨基酸(15)双肽(2)注射液中左旋氨基酸和双肽，再用高效液相色谱法同时测定焦谷氨酸和环(甘氨酰-谷氨酰胺)2种杂质的含量，但是未涉及主药的含量测定。

发明内容
为了填补上述技术上的空白，我们提供了一种专门用于检测复方氨基酸(15)双肽
(2)注射液中十五种氨基酸及两种双肽的柱前衍生反相高效液相色谱法。以异硫氰酸苯酯作为柱前衍生试剂，且能同时分离出十五种氨基酸及两种双肽的混合物。该技术已通过周密的方法学验证，结果表明可用于同时检测复方氨基酸(15)双肽(2)注射液中十五种氨基酸及两种双肽的含量，考察稳定性样品中十七种主药含量的变化。本发明涉及一种复方氨基酸(15)双肽(2)注射液中十五种氨基酸及两种双肽的含量测定方法，其特征是采用柱前衍生高效液相色谱检测，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的反相色谱柱，以异硫氰酸苯酯作为柱前衍生试剂，采用紫外检测器检测，检测波长为244^264nm,流动相由乙腈和W组成，W是通过酸、碱、盐或缓冲溶液调节的pH5. 5^7. 5水溶液，梯度洗脱，采用的梯度淋洗程序包含下面的过程
权利要求
1.一种复方氨基酸(15)双肽(2)注射液中十五种氨基酸及两种双肽的含量测定方法，其特征是采用柱前衍生高效液相色谱检测，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的反相色谱柱，以异硫氰酸苯酯作为柱前衍生试剂，采用紫外检测器检测，检测波长为24r264nm，流动相由乙腈和W组成，W是通过酸、碱、盐或缓冲溶液调节的pH5. 5 7. 5水溶液，梯度洗脱，采用的梯度淋洗程序包含下面的过程
2.如权利要求I所述的测定方法，其特征是所述梯度淋洗程序包含下面的过程时间/min乙腈占流动相的体积比％ —
3.如权利要求r2任一所述的含量测定方法，其特征是所用的检测波长优选252 256nm。
4.如权利要求1-3任一所述的含量测定方法，其特征是W为pH5.5^7. 5的醋酸盐缓冲溶液，磷酸盐缓冲溶液，Tris-盐酸缓冲溶液或柠檬酸盐缓冲溶液。
5.如权利要求4所述的含量测定方法，其特征是W为pH为6.5的醋酸盐缓冲溶液。
6.如权利要求4-5任一所述的含量测定方法，其特征是所述缓冲溶液的浓度为.0. 05mol/L^0. 2mol/L。
7.如权利要求1-6任一所述的含量测定方法，其特征是色谱柱温度在25°C飞0°C之间。
8.如权利要求I所述的含量测定方法，其特征是釆用以下条件釆用异硫氰酸苯酯作为柱前衍生试剂；釆用紫外检测器检测，检测波长为254mn ；检测温度为40°C ；流动相流动相由流动相A相和流动相B相组成，A相乙腈B 相:W，W 是 pH6. 5±0. 05 的 CH3COONa-CH3COOH 缓冲溶液；釆用梯度淋洗程序包含下面的过程
9.如权利要求I所述的含量测定方法，其特征是釆用以下条件釆用异硫氰酸苯酯作为柱前衍生试剂；釆用紫外检测器检测，检测波长为254mn ；检测温度为40°C ；流动相流动相由流动相A相和流动相B相组成，A相:乙腈-水(80 :20，体积比)，B 相W-乙腈(93 :7，体积比)，W 是 pH6. 5±0. 05 的 CH3COONa-CH3COOH 缓冲溶液；釆用梯度淋洗程序包含下面的过程
10.如权利要求I所述的含量测定方法，其特征是优选采用以下条件采用异硫氰酸苯酯作为柱前衍生试剂；釆用紫外检测器检测，检测波长为254mn ； 检测温度为40°C ； 流动相流动相由流动相A相和流动相B相组成， A相:乙腈-水(80 :20，体积比)， B 相W-乙腈(93 :7，体积比)，W 是 0.1 mo I/L pH6. 5 ±0. 05 的 CH3COONa-CH3COOH 缓冲溶液； 釆用梯度淋洗程序包含下面的过程
全文摘要
一种复方氨基酸(15)双肽(2)注射液的分析方法，采用柱前衍生高效液相色谱检测，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的反相色谱柱，以异硫氰酸苯酯作为柱前衍生试剂，采用紫外检测器检测，检测波长为244~264nm，流动相由乙腈和W组成，W是水或通过酸、碱、盐或缓冲溶液调节的pH5.5~7.5水溶液，通过梯度洗脱进行检测。
文档编号G01N30/02GK102749397SQ201210250589
公开日2012年10月24日 申请日期2012年7月19日 优先权日2012年7月19日
发明者李静, 郭志强, 陈立营 申请人:天津金耀集团有限公司