专利名称：一种体外分子水平荧光法排除筛选药物假阳性结果的方法
技术领域：
本发明涉及药物筛选领域，具体来讲，本发明涉及一种在体外分子水平采用荧光法来排除基于荧光技术的药物筛选假阳性结果的方法。
背景技术：
药物高通量筛选(high-throughput screening, HTS)是发现创新药物的重要技术手段，对大规模化合物库的高通量筛选是药物研发领域寻找先导化合物的主要来源，与传统方法相比，HTS在微量条件下进行，采用自动化操作系统，可以实现大规模的筛�。ü钚允荽砉倘范ɑ衔锏囊┪锘钚裕谛畔⒌囊┪锓⑾止套急缸既�、丰富的资料，因而筛选过程本身已不再是新药发现的瓶颈。但是筛选通量的巨大增长并没有带来相应的大量新化学实体被鉴定为待开发候选分子，究其原因，除可通过吸收、分布、代谢、排泄、毒性(ADMET)研究解决的药代动力学及毒理学等相关问题外，筛选过程中化合物的性质及成药性也是一个重要因素。另一方面，筛选过程本身也存在问题，尤其是采用广泛用于药物高通量筛选中的专业化检测技术，为保证通量，这些技术虽然避免了过多的操作步骤，能够进行连续操作， 从而降低了消耗时间的步骤，但其缺点在于后续反应产物检测时待测样品仍存在于反应体系中，从而导致待测物非目标检测性质的干扰问题。这些可通过采用其他独立检测技术对所得结果进行反筛选(coimterscreening)以验证结果，或者将待测物加入已经停止的反应体系以区别假象(artifact)。尽管如此，一些假阳性结果仍然无法排除。由于这些假阳性结果的存在，导致后续药物研发的巨大投入，造成人力、物力和财力的巨大浪费。荧光检测方法具有灵敏度高、方法简便的优点，因此，近年来，基于荧光技术的检测分析方法被广泛应用于药物的高通量筛选(HTS)。目前应用于HTS的荧光技术包括均相时间分辨荧光法(homogeneoustime resolved fluorescence, HTRF)、荧光共振能量转移法(fluorescence resonance energy transfer, FRET)、焚光关联光谱法(fluorescence correlation spectroscopy,FCS)、极化焚光分析法(fluorescence polarization,FP)等。 在这些方法中，HTRF法由于发射光较窄的带宽与较长的衰减周期、激发光波长与发射光波长间巨大的斯托克斯位移(Stoke’ s shift)从而可以检测特异性信号，排除短寿命荧光信号造成的假阴性结果，因此，得到越来越多的应用。HTRF的原理是生物活性物质(主要是酶)的底物两端分别偶联荧光淬灭基团和荧光发射基团，当反应体系中存在相应生物活性物质(主要是酶)的活性时，底物被切割后荧光淬灭基团和荧光发射基团分离，采用具有一定波长激发光的检测器进行激发即可检测到特定波长发射光。将HTRF应用于药物筛选中时，其操作过程是将待筛选样品与生物活性物质在一定条件下孵育一定时间后加入生物活性物质的底物，在适宜条件下孵育一定时间，以一定波长激发光激发后检测特定波长发射光强度，若待测样品抑制生物活性物质的活性时，其底物切割程度降低，因而所检测到的发射光强度降低，由此可筛选出具有抑制活性的待测样品。
HTFR虽然具有可以检测特异性信号，排除短寿命荧光信号造成假阴性结果等诸多优点，但是却无法排除化合物对荧光的淬灭作用所造成的假阳性结果。目前，在药物高通量筛选中用于排除HTRF法筛选结果假阳性验证的方法主要依赖于质谱法、高效液相色谱法等，这些手段存在通量低、成本高等瓶颈问题，而且对设备依赖程度高，不能满足药物研发领域对于低成本与高效率的要求。针对这个问题，本发明开发了一种既简单，又省时、省力，低成本、高效率的排除HTRF等荧光筛选方法中假阳性结果的方法。综上所述，针对基于荧光法进行药物筛选时对于具有荧光淬灭作用的样品造成的假阳性结果无法排除，而质谱法等排除假阳性的方法无法实现高通量且成本较高，造成目前缺少高通量、高灵敏度且简单易行的方法的现状，促使了本发明的研究。
发明内容
