专利名称：梅毒特异性IgM抗体与特异性总抗体联合检测试剂条的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及一种梅毒特异性IgM抗体与特异性总抗体联合检测试剂，尤其是 涉及一种采用胶体金免疫层析技术(immunochromatography)进行的梅毒特异性IgM抗体 与特异性总抗体联合检测试剂条及其制备方法。
背景技术：
梅毒(Syphilis)是一种由梅毒螺旋体(Tr印onema pallidum, TP)引起的性传播 性疾�。洳≡迨敲范韭菪澹袈菪蹇�。梅毒螺旋体主要通过性接触、输血、创口或 者胎盘等途径传播。梅毒螺旋体从感染区附近的淋巴结进入血液，播散全身，使机体几乎 所有的组织及器官受累，临床表现为全身性，可分为不同临床阶段，包括一期、二期、三期和 潜伏期。世界卫生组织(WHO)曾乐观地预言“由于有高敏度检测方法和高效的治疗方案， 梅毒是一种能够通过公共卫生措施得到成功控制的性传播性疾病”。遗憾的是，至今梅毒 依然是世界范围的公共卫生问题，缺乏有效的行政控制措施，每年全球大约有1200万的患 #，胃中 60 力■^女gii#。 ( :He￡ilth Protection Agency Centre for Infections. International Encyclopediaof Public Health-Syphi1 is[M]. London, UK :Health Protection Agency Centre，2008，289-297)事实上，梅毒的感染现状可能要比想象中的更 让人悲观。调查发现，梅毒感染者已经较广泛地存在于普通人群中。梅毒螺旋体尚不能进行体外培养，梅毒诊断与流行病学调查主要依赖于血清学试 验，包括特异性抗体和反应素检测两大类型。梅毒特异性抗体IgM(TP-IgM)和IgG(TP-IgG) 抗体分别于2周和4周后产生，即使患者经过足够治疗，其仍能长期存在，甚至终身不消失 (参见:Luis J F, Felipe U S, Santa G C, et al. Evaluation of a rapid strip and a particle agglutinationtests for syphilis diagnosis[J]. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease，2007，59 :123_126)；而另一种抗体物质反应素产生较晚，一般 在受感染后5 7周产生(参见林月圆.TPPA和TRUST在梅毒诊断中的价值与临床相关 问题[J].放射免疫学杂志，2009，22 (3) :295-297.)，而且晚期梅毒、梅毒治疗后期以及潜 伏梅毒可能阴性。因此梅毒特异性抗体的阳性率、敏感性显著高于反应素。TP-IgM是梅 毒感染后，机体最先出现的特异性抗体。只要有活的梅毒螺旋体存在，其TP-IgM将会维持
胃白勺TfC。 Martina H ^ ( #JAL :Martina H, Daan W N, Mart Μ, et al. Comparison of a Treponema pallidum IgM immunoblot with a 19S fluorescenttreponemal antibody absorption test for the diagnosis of congenital syphilis [J]. DiagnosticMicrobiology and Infectious Disease, 2007, 59 :61_66.)