专利名称：使用2-甲基吡啶硼烷作为还原剂还原胺化和分析糖类的制作方法
使用2-甲基吡啶硼烷作为还原剂还原胺化和分析糖类本发明涉及糖类(carbohydrate)的还原胺化。蛋白偶联聚糖涉及到重要的生物过程，例如细胞间相互作用、受体活化和分子运输(Ohtsubo等人，Cell 2006，126，855-67)。最近的关于聚糖在药物治疗中的作用的研究和聚糖作为特异性疾病中的生物标志物的研究引起了对快速和灵敏的高通量糖分析方法(glycoanalytical method)的需求(Packer 等人，Proteomics 2008, 8, 8-20 ;和 Wuhrer, MExpert. Rev. Proteomics 2007, 4, 135-36)。这些方法包括HPLC (Royle 等人，Anal. Biochem. 2008, 376, 1-12 ;和 Ruhaak 等人，Anal. Chem. 2008，80，6119-26 )和与UV检测、荧光检测或质谱检测相结合的毛细管电泳(CE) (Kamoda 等人，J. Chromatogr. A 2006,1133,332-39)。可供选择地，质谱分析法可以用作独立的技术(Qian等人，Anal. Biochem. 2007, 364, 8-18 ；和Jang-Lee等人，Methods Enzymol. 2006，415，59-86)。许多方法涉及用于引进紫外吸收或荧光标签 白勺聚糖衍生化(Anumula, K. R. Anal. Biochem. 2006, 350, 1-23 ；和 Shilova 等人，Bioorg.Khim. 2003, 29，339-55)。在说明书中列出或讨论的先前公布的文件或任何背景不应必然地被认为是承认文件或背景是现有技术的部分或者是公知常识。广泛使用的标记技术涉及通过还原胺化使寡糖与胺取代的发色团或荧光团偶联。在可逆反应中，开环形式的糖类与胺基反应并消除水，形成希夫碱。在第二不可逆反应中，希夫碱被还原形成仲胺。在该反应中最广泛使用的还原剂是氰基硼氢化钠(NaBH3CN)15该试剂的主要缺点是，水解时其容易形成有毒的挥发性化合物氰化氢。该试剂另一个缺点是，其被认为是过于强烈的还原剂，导致寡糖的至少一些直接还原而不是还原胺化。对于糖类与4-氨基-N-[2-( 二乙氨基)乙基]苯甲酰胺(DEAEAB)的还原胺化，引入了可选的还原剂三乙酰氧基硼氢化钠(NaBH(OAc)3)并且假定该方法适合于所有的胺标记(Dalpathado 等人，Anal. Bioanal. Chem. 2005，381，1130-37)。然而，该还原剂没有广泛地应用于聚糖分析。这被认为是由于其反应不足。本发明通过提供2-甲基卩比唳硼烧(2-picoline borane, 2_PB)用于糖类的还原胺化的用途论述了以上和其他的缺点。出人意料地，发明人发现2-PB作为糖类标记的还原胺化试剂特别有效和有用。因此，本发明还提供了标记糖类的工艺，所述工艺包括在2-PB的存在下，将糖类与标记剂接触，生成标记的糖类。在不受理论束缚的情况下，认为2-PB用于糖类的还原胺化(例如，标记)的用途具有以下意想不到的优点(i)与NaBH3CN相比，糖类的还原胺化如果没有改进，则具有可比较的转化和/或选择性；和/或(ii)与NaBH(OAc)3相比，糖类的还原胺化具有改进的转化和选择性；和/或(i i i )与NaBH3CN相比降低的毒性。在优选的实施方案中，将糖类与标记剂在2-PB的存在下反应。任何适合的标记剂均可以用于本发明。通常，标记剂将包括可以与开环形式的糖类还原末端反应的胺基。实例包括胺取代的发色团或荧光团和其他含有标记剂的胺，例如丙氨酸和[13C6]-丙氨酸。