为了解决上述问题，排除体外分子水平药物高通量筛选中的假阳性结果，特别是荧光淬灭作用造成的假阳性结果，本发明公开了一种采用荧光法进行体外分子水平药物筛选假阳性结果的排除方法。该方法从HTRF法药物筛选技术改进而来，通过改变生物活性物质、底物和待测目标物质的加样顺序来实现，其基本原理为生物活性物质与底物室温反应一定时间产生足以检测到的荧光，加入待测目标物质，检测荧光强度随反应时间的变化趋势，根据荧光强度的变化得出结果。采用该法可区分待测目标物质自身对荧光的淬灭作用与待测目标物质抑制酶的活性从而降低酶水解底物最终致使荧光减弱的作用，适用于基于荧光的方法(如时间分辨荧光、荧光能量共振转移等)进行药物筛选时假阳性结果的排除。本发明的一个方面涉及一种用于目标物质筛选的荧光法中荧光测试样品的制备方法，包括1)向反应板中加入a)生物活性物质，和b)所述生物活性物质的底物，所述底物的两端分别偶联有荧光淬灭基团和荧光发射基团；2)将1)中所得样品在一定条件下孵育一定时间以达到荧光法可检测的荧光强度；3)向2)中所得样品中再加入待测目标物质，得到所述荧光法的荧光测试样品。本发明的另一方面涉及一种按照上述方法制备的荧光测试样品验证组。本发明还涉及一种用于目标物质筛选的荧光法中的荧光测试样品筛选组，其采用如下方法制备1)向反应板中加入a)生物活性物质，和b)待测目标物质，在一定条件下孵育一定时间；2)在1)中加入生物活性物质的底物，所述底物的两端分别偶联有荧光淬灭基团和荧光发射基团，由此得到荧光测试样品筛选组。本发明还涉及一种用于目标物质筛选的荧光法中的荧光测试样品阴性对照组， 其采用如下方法制备1)向反应板中加入a)生物活性物质，和b)待测目标物质的溶剂，在一定条件下孵育一定时间；2)在1)中加入生物活性物质的底物，所述底物的两端分别偶联有荧光淬灭基团和荧光发射基团，由此得到荧光测试样品阴性对照组。以上所述荧光法选自时间分辨荧光法、荧光共振能量转移法、均相时间分辨荧光法、荧光关联光谱法、极化荧光分析法和常规荧光定量法；在本发明的一个实施方案中，所述荧光法为均相时间分辨荧光法。所述生物活性物质是酶，优选为切割酶，特别是天冬氨酸蛋白酶家族和半胱氨酸蛋白酶家族的切割酶；在本发明的一个实施方案中，所述切割酶为BACE1。所述生物活性物质的底物为选自酶，优选为切割酶，特别是天冬氨酸蛋白酶家族和半胱氨酸蛋白酶家族的切割酶的底物；在本发明的一个实施方案中，所述底物为APP(淀粉样前体蛋白)或突变型APP。所述荧光淬灭基团选自QSY7、DABCYL、Ac、Dnp ；在本发明的一个实施方案中，所述荧光淬灭基团为QSY7。所述荧光发射基团选自镧系金属螯合分子、EDANS(5’ -(2’ -氨乙基氨基奈磺酸))、Mca (甲基香豆素醋酸盐)和AFC (7-氨基-4-三氟甲基香豆素)；在本发明的一个实施方案中，所述荧光发射基团为铕螯合分子。所述一定条件是指反应温度为0 40°C，反应pH值为2 6. 8，所述孵育时间为 0 24hr ；在本发明的一个实施方案中，所述一定条件是指反应温度为20 25 V，反应pH 值为4. 5，所述孵育时间在验证组为6hr，在筛选组和阴性对照组为0. 5hr。本发明的再一方面还涉及一种用于目标物质筛选的荧光法中由于荧光淬灭作用引起的假阳性样品的排除方法，包括1)在一定的激发光和发射光条件下，同时检测如上所述荧光检测样品验证组筛选组和阴性对照组的荧光强度；其中所述荧光检测样品中的生物活性物质、底物和待测目标物质均相同；其中所述荧光检测样品中的反应为同步进行，具体地，各荧光检测样品中的生物活性物质和底物为同时加入，验证组所述荧光测试样品中的待测目标物质随后加入；2)从加入底物后开始的48hr内，优选为12hr内，分孵育时间段对步骤1)所述荧光检测样品的荧光强度进行检测，具体地，所述分孵育时间段是指在加入待测目标物质前、 加入待测目标物质后即刻、加入待测目标物质后每0. 5-lhr ；3)根据步骤2)中所述荧光检测样品验证组筛选组和阴性对照组的荧光强度检测结果，判定待测目标物质是否为假阳性样品。在本发明的一个实施方案中，荧光检测样品验证组筛选组和阴性对照组