认为 TP-IgM 是 梅毒早期感染并活动的一项血清学标志，李步荣等(参见李步荣，贺军涛，张毅，等.梅 毒螺旋体IgM抗体检测的临床意义[J],第四军医大学学报，2007,28(16) :1495_1497) 认为TP-IgM与TP-DNA —样，代表着梅毒传染性指标。在排除近期抗梅毒治疗的前提下， TP-IgM若不转阴，提示体内可能残存梅毒螺旋体或治疗不彻底。TP-IgM阴转者随访时再转阳性，表明再次感染梅毒(参见Rawstron SA, Mehta S, Bromberg K, et al. Evaluation of a Treponema pallidum2specific IgMenzyme immunoassay and Treponema pallidum western blot antibody detection in the diagnosisofmaternal and congenital syphilis [J], Sex Transm Dis，2004，31 (2) : 123-126)。尽管 TP-IgM 阴性不能完全排除传 染性，但TP-IgM阳性必定提示该患者具有传染性。早期的血清学方法使用完整梅毒螺旋体作为抗原，研究和诊断用的TP是以TP感 染兔睾丸获得，这种方法花费大、获得的TP量少、不纯(混有宿主蛋白)，与其他病原体存 在交叉反应，因此假阳性也时有发生。随着分子生物学技术的普及及梅毒螺旋体抗原的相 继克�。刈榭乖τ糜诿范臼笛橐丫嚼丛蕉唷Ｄ壳把芯勘冉隙嗟腡P抗原有TPW7、 TPN47、TPNl5, TPN44. 5、TPN36、TP0453、TP0684 及 TPr 家族。采用重组 DNA 技术制备的重 组抗原可以克服完整TP抗原的缺点，能快速、经济地制备无限量特异重组TP抗原。梅毒特 异性抗体检测是梅毒确证试验，包括TPHA，TPPA, ELISA，FTA-ABS及Western-blot等，其特 异性均较高。然而，面对严峻的防制形式，不但需要特异准确的检测手段，还需要一种更简 便快捷的试剂来筛查，以便为临床和疾病防控提供对策。
发明内容本实用新型的目的是提供一种梅毒特异性IgM抗体与特异性总抗体联合检测试 剂条。本实用新型设有第1试剂条和第2试剂条；第1试剂条设有第1载体板、第1加样垫、第1胶体金垫、第1硝酸纤维膜(NC膜)、 梅毒特异性IgM抗体检测线、第1对照线和第1吸收垫；第1加样垫、第1胶体金垫、第1硝 酸纤维膜和第1吸收垫依次粘贴在第1载体板上表面，第1加样垫的一端设在第1胶体金 垫的一端上，第1胶体金垫的另一端设在第1硝酸纤维膜的一端上，第1吸收垫的一端设在 第1硝酸纤维膜的另一端上，梅毒特异性IgM抗体检测线和第1对照线依次设在第1硝酸 纤维膜上；在梅毒特异性IgM抗体检测线处包被抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体，在 第1对照线处包被羊抗梅毒抗原ΤΡΝ17和ΤΡΝ47的IgG抗体。第2试剂条设有第2载体板、第2加样垫、第2胶体金垫、第2硝酸纤维膜(NC膜)、 特异性总抗体检测线、第2对照线和第2吸收垫；第2加样垫、第2胶体金垫、第2硝酸纤维 膜和第2吸收垫依次粘贴在第2载体板上表面，第2加样垫的一端设在第2胶体金垫的一 端上，第2胶体金垫的另一端设在第2硝酸纤维膜的一端上，第2吸收垫的一端设在第2硝 酸纤维膜的另一端上，特异性总抗体检测线和第2对照线依次设在第2硝酸纤维膜上；在特 异性总抗体检测线处包被抗人Ig单克隆抗体或梅毒特异性抗原ΤΡΝ17和/或梅毒特异性 抗原ΤΡΝ47，在第2对照线处包被羊抗梅毒抗原ΤΡΝ17和TPN47IgG抗体。