目前胺取代的发色团或荧光团是优选的标记剂。适合的胺取代的发色团或荧光团的实例包括2-氨基苯甲酸(2-AA)、2_氨基苯甲酰胺(2-AB )、8-氨基芘-1，3，6-三磺酸(APTS )、2-氨基吡啶(2-AP )、[D6] -AP 和[D4] -2-AA。氨基取代的发色团或荧光团可以携带进一步的反应性官能团。此种多官能标签的实例包括2，5- 二氨基吡啶和2-氨基-6-酰氨基生物素基吡啶(BAP)。目前，2-AA、2-AB和APTS是优选的胺取代的发色团或荧光团(例如APTS)。其他适合的胺取代的发色团或荧光团对于技术人员来说是明显的，例如来自Anumula, K. R. Anal. Biochem. 2006，350，1-23,将其引入本文作为参考。所谓术语“糖类”，我们包括一种或多种通�：蠭至40个组分糖的单糖、寡糖和多糖，或这些糖的混合物。适合的糖类可以得自人、动物或植物源，或者得自重组表达的蛋白质或生物技术 表达的蛋白质。用于制备糖类的适合的合成方法包括有机合成以及多糖的完全或部分的水解或者降解。实例包括已经通过葡聚糖的部分酸水解制备的寡糖(本文也称之为葡萄糖梯(glucose ladder))。用于合成寡糖的其他方法对于技术人员来说是已知的(参见,例如Seeberger, P. H. , Carbohydrate Research 2008, 343, 1889-1896,和 Seeberger, P. H. , ChemSoc Rev. 2008, 37, 19-28.将其引入本文作为参考)。包括那些得自糖蛋白和糖脂的聚糖(例如N-聚糖)是可以用于本发明的糖类的进一步实例，例如由人血浆制备的N-聚糖。图I描述了得自葡聚糖的低聚葡萄糖与2-AA标记的还原胺化的反应机理。还显示了没有标记的低聚葡萄糖的直接还原。如图I所示，还原胺化分两步进行第一(可逆的)反应，其中糖类与伯胺反应生成希夫碱；接着是第二 (不可逆的)反应，其中还原希夫碱以生成仲胺。本发明可以采用相当于这两个反应的两个分离的步骤进行。然而，优选地，两个反应用一锅法(one-pot)(即用一个步骤，而不是两个分离的步骤)进行。这具有加速过程和减少操作时间的优点。与现有的还原胺化剂例如NaBH3CN和/或NaBH (OAc) 3相比，在糖类的还原胺化(例如标记)中2-PB的使用被认为导致对需要的糖类胺产物(通过希夫碱亚胺)比不想要的糖类的直接还原产物具有更大的选择性。 与现有的还原胺化剂例如NaBH3CN和/或NaBH (OAc) 3相比，还认为2_PB导致了更多的糖类转化为需要的胺产物(通过希夫碱亚胺)。由于与已知试剂例如似811((^(3)3和NaBH3CN相比，2-PB在糖类的还原胺化(例如标记)中的改进的活性和/或选择性，相对于这些试剂，可以使用减少量的2-PB。这进一步降低了相对于NaBH3CN, 2-PB的超过和在固有还原毒性以上的糖类还原胺化(例如标记)的毒性(和对研究者的健康风险)和环境影响。在一个实施方案中，在本发明的工艺中2-PB的浓度小于用于获得可比较的糖类转化所需要的NaBH (OAc) 3或NaBH3CN (优选NaBH3CN)的浓度。例如，为了获得基本上相同的糖类转化，与NaBH(OAc)3或NaBH3CN (优选NaBH3CN)相比，可以使用小于90%，例如小于70%，优选小于50%，例如摩尔量小于30%的2-PB。