的制备方法以及假阳性样品的排除方法，具体包括以下步骤(1)配制验证组筛选组和阴性对照组荧光检测样品在384孔板上，首先向各组中加入BACE1，其次，向筛选组中加入不同浓度的待测目标物质，向阴性对照组中加入相同体积的待测目标物质溶剂DMS0，验证组中不加任何物质。将三组共同孵育0. 5hr。最后，向各组中加入底物APP。(4)将各组室温孵育6hr，以达到可检测的荧光强度；(5)在ex340nm-em615nm条件下检测三组反应体系的荧光强度；(6)向验证组中加入不同浓度的待测目标物质。(7)立即在ex340nm-em615nm条件下检测三组反应体系的荧光强度。
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(8)在加入待测目标物质后6hr内，继续分孵育时间段进行三组反应体系的荧光强度检测，检测波长为eX340nm-em615nm。(9)根据验证组筛选组和阴性对照组的荧光强度值，进行相互比较，统计分析以得出结果。其中判定是否为假阳性样品的方法为在筛选组荧光强度降低的基础上，若验证组荧光强度没有显著变化，但随反应时间的增加荧光强度不断增加，增加幅度低于阴性对照组，该趋势终止于酶或待测目标物质的耗竭，则待测目标物质发挥抑制剂活性；若验证组荧光强度立即降低，则待测目标物质发挥荧光淬灭作用。本发明还涉及上述排除方法用于排除荧光法筛选中假阳性结果的用途。所述假阳性结果是指荧光淬灭作用引起的假阳性结果。发明的有益效果与现有的药物筛选假阳性结果排除手段相比，本发明的荧光方法具有以下优点 (1)通量高可在微量条件下进行，采用自动化操作系统，可以实现大规模验证；(2)成本低与质谱法等手段相比，无需购置新试剂或新仪器，且试剂与样品用量少；(3)灵敏度高； (4)均相性好，简单易行。本发明可用于验证体外分子水平基于荧光法进行药物筛选所得阳性结果的验证，尤其适用于假阳性结果的排除，具有良好的应用前景。
图IBACEl抑制剂H1712的验证结果横坐标孵育时间(incubation time，单位为hr)是指从加入底物后开始计算的时间，第一个检测点为加入待验证物后立即检测的结果(以下各图与此相同)；纵坐标为相关荧光单位数(RFU)。图2BACE1抑制剂H0412的验证结果图3BACE1抑制剂H0312的验证结果图4BACE1抑制剂EGCG的验证结果图5BACE1抑制剂L80325的验证结果图6BACE1抑制剂013的验证结果图7BACE1抑制剂015的验证结果
具体实施例方式下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。以下实施例所使用的试剂、材料包括TruPoint Beta-Secretase Assay Kit384 (Cat. #· AD0258, PerkinElmer)(实施例中涉及的底物APP、测试缓冲液均为该试剂盒提供，实施例中涉及溶液的配制方法参见试剂盒说明书)重组人 BACEl[Recombinant Human BACEl(beta—secretase)] (Cat. #·P2947，Invitrogen)Dimethylsulfoxid(DMSO)(127790025，ACR0S)EGCG(Epigallocatechin gallate，表没食子儿茶素没食子酸酯)购于成都普瑞法科技开发有限公司，CAS No. =989-51-5 ；L80325( β -Secretase Inhibitor IV)购于Merck 公司 Calbiochem，货号565788化合物Hl712、H0412、H0312、013、015均由军事医学科学院毒物药物研究所提供。384 孔板(Cat. #· 6007270, PerkinElmer)VICT0R3 多功能酶标仪(PerkinElmer 公司)以下实施例所采用的方法为均相时间分辨荧光法(HTRF)。