第1试剂条的第1加样垫与第2试剂条的第2加样垫之间可用玻璃纤维膜连接， 再放入试剂盒中(称单孔加样)，也可以不经玻璃纤维膜连接或搭桥(称双孔加样)。所述第1载体板和第2载体板可采用PVC板。以下给出本实用新型的制备方法，包括以下步骤1)制备梅毒重组抗原TPm7、TPN47采用基因克隆技术，PCR扩增编码梅毒螺旋体抗原的DNA，并插入大肠杆菌中使其表达，得梅毒重组抗原TPN17和TPN47 ；2)硝酸纤维素膜的点样在梅毒特异性IgM抗体检测线上包被抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体，在特 异性总抗体检测线处包被抗人Ig单克隆抗体或梅毒特异性抗原ΤΡΝ17和/或梅毒特异性 抗原ΤΡΝ47，晾干，所述抗人Ig单克隆抗体或梅毒特异性抗原ΤΡΝ17和/或梅毒特异性抗原 ΤΡΝ47的浓度可为1 4mg/mL，抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体的浓度可为1 4mg/ mL,羊抗梅毒抗原TPN17和TPN47IgG抗体由抗TPm7_IgG抗体与抗TPN47_IgG抗体按体积 比1 1混合，其终浓度为1 4mg/mL;三者点样量为lyL/cm;3)制备胶体金采用柠檬酸三钠还原方法制备25nm胶体金，取氯金酸ImL加入到IOOmL去离 子双蒸水中，得到的氯金酸浓度为0.01%，置于带冷凝装置的烧瓶中加热至沸腾，磁力加热 搅拌下加入柠檬酸三钠水溶液2. OmL，继续加热直至溶液呈葡萄酒色为止，冷却后置于 棕色瓶中4°C冰箱保存备用，所述柠檬酸三钠的浓度可为2% ；4)胶体金与TPm7、TPN47的标记胶体金与梅毒特异性抗原TPW7的标记取胶体金10mL，用0. lmol/L NaOH调至 ρΗ5· 4，加 100 μ g TPNl7,混勻，放置 5min,加入 5% BSA ImL 混勻，4°C、10000r/min 离心 lh, 弃上清，将沉淀用TBS缓冲液溶解至10mL，4°C、10000r/min离心lh，弃上清，沉淀用TBS稀 释至lmL，得胶体金标记的TPN17抗原。胶体金与梅毒特异性抗原TPN47的标记同上操作，得胶体金标记的TPN47抗原；将胶体金标记的TPN17抗原和胶体金标记的TPN47抗原混合后，均勻地涂于玻璃 纤维膜上，烘干，制备成胶体金垫；所述将胶体金标记的TPN17抗原和胶体金标记的TPN47抗原混合，最好胶体金标 记的TPN17抗原和胶体金标记的TPN47抗原以体积比1 (0. 2 5)混合；所述烘干的温 度可为37°C ；5)制备免疫层析检测条第1试剂条设有第1载体板、第1加样垫、第1胶体金垫、第1硝酸纤维膜(NC膜)、 梅毒特异性IgM抗体检测线、第1对照线和第1吸收垫；第1加样垫、第1胶体金垫、第1硝 酸纤维膜和第1吸收垫依次粘贴在第1载体板上表面，第1加样垫的一端设在第1胶体金 垫的一端上，第1胶体金垫的另一端设在第1硝酸纤维膜的一端上，第1吸收垫的一端设在 第1硝酸纤维膜的另一端上，梅毒特异性IgM抗体检测线和第1对照线依次设在第1硝酸 纤维膜上；在梅毒特异性IgM抗体检测线处包被抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体，在 第1对照线处包被羊抗梅毒抗原ΤΡΝ17和ΤΡΝ47的IgG抗体，用切条机切成条状，得梅毒特 