通常，在本发明的工艺中使用的2-PB的浓度为约0. 017M至约1M，优选约0. 033M至约0. 33M，例如约0. 067M至约0. 25M。也可以使用这些范围值的组合，例如约0. 017M至约 0. 33M,或约 0. 033M 至约 0. 25M。技术人员还将理解，使用的2-PB的浓度可以取决于诸如使用的标记剂等因素。例如，当标记剂是APTS时，2-PB的浓度通常为约0. 017M至约0. 333M，例如约0. 033M至约0. 067M (或这些范围的组合)。与已知的试剂例如似811((^(3)3和NaBH3CN相比，2-PB在糖类的还原胺化(例如标记)中的进一步的优点是2-PB可以导致更加稳健的标记图谱(参见，例如实施例2)。在不受理论束缚的情况下，据认为与已知的试剂例如NaBH(OAc)3和NaBH3CN相比，2-PB表现出标记效力对于结构特征例如电荷的降低的依赖性。本发明允许容易且安全地检测样品中的糖类。因此，本发明提供了用于检测样品中的糖类的方法，该方法包括
(i)在2-甲基吡啶硼烷(2-PB)的存在下，使样品中的糖类与标记剂接触，生成如本文所定义的标记的糖类；和(ii)检测标记的糖类。对于步骤(ii)，可以使用任何适合的检测方法，例如与荧光检测、UV吸收检测和/或通过质谱分析法的检测结合的液相色谱法。优选的方法是亲水相互作用色谱法及荧光检测(HILIC-HPLC-FL)。(与现有技术相比)本发明的缓和、有效、降低的毒性和/或降低的费用是指其可适用于高通量分析。因此，本发明可以对潜在地含有糖类的多个样品同时进行。例如，以上所述的检测糖类的方法可以同时应用于多个样品。糖类与标记剂和2-PB的反应可以在任何适合的反应温度下进行任何适合的时间长度。通常的反应时间是约I分钟至约10小时，例如约5分钟至约5小时。通常的反应温度为约0°C至约100°C，例如约20°C至约80°C。优选地，反应通过一锅法进行。所述反应可以在任何适合的溶剂中进行，所述溶剂包括水、DMS0、(冰)醋酸、乙腈、乙醇或者一种或多种前述溶剂的混合物。所述反应可以在含水或无水的条件下进行。在含水条件下，存在于本发明工艺中的水的量通常为约l%v/v至约90%v/v，例如约 10%v/v 至约 80%v/v,优选约 50%v/v 至约 67%v/v。出人意料地发现与通常用于还原胺化的其他还原剂(例如NaBH(OAc) 3或NaBH3CN)相比，在本发明的工艺中在含水条件下2-PB是更加有效的还原剂。在优选的实施方案中，使用酸帮助还原胺化。可以使用任何适合的酸，例如有机酸(例如乙酸)。在不受理论束缚的情况下，认为酸增加了还原胺化的效力。在一个实施方案中，所使用的酸选自乙酸、柠檬酸、丙二酸、三氯乙酸(TCA)、三氟乙酸以及它们的混合物。优选地，所述酸选自柠檬酸和乙酸。现将通过以下非限制性实例来举例说明本发明。实施例I :使用NaBH3CN、NaBH (OAc) 3和2-PB用2-AA和2-AB标记来自人血浆的葡萄糖梯和N-聚糖材料二甲亚砜(DMS0)、氢氧化铵、甲酸、Nonidet P-40 (乙基苯基聚乙二醇)(NP-40)、2-氨基苯甲酸(2-AA)、2-氨基苯甲酰胺(2-AB )、NaBH3CN, NaBH (OAc) 3和2-甲基吡啶硼烧(2-PB)得自 Sigma-Aldrich (Zwi jndrecht, The Netherlands)。十二烧基硫酸钠(SDS)购自 United States Biochemicals (Cleveland, 0H)。妝 N_ 糖苷酶 F (PNGaseF)得自Roche Diagnostics (Mannheim, Germany)。冰醋酸购自 Merck (Darmstadt, Germany)。乙臆购自 Biosolve (Valkenswaard, The Netherlands)。葡聚糖 10. 000 得自 Pharmacia/GEHealthcare(Uppsala, Sweden)。寡糖的制备葡萄糖梯通过IOmg葡聚糖10. 000在Iml IM TFA溶液中的部分酸水解(在80°C下I小时)生成。