以下实施例所采用的方法均包括以下几个步骤(1)实验分组以下每个实施例均分为3组。第1组为阴性对照组反应体系中只有生物活性物质重组人BACEl与其底物APP，操作过程是重组人BACEl与其底物APP在适宜条件下孵育一定时间后，进行荧光强度检测，不加待测目标物质(在以下实施例中，待测目标物质是指利用荧光法，以BACEl为靶标，经初步筛选所得的BACEl抑制剂)。第2组为筛选组反应体系中有待测目标物质、重组人BACEl和底物APP，操作过程是重组人BACEl与待测目标物质在适宜条件下孵育一定时间后，加入底物APP在适宜条件下孵育一定时间， 进行荧光强度检测。第3组是验证组反应体系中有待测目标物质、重组人BACEl和底物 APP,但是操作过程与筛选组不同，首先是重组人BACEl与其底物APP在适宜条件下孵育一定时间以达到可检测的荧光强度并进行检测后(至此过程与阴性对照组相同)，加入待测目标物质，立即检测后，并继续分孵育时间段进行检测。(2)重组人BACEl的底物APP两端分别标记铕螯合荧光分子和荧光淬灭分子 QSY7 ；(3)配制筛选组、阴性对照组和验证组反应体系在384孔板上，首先向各组中加入15 μ L 0. 67mU/l·! L重组人BACE1，其次，向筛选组中加入2 μ L不同浓度的待测目标物质， 向阴性对照组中加入相同体积的DMS0，验证组中不加任何物质。将三组共同孵育0. 5hr。最后，向各组中加入15 μ L 400nmol/L底物APP。(4)将各组室温孵育6hr，以达到可检测的荧光强度；(5)采用多功能酶标仪在eX340nm-em615nm条件下检测三组反应体系的荧光强度；(6)向验证组中加入以BACEl为靶标筛选得到的待测目标物质。(7)立即在ex340nm-em615nm条件下检测三组反应体系的荧光强度。(8)在加入待测目标物质后6hr内，继续分孵育时间段进行三组反应体系的荧光强度检测，检测波长为eX340nm-em615nm。(9)根据验证组、阴性对照组和筛选组的荧光强度值，进行相互比较，统计分析以
得出结果。以下实施例的结果分析所采用的共同方法是采用GraphPad Prism软件以时间-相关荧光单位数(RFU)作图，并比较验证组荧光变化与其阴性对照组、筛选组荧光变化规律。结果判定方法为在筛选组荧光强度降低的基础上，若验证组荧光强度没有显著变化，但随反应时间的增加荧光强度不断增加，增加幅度低于阴性对照组，该趋势终止于酶或待验证物的耗竭，则待验证物发挥抑制剂活性；若验证组荧光强度立即降低，则待验证物发挥荧光淬灭作用。实施例IBACEl抑制剂H1712筛选结果验证在该实施例中，待测目标物质为H1712，其加入浓度为10_4M、10_5M、10_6M。检测时间点为加入H1712前(即加入APP后6h)、加入H1712后即刻、加入APP后 7h、8h、9h、9. 5h、10h、10. 5h、llh、ll. 5h、12h。验证结果在加入H1712后，与阴性对照相比，验证组的荧光强度立即降低，表明化合物H1712具有明显的荧光淬灭作用(见图1)。实施例2BACE1抑制剂H0412筛选结果验证在该实施例中，待测目标物质为H0412，其加入浓度为1 (T4M、ICT5M、10、。检测时间点为加入H0412前(即加入APP后6h)、加入H0412后即刻、加入APP后 7h、8h、9h、9. 5h、10h、10. 5h、llh、ll. 5h、12h。验证结果在加入H0412后，与阴性对照相比，验证组的荧光强度立即降低，表明化合物H0412具有明显的荧光淬灭作用(见图2)。实施例3BACE1抑制剂H0312筛选结果验证在该实施例中，待测目标物质为H0312，其加入浓度为1 (T4M、ICT5M、10、。检测时间点为加入H0312前(即加入APP后6h)、加入H0312后即刻、加入APP后 7h、8h、9h、9. 5h、10h、10. 5h、llh、ll. 5h、12h。