异性IgM抗体与特异性总抗体联合检测试剂条的第1试剂条；将第2试剂条设有第2载体板、第2加样垫、第2胶体金垫、第2硝酸纤维膜(NC 膜)、特异性总抗体检测线、第2对照线和第2吸收垫；第2加样垫、第2胶体金垫、第2硝 酸纤维膜和第2吸收垫依次粘贴在第2载体板上表面，第2加样垫的一端设在第2胶体金 垫的一端上，第2胶体金垫的另一端设在第2硝酸纤维膜的一端上，第2吸收垫的一端设在 第2硝酸纤维膜的另一端上，特异性总抗体检测线和第2对照线依次设在第2硝酸纤维膜 上；在特异性总抗体检测线处包被抗人Ig单克隆抗体或梅毒特异性抗原ΤΡΝ17和/或梅毒特异性抗原TPN47，在第2对照线处包被羊抗梅毒抗原TPN17和TPN47IgG抗体，用切条机切 成条状，得梅毒特异性IgM抗体与特异性总抗体联合检测试剂条的第2试剂条。在第1加样垫和第2加样垫上可用连接膜(可采用玻璃纤维膜)将第1试剂条和 第2试剂条连接(称单孔加样)，也可以不经连接膜连接或搭桥(称双孔加样)，可将梅毒 特异性IgM抗体与特异性总抗体联合检测试剂条放入盒内，做成检测卡，与干燥剂一起装 入铝箔袋中，机器封口，密封保存。本实用新型提供了一种采用胶体金免疫层析技术建立梅毒特异性IgM抗体与特 异性总抗体联合快速检测试剂，可用于全血、血清、血浆及脑脊液等标本中梅毒特异性IgM 抗体和特异性总抗体的检测。检测时所需的标本量极�。恍枰厥庖瞧鳎庋壑苯优卸两� 果，且检测简便快速，特异性强，灵敏度高，准确可靠，成本低，应用广泛。
图1为本实用新型实施例的结构组成示意图；A为第1试剂条，B为第2试剂条，1 为连接膜(可采玻璃纤维膜)。图2为本实用新型实施例的组装示意图。在图2中，⑴为单孔加样组装图，(2) 为双孔加样组装图；A为第1试剂条，B为第2试剂条。图3为实验结果模式示意图。在图3中，(1)为使用前的示意图，(2) (4)为无 效试验(产品质量问题)，(5)为梅毒特异性总抗体，IgM抗体阳性，(6)为梅毒特异性总抗 体阳性，IgM抗体阴性；A为第1试剂条，B为第2试剂条；T为检测线，C为对照线。
具体实施方式
以下实施例将结合附图对本实用新型作进一步的说明。参见图1和2，本实用新型实施例设有第1试剂条A和第2试剂条B ；第1试剂条A设有第1载体板Al、第1加样垫A2、第1胶体金垫A3、第1硝酸纤 维膜(NC膜)A4、梅毒特异性IgM抗体检测线A6、第1对照线A7和第1吸收垫A8 ；第1加 样垫A2、第1胶体金垫A3、第1硝酸纤维膜A4和第1吸收垫A8依次粘贴在第1载体板Al 上表面，第1加样垫A2的一端设在第1胶体金垫A3的一端上，第1胶体金垫A3的另一端 设在第1硝酸纤维膜A4的一端上，第1吸收垫A8的一端设在第1硝酸纤维膜A4的另一端 上，梅毒特异性IgM抗体检测线A6和第1对照线A7依次设在第1硝酸纤维膜A4上；在梅 毒特异性IgM抗体检测线A6处包被抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体，在第1对照线 Α7处包被羊抗梅毒抗原TPNl7和ΤΡΝ47的IgG抗体。第2试剂条B设有第2载体板Bi、第2加样垫Β2、第2胶体金垫Β3、第2硝酸纤维 膜(NC膜)Β4、特异性总抗体检测线Β6、第2对照线Β7和第2吸收垫Β8 ；第2加样垫Β2、第 2胶体金垫Β3、第2硝酸纤维膜Β4和第2吸收垫Β8依次粘贴在第2载体板Bl上表面，第 2加样垫Β2的一端设在第2胶体金垫Β3的一端上，第2胶体金垫Β3的另一端设在第2硝 酸纤维膜Β4的一端上，第2吸收垫Β8的一端设在第2硝酸纤维膜Β4的另一端上，特异性 总抗体检测线Β6和第2对照线Β7依次设在第2硝酸纤维膜Β4上；在特异性总抗体检测线 Β6处包被抗人Ig单克隆抗体或梅毒特异性抗原ΤΡΝ17和/或梅毒特异性抗原ΤΡΝ47，在第 2对照线Β7处包被羊抗梅毒抗原ΤΡΝ17和TPN47IgG抗体。