随后使用4ml的水稀释样品。来自人血衆的N-聚糖采用如Ruhaak等人，Anal. Chem. 2008, 80, 6119-26中所描述的进行制备，将其引入本文作为参考。概括地说，在添加20iU 2%SDS之后，通过在60°C下孵育IOmin使来自10 血浆的蛋白质变性。然后，将10 ii I 4%NP-40和0. 5mU PNGase F的10 y I 5 X PBS溶液加入到样品中。将样品在37°C下孵育过夜，用于N-聚糖的释放。 寡糖的标记将50 ill寡糖溶液(没有预先纯化的葡萄糖梯或血浆N-聚糖)与25 ill新鲜制备的标记溶液(2-AA或2-AB，在含有15%冰醋酸的DMSO中48mg/ml)混合。加入25 U I等份的新鲜制备的还原剂溶液(IM NaBH3CN, 2-甲基吡啶硼烷或NaBH(OAc) 3的DMSO溶液)，接着震摇5min并在65°C下孵育2小时。由于用寡糖溶液和标记溶液稀释还原剂溶液，在本发明的以上工艺中还原剂的终浓度为括号中所显示的四分之一(即约0. 25M)。这些水标记实验包含约50%的水(v/v)。为了允许与其他研究比较，同样在无水条件下进行2-AB标记，如Bigge等人，Anal. Biochem. 1995，230，229-38中所描述的，将其引入本文作为参考。总的来说，使用真空离心将50 的葡萄糖梯样品干燥。然后，将寡糖样品与25iU新鲜制备的96mg/ml2-AB的含有15%冰醋酸的DMSO的溶液混合。加入25 U I等份的新鲜制备的还原剂溶液(2MNaBH3CN,2-甲基吡啶硼烷或NaBH(OAc)3的DMSO溶液)，接着震摇5min并在65°C下孵育2小时。由于25iU还原剂溶液与25iU的2-AB溶液的组合，在本发明的以上工艺中每种还原剂的终浓度为1M。使反应混合物冷却至室温。在通过亲水相互作用色谱法及荧光检测(HILIC-HPLC-FL)进行分析之前，将样品用乙腈以l:3(v/v)的比例稀释。通过石墨化碳固相提取(PGC-SPE)纯化使用多孔石墨化碳SPE从样品中去除游离的标记和还原剂。石墨化碳黑SPE柱体(carbograph SPE cartridge) (Grace, Breda, The Netherlands)以 2ml 80% 的乙臆水溶液为条件，随后用3ml的水平衡。将样品与300 Ul的水混合，然后装载在柱体上。用4ml水冲洗后，使用Iml含有0. 1%TFA的50%的乙腈洗脱寡糖。在通过亲水相互作用色谱法结合电喷射离子化和离子陷阱MS检测(HILIC-ESI-IT-MS(/MS))进行分析之前，将洗脱液用乙腈以I: I (v/v)的比例稀释。HILIC-HPLC-FL使用HILIC-HPLC及荧光检测分析标记的N-聚糖。Ultimate LC系统(Dionex, Sunnyvale, CA)由Famos自动进样器、具有装载泵的Switchos�？楹蚒ltimate泵模块组成。该系统与荧光检测器(FP-2020pluS;JaSCO，Easton，MD)连接，所述荧光检测器在激发波长360nm和发射波长420nm下操作。该系统由Chromeleon软件控制并配备有