验证结果在加入H0312后，与阴性对照相比，验证组的荧光强度立即降低，表明化合物H0312具有明显的荧光淬灭作用(见图3)。实施例4 =BACEl抑制剂EGCG筛选结果验证在该实施例中，待测目标物质为EGCG，其加入浓度为10-4Μ、10-5Μ、1(Γ6Μ。检测时间点为加入EGCG前(即加入APP后6h)、加入EGCG后即刻、加入APP后 6. 511、711、811、911、1011、1111、1211及加终止液(试剂盒提供，下同)后。验证结果在加入EGCG后，与阴性对照相比，验证组的荧光强度立即降低，表明化合物EGCG具有明显的荧光淬灭作用(见图4)。早期，有研究表明EGCG可能是BACEl的抑制剂(Jeon SY, Bae K，Seong YH, Song KS :Green Tea Catechins as a BACEl(β-Secretase)Inhibitor. Bioorg Med Chem Lett 2003 ；13 :3905-3908.)，但本发明的研究结果表明EGCG具有明显的荧光淬灭作用，并不是 BACEl的抑制剂。另外也有研究证明EGCG不是BACEl抑制剂(Rezai-Zadeh K，Shytle D， Sun N,Mori T,Hou H,Jeanniton D et al. :Green teaepigallocatechin-3-gallate(EGC G)modulates amyloid precursor proteincl eavage and reduces cerebral amyloidosis in Alzheimer transgenicmice. J Neurosci 2005 ；25 :8807_8814·)实施例5 =BACEl抑制剂L80325筛选结果验证在该实施例中，待测目标物质为L80325，其加入浓度为10_5Μ、10_6Μ、10_7Μ、10_8Μ、 1(Γ9Μ。检测时间点为加入L80325前(即加入APP后6h)、加入L80325后即刻、加入APP 后 6. 5h、7h、8h、9h、10h、llh、12h 及加终止液后。
验证结果加入L80325后，与阴性对照比较，验证组荧光强度没有降低，随时间增加而逐渐趋于平稳，表明化合物L80325无荧光淬灭作用。同时，筛选组荧光强度显著降低， 表明化合物L80325对BACEl的活性具有抑制作用(见图5)。(注在加入L80325后，图 5中出现的验证组荧光强度略微降低是由于反应达到平衡或信号值达到仪器检测上限溢出所致，不影响结果判断。图6和图7与此情况相同。)实施例6 =BACEl抑制剂013筛选结果验证在该实施例中，待测目标物质为013，其加入浓度为10-5Μ、10-6Μ、1(Γ7Μ。检测时间点为加入013前(即加入APP后6h)、加入013后即刻、加入APP后6. 5h、 7h、8h、9h、IOh、1 lh、12h 及加终止液后。验证结果加入013后，与阴性对照比较，验证组荧光强度没有降低，随时间增加而逐渐趋于平稳，表明化合物013无荧光淬灭作用。同时，筛选组荧光强度显著降低，表明化合物013对BACEl的活性具有抑制作用(见图6)。实施例7 =BACEl抑制剂015筛选结果验证在该实施例中，待测目标物质为015，其加入浓度为IO-5M、IO-6M、I(TM。检测时间点为加入015前(即加入APP后6h)、加入015后即刻、加入APP后6. 5h、7h、8h、9h、10h、 llh、12h及加终止液后。验证结果加入015后，与阴性对照比较，验证组荧光强度没有降低，随时间增加而逐渐趋于平稳，表明化合物015无荧光淬灭作用。同时，筛选组荧光强度显著降低，表明化合物015对BACEl的活性具有抑制作用(见图7)。尽管本发明的具体实施方式
已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
权利要求