[0036]第1试剂条A的第1加样垫A2与第2试剂条B的第2加样垫B2之间可用连接膜 (可采用玻璃纤维膜)连接，再放入试剂盒中(称单孔加样)，也可以不经连接膜连接或搭 桥(称双孔加样)。所述第1载体板Al和第2载体板Bl可采用PVC板。以下给出本实用新型实施例的制备方法，包括以下步骤1)制备梅毒重组抗原TPW7、TPN47采用基因克隆技术，PCR扩增编码梅毒螺旋体抗原的DNA，并插入大肠杆菌中使其 表达，得梅毒重组抗原TPN17和TPN47。2)硝酸纤维素膜的点样在梅毒特异性IgM抗体检测线上包被抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体，在特 异性总抗体检测线处包被抗人Ig单克隆抗体或梅毒特异性抗原ΤΡΝ17和/或梅毒特异性 抗原ΤΡΝ47，晾干，所述抗人Ig单克隆抗体或梅毒特异性抗原ΤΡΝ17和/或梅毒特异性抗原 ΤΡΝ47的浓度可为1 4mg/mL，抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体的浓度可为1 4mg/ mL,羊抗梅毒抗原TPN17和TPN47IgG抗体由抗TPm7_IgG抗体与抗TPN47_IgG抗体按体积 比1 1混合，其终浓度为1 4mg/mL;三者点样量为lyL/cm。3)制备胶体金采用柠檬酸三钠还原方法制备25nm胶体金，取1 %氯金酸ImL加入到IOOmL去离 子双蒸水中，得到的氯金酸浓度为0.01%，置于带冷凝装置的烧瓶中加热至沸腾，磁力加热 搅拌下加入柠檬酸三钠水溶液2. OmL，继续加热直至溶液呈葡萄酒色为止，冷却后置于 棕色瓶中4°C冰箱保存备用，所述柠檬酸三钠的浓度可为2%。4)胶体金与TPm7、TPN47的标记胶体金与梅毒特异性抗原TPW7的标记取胶体金10mL，用0. lmol/L NaOH调至 ρΗ5· 4，加 100 μ g 丁卩附7，混勻，放置51^11，加入5%85八 ImL 混勻，4°C、10000r/min 离心 lh, 弃上清，将沉淀用TBS缓冲液溶解至10mL，4°C、10000r/min离心lh，弃上清，沉淀用TBS稀 释至lmL，得胶体金标记的TPW7抗原。胶体金与梅毒特异性抗原TPN47的标记同上操作，得胶体金标记的TPN47抗原。将胶体金标记的TPN17抗原和胶体金标记的TPN47抗原混合后，均勻地涂于玻璃 纤维膜上，烘干，制备成胶体金垫。所述将胶体金标记的TPN17抗原和胶体金标记的TPN47抗原混合，最好胶体金标 记的TPN17抗原和胶体金标记的TPN47抗原以体积比1 (0. 2 5)混合；所述烘干的温 度可为37°C。5)制备免疫层析检测条第1试剂条设有第1载体板、第1加样垫、第1胶体金垫、第1硝酸纤维膜(NC膜)、 梅毒特异性IgM抗体检测线、第1对照线和第1吸收垫；第1加样垫、第1胶体金垫、第1硝 酸纤维膜和第1吸收垫依次粘贴在第1载体板上表面，第1加样垫的一端设在第1胶体金 垫的一端上，第1胶体金垫的另一端设在第1硝酸纤维膜的一端上，第1吸收垫的一端设在 第1硝酸纤维膜的另一端上，梅毒特异性IgM抗体检测线和第1对照线依次设在第1硝酸 纤维膜上；在梅毒特异性IgM抗体检测线处包被抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体，在 