2.OmmxlOmm TSK gel-Amide 80 捕获柱和 2. 0mmx250mm TSK gel-Amide 80 分析柱(TosohBiosciences, Stuttgart, Germany)。将8OOii I、v 形底的聚丙烯 96 孔板(Westburg, Leusden, The Netherlands)中含有样品的孔用液体娃胶保鲜盖(silicon lid) (Labservices, Breda, The Netherlands)密封并置于自动进样器中。使用全循环(full loop)注射程序注射20 Ul等份。将标记的寡糖转移到捕获柱并使用乙腈50mM甲酸铵(pH4. 4 ;按体积计80:20)以150iil/min的流速冲洗3min。然后，与分析柱一致转换捕获柱，所述分析柱是使用70%乙腈(溶剂A)、30%甲酸铵(50mM，pH 4.4 (溶剂B))以150iil/min的流速平衡的。应用了线性梯度，将溶剂B由30% (Omin)增加至60%(87min)，然后在60%溶剂B下进行5min的等度洗脱并在30%溶剂B下重新平衡柱15min。 HILIC-ESI-IT-MS (/MS)HILIC-nanoLC-ESI-离子陷阱(IT) -MS/MS 使用配备有保护柱(5 y mAmide-80170 u mxlOmm)的 Ultimate 3000 nanoLC 系统(Dionex)在 Amide-80 柱(3 u m 粒子；75 V- mxl50mm; Tosoh Biosciences)上进行。使样品的乙腈含量为75%,并将10 ii I样品转移至保护柱中，所述保护柱使用乙腈50mM甲酸铵(pH 4. 4,90:10, v/v)冲洗5分钟。然后，将保护柱与在400nl/min的流速下操作并用17. 5%溶剂A (50mM甲酸铵，pH 4. 4)和82. 5%溶剂B (乙腈50mM甲酸铵，pH 4.4,80:20, v/v)平衡的nano柱一致。在25%溶剂A的直接步骤后，应用线性梯度在30min内达到40%溶剂A，接着是以100%溶剂A冲洗4min和以17. 5%溶剂A再平衡另外25min。将nanoLC系统与配备有在阳离子模式中操作的在线nano喷射源的Esquire High Capacity Trap (HCTultra) ESI-IT-MS (Bruker Daltonics)直接连接。对于电喷射(900-1200V),使用了来自 New Objective (Cambridge, MA, USA)的毛细管(360iim 0D，具有IOiim开口的20 iim ID)。在165°C下，使用61/min的氮气流蒸发溶齐Li。记录了 m/z400至m/z2000的离子。自动化碎片离子分析对于m/zll70至m/zll80的前体是可行的，导致降低的Glc7-物种(species)的串联质谱。数据处理对于HILIC-HPLC-FL数据，确定了来自葡萄糖标准品的5个峰的峰强度，mV。平均来自重复分析的结果。重复之间的差异小于10%。使用数据分析4.0版本软件(BrukerDaltonics)分析了 HILIC-ESI-IT-MS数据。对于标记的和未标记的物种两者，均测定了来自Glc4至Glc8的质子、铵离子、钠离子和钾离子的峰强度。考虑了单电荷离子和双电荷离子两者。概括所有加合物的强度并计算标记的聚糖对未标记的聚糖的相对丰度。结果通过还原胺化，比较了还原剂三乙酰氧基硼氢化钠、2-甲基吡啶硼烷和氰基硼氢化钠的N-聚糖的标记。使用前述的三种还原剂来标记来自葡聚糖的低聚葡萄糖和来自人血浆的N-聚糖。使用胺2-AA和2-AB两者来标记低聚葡萄糖，而来自血浆的N-聚糖仅使用2-AA来标记。所有样品均使用HILIC-HPLC-FL分析。通过石墨化碳-SPE额外纯化低聚葡萄糖梯并使用HILIC-LC-ESI-IT-MS进行分析。
在使用不同的还原剂和标记进行标记之后的葡萄糖梯的HILIC-HPLC-FL色谱图描述于图2A、2B和2C中。由这些数据测定了 Glc4至Glc8的低聚体的平均峰高度(参见下表I)。表I :在不同的还原剂的帮助下标记的来自葡聚糖的低聚葡萄糖化合物的强度和它们的标记效率。强度用mV显示。n.d. =未测定的