1.一种荧光测试样品的制备方法，所述荧光测试样品用于荧光法中目标物质的筛�。� 所述制备方法包括1)向反应板中加入a)生物活性物质，和b)所述生物活性物质的底物，所述底物的两端分别偶联有荧光淬灭基团和荧光发射基团；2)将1)中所得样品在一定条件下孵育一定时间以达到荧光法可检测的荧光强度；和3)向2)中所得样品中再加入待测目标物质，得到所述荧光法的荧光测试样品。
2.权利要求1所述的方法，其中，所述荧光法选自时间分辨荧光法、荧光共振能量转移法、均相时间分辨荧光法、荧光关联光谱法、极化荧光分析法和常规荧光定量法；步骤1)中所述生物活性物质是酶，优选为切割酶，特别是天冬氨酸蛋白酶家族和半胱氨酸蛋白酶家族的切割酶；所述生物活性物质的底物为选自酶，优选为切割酶，特别是天冬氨酸蛋白酶家族和半胱氨酸蛋白酶家族的切割酶的底物；所述荧光淬灭基团选自QSY7、DABCYL、Ac、Dnp ；荧光发射基团选自镧系金属螯合分子、EDANS(5‘ -(2’ _氨乙基氨基奈-1-磺酸))、 Mca (甲基香豆素醋酸盐)和AFC (7-氨基-4-三氟甲基香豆素)；步骤2)中所述一定条件是指反应温度为O 40°C，反应pH值为2 6. 8，所述孵育时间为O 24hr ；具体地，所述荧光法为均相时间分辨荧光法，步骤1)中所述生物活性物质为BACE1，所述底物为APP (淀粉样前体蛋白)或突变型APP，所述荧光淬灭基团为QSY7，所述荧光发射基团为铕螯合分子；步骤2)中所述一定条件是指反应温度为20 25°C，反应pH值为4. 5， 所述孵育时间为6hr。
3.一种按照权利要求1所述方法制备的荧光测试样品验证组，其中，所述荧光法选自时间分辨荧光法、荧光共振能量转移法、均相时间分辨荧光法、荧光关联光谱法、极化荧光分析法和常规荧光定量法；步骤1)中所述生物活性物质是酶，优选为切割酶，特别是天冬氨酸蛋白酶家族和半胱氨酸蛋白酶家族的切割酶；所述生物活性物质的底物为选自酶，优选为切割酶，特别是天冬氨酸蛋白酶家族和半胱氨酸蛋白酶家族的切割酶的底物；所述荧光淬灭基团选自QSY7、DABCYL、Ac、Dnp ；荧光发射基团选自镧系金属螯合分子、EDANS(5‘ -(2’ _氨乙基氨基奈-1-磺酸))、 Mca (甲基香豆素醋酸盐)和AFC (7-氨基-4-三氟甲基香豆素)；步骤2)中所述一定条件是指反应温度为0 40°C，反应pH值为2 6. 8，所述孵育时间为0 24hr ；具体地，所述荧光法为均相时间分辨荧光法，步骤1)所述生物活性物质为BACEl ；所述生物活性物质的底物为APP (淀粉样前体蛋白)或突变型APP ；所述荧光淬灭基团为QSY7 ； 荧光发射基团为铕螯合分子；步骤2)中所述一定条件是指反应温度为20 25°C，反应pH 值为4. 5，所述孵育时间为6hr。
4.一种用于目标物质筛选的荧光法中的荧光测试样品筛选组，其采用如下方法制备1)向反应板中加入a)生物活性物质，和b)待测目标物质，在一定条件下孵育一定时间；2)在1)中加入生物活性物质的底物，所述底物的两端分别偶联有荧光淬灭基团和荧光发射基团，由此得到荧光测试样品筛选组。
5.权利要求4所述的筛 选组，其中，所述荧光法选自时间分辨荧光法、荧光共振能量转移法、均相时间分辨荧光法、荧光关联光谱法、极化荧光分析法和常规荧光定量法；步骤1)中所述生物活性物质是酶，优选为切割酶，特别是天冬氨酸蛋白酶家族和半胱氨酸蛋白酶家族的切割酶；所述一定条件是指反应温度为O 40°C，反应pH值为2 6. 8，所述孵育时间为O 24hr ；步骤2)中所述生物活性物质的底物为选自酶，优选为切割酶，特别是天冬氨酸蛋白酶家族和半胱氨酸蛋白酶家族的切割酶的底物；所述荧光淬灭基团选自QSY7、DABCYL、Ac、Dnp ；荧光发射基团选自镧系金属螯合分子、EDANS(5‘ -(2’ _氨乙基氨基奈-1-磺酸))、 Mca (甲基香豆素醋酸盐)和AFC (7-氨基-4-三氟甲基香豆素)；具体地，所述荧光法为均相时间分辨荧光法，步骤1)所述生物活性物质为BACEl ；所述一定条件是指反应温度为20 25°C，反应pH值为4. 5，所述孵育时间为0. 5hr ；步骤2) 中所述生物活性物质的底物为APP (淀粉样前体蛋白)或突变型APP ；所述荧光淬灭基团为 QSY7 ；荧光发射基团为铕螯合分子。
6.一种用于目标物质筛选的荧光法中的荧光测试样品阴性对照组，其采用如下方法制备1)向反应板中加入a)生物活性物质，和b)待测目标物质的溶剂，在一定条件下孵育一定时间；2)在1)中加入生物活性物质的底物，所述底物的两端分别偶联有荧光淬灭基团和荧光发射基团，由此得到荧光测试样品阴性对照组。
7.权利要求6所述的阴性对照组，其中，所述荧光法选自时间分辨荧光法、荧光共振能量转移法、均相时间分辨荧光法、荧光关联光谱法、极化荧光分析法和常规荧光定量法；步骤1)中所述生物活性物质是酶，优选为切割酶，特别是天冬氨酸蛋白酶家族和半胱氨酸蛋白酶家族的切割酶；所述一定条件是指反应温度为0 40°C，反应pH值为2 6. 8，所述孵育时间为0 24hr ；步骤2)中所述生物活性物质的底物为选自酶，优选为切割酶，特别是天冬氨酸蛋白酶家族和半胱氨酸蛋白酶家族的切割酶的底物；所述荧光淬灭基团选自QSY7、DABCYL、Ac、Dnp ；荧光发射基团选自镧系金属螯合分子、EDANS (5’ -(2’ -氨乙基氨基奈-1-磺酸))、 Mca (甲基香豆素醋酸盐)和AFC (7-氨基-4-三氟甲基香豆素)；具体地，所述荧光法为均相时间分辨荧光法，步骤1)所述生物活性物质为BACEl ；所述一定条件是指反应温度为20 25°C，反应pH值为4. 5，所述孵育时间为0. 5hr ；步骤2) 中所述生物活性物质的底物为APP (淀粉样前体蛋白)或突变型APP ；所述荧光淬灭基团为 QSY7 ；荧光发射基团为铕螯合分子。
8.一种用于目标物质筛选的荧光法中由于荧光淬灭作用引起的假阳性样品的排除方法，包括1)在一定的激发光和发射光条件下，同时检测如权利要求3、4和6所述荧光检测样品的荧光强度；其中所述荧光检测样品中的生物活性物质、底物和待测目标物质均相同；其中所述荧光检测样品中的反应为同步进行，具体地，各荧光检测样品中的生物活性物质和底物为同时加入，权利要求3所述荧光测试样品验证组中的待测目标物质随后加入；2)从加入底物后开始的48hr内，优选为12hr内，分孵育时间段对步骤1)所述荧光检测样品的荧光强度进行检测，具体地，所述分孵育时间段是指在加入待测目标物质前、加入待测目标物质后即刻、加入待测目标物质后每0. 5-lhr ；3)根据步骤2)中如权利要求3、4和6所述荧光检测样品的荧光强度检测结果，判定待测目标物质是否为假阳性样品。
9.权利要求8所述的排除方法，其用于荧光法筛选中假阳性结果的排除。
10.权利要求9所述的排除方法，其中的假阳性结果是指荧光淬灭作用引起的假阳性结果。
全文摘要
本发明涉及用于目标物质筛选的荧光法中荧光测试样品的制备方法，包括1)向反应板中加入a)生物活性物质，和b)所述生物活性物质的底物，底物两端分别偶联有荧光淬灭基团和荧光发射基团；2)将1)中所得样品在一定条件下孵育一定时间以达到荧光法可检测的荧光强度；3)向2)中所得样品中再加入待测目标物质，得到所述荧光法的荧光测试样品。本发明还涉及按照上述方法制备的荧光测试样品(验证组)，以及用于对照的(筛选组)和(阴性对照组)。本发明还涉及用于目标物质筛选的荧光法中由于荧光淬灭作用引起的假阳性样品的排除方法，以及所述排除方法用于排除荧光法筛选中假阳性结果，特别是荧光淬灭作用引起的假阳性结果的用途。
文档编号G01N21/64GK102243176SQ20101017247
公开日2011年11月16日 申请日期2010年5月14日 优先权日2010年5月14日
发明者周文霞, 周金武, 张永祥, 杨日芳, 程军平, 程肖蕊, 聂爱华 申请人:中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所
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