权利要求
1.2-甲基吡啶硼烷(2-PB)用于还原胺化糖类的用途，其中，所述2-PB的浓度小于用于获得可比较的糖类转化所需要的NaBH(OAc)3或NaBH3CN的浓度。
2.根据权利要求I的用途，其中，在2-PB的存在下使所述糖类与标记剂反应。
3.一种用于标记糖类的工艺，所述工艺包括在2-甲基吡啶硼烷(2-PB)的存在下使所述糖类与标记剂接触，以生成标记的糖类，其中，所述2-PB的浓度小于用于获得可比较的糖类转化所需要的NaBH(OAc)3或NaBH3CN的浓度。
4.根据权利要求2或3的用途或工艺，其中，所述标记剂是胺取代的发色团或荧光团。
5.根据权利要求4的用途或工艺，其中，所述胺取代的发色团或荧光团选自2_氨基苯甲酸(2-AA)、2-氨基苯甲酰胺(2-AB)、8-氨基芘_1，3，6-三磺酸(APTS)、2_氨基吡啶(2-AP)、[D6]-2-AP、[D4]-2-AA、2，5-二氨基吡啶和2-氨基-6-酰氨基生物素基吡啶(BAP)。
6.根据权利要求4的用途或工艺，其中，所述胺取代的发色团或荧光团选自2_氨基苯甲酸 2-AA、2-AB 和 APTS。
7.根据前述权利要求中任一项的用途或工艺，其中，为了获得基本上相同的糖类转化，与NaBH(OAc)3或NaBH3CN相比，使用摩尔量小于90%的2-PB。
8.根据前述权利要求中任一项的用途或工艺，其中，所述2-PB的浓度为约0.017M至约1M,优选约0. 033M至约0. 33M。
9.根据前述权利要求中任一项的用途或工艺，其中，所述用途或工艺是在含水条件下进行的。
10.根据前述权利要求中任一项的用途或工艺，其中，所述糖类来自人、动物或植物源或者来自重组表达或生物技术表达的蛋白质。
11.根据权利要求10的用途或工艺，其中，所述糖类通过多糖的完全水解或降解，或者部分水解或降解来制备。
12.根据权利要求10的用途或工艺，其中，所述糖类通过完全化学合成或部分化学合成来制备。
13.根据权利要求10的用途或工艺，其中，所述糖类是得自糖蛋白或糖脂的聚糖。
14.一种用于检测样品中的糖类的方法，所述方法包括 (i)在2-甲基吡啶硼烷(2-PB)的存在下，使样品中的糖类与标记剂接触，以生成如权利要求3至13中任一项所定义的标记的糖类；和 (ii)检测标记的糖类。
15.根据权利要求14的方法，其中，所述检测步骤包括与荧光检测结合的液相色谱法。
16.根据权利要求15的方法，其中，所述与荧光检测结合的液相色谱法是亲水相互作用色谱法及荧光检测(HILIC-HPLC-FL)。
17.根据前述权利要求中任一项的用途、工艺或方法，其是对潜在地含有糖类的多个样品同时实施的。
18.—般地如本文所述的，任选地参考实例描述的任何新的工艺、用途或方法。
全文摘要
本发明提供了2-甲基吡啶硼烷(2-PB)用于糖类尤其是来自预定血浆的聚糖的还原胺化的用途，其中所述2-PB的浓度小于用于获得可比较的糖类转化所需要的NaBH(OAc)3或NaBH3CN的浓度。还描述了用于标记糖类的工艺，所述工艺包括在作为还原剂的2-甲基吡啶硼烷的存在下，将所述糖类与标记剂，例如2-氨基苯甲酸、2-氨基苯甲酰胺、APTS等接触。采用这种方式标记糖类便于使用HPLC技术，例如HILIC-HPLC-FL、HILIC-ESI-IT-MS或毛细管电泳法的检测。
文档编号G01N33/66GK102770765SQ201080053819
公开日2012年11月7日 申请日期2010年9月27日 优先权日2009年9月29日
发明者L·R·拉哈克, M·沃洛尔 申请人:莱顿大学医学中心
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