第1对照线处包被羊抗梅毒抗原ΤΡΝ17和ΤΡΝ47的IgG抗体，用切条机切成条状，得梅毒特异性IgM抗体与特异性总抗体联合检测试剂条的第1试剂条；将第2试剂条设有第2载体板、第2加样垫、第2胶体金垫、第2硝酸纤维膜(NC 膜)、特异性总抗体检测线、第2对照线和第2吸收垫；第2加样垫、第2胶体金垫、第2硝 酸纤维膜和第2吸收垫依次粘贴在第2载体板上表面，第2加样垫的一端设在第2胶体金 垫的一端上，第2胶体金垫的另一端设在第2硝酸纤维膜的一端上，第2吸收垫的一端设在 第2硝酸纤维膜的另一端上，特异性总抗体检测线和第2对照线依次设在第2硝酸纤维膜 上；在特异性总抗体检测线处包被抗人Ig单克隆抗体或梅毒特异性抗原TPN17和/或梅毒 特异性抗原TPN47，在第2对照线处包被羊抗梅毒抗原TPN17和TPN47IgG抗体，用切条机切 成条状，得梅毒特异性IgM抗体与特异性总抗体联合检测试剂条的第2试剂条。再用连接膜(可采用玻璃纤维膜)在第1加样垫和第2加样垫处将第1试剂条和 第2试剂条连接(称单孔加样)，也可以不经连接膜连接或搭桥(称双孔加样)，可将梅毒 特异性IgM抗体与特异性总抗体联合检测试剂条放入盒内，做成检测卡，与干燥剂一起装 入铝箔袋中，机器封口，密封保存。以下给出免疫层析法检测患者的临床标本取稀释待检标本(全血、血清、血浆、脑脊液)120 μ L，加样于免疫层析检测条样 品处(单孔加样)，静置20min观察结果；或各取稀释待检标本(全血、血清、血浆、脑脊 液)60yL，加样于梅毒特异性IgM抗体与特异性总抗体联合检测试剂条样品处(双孔加 样)，静置20min观察结果。只在两条梅毒特异性IgM抗体与特异性总抗体联合检测试剂条 对照区各有一紫红色条带出现，则判为阴性；在两梅毒特异性IgM抗体与特异性总抗体联 合检测试剂条的检测区T及对照区C均有一紫红色条带出现，则判为阳性；加样检测后，检 测区和对照区均不出现紫红色条带，为无效结果(见图3)。其中，待检标本(全血、血清、血 浆、脑脊液)稀释液采用生理盐水，稀释倍数0 50倍。以下给出梅毒特异性IgM抗体与特异性总抗体联合检测试剂条性能检定1)外观检查白色包被反应膜平整、干净无污染斑点、无裂缝，胶带无开胶，无切 斜现象。2)阳性标本符合率用TP-IgM和梅毒特异性总抗体的不同滴度的阳性参比血清 各50份采用梅毒特异性IgM抗体与特异性总抗体联合检测试剂条检定，计算阳性符合率。 梅毒特异性总抗体的阳性参比血清采用采用TPPA(日本富士株式会社)法确定，TP-IgM抗 体的阳性参比血清采用采用FTA-ABS(德国欧蒙公司)法确定。3)阴性标本符合率用50份阴性参比血清检定，计算阳性符合率。梅毒特异性总 抗体的阴性参比血清的确定采用TPPA(日本富士株式会社)法，TP-IgM抗体的阴性参比血 清采用采用FTA-ABS(德国欧蒙公司)法确定。4)灵敏度检测用卫生部室内质控血清检测，最低检出限度应小于或等于4NCU/ mL，与TPPA(日本富士株式会社)相当。5)批内差异同一批次梅毒特异性IgM抗体与特异性总抗体联合检测试剂条，用 特征性血清检测，要求阳性血清检测结果显示色带的颜色深浅一致，阴性血清检测的结果 阴性。6)批间差异不同批次梅毒特异性IgM抗体与特异性总抗体联合检测试剂条，用 特征性血清检测，要求阳性血清检测结果显示色带的颜色深浅一致，阴性血清检测的结果阴性。7)干扰试验检测结果不受标本溶血(η = 50)、脂血(η = 50)和黄疸(η = 50) 的干扰。血清(或血浆)来自本申请人临床标本。8)交叉反应采用梅毒特异性IgM抗体与特异性总抗体联合检测试剂条，进行系 统性红斑狼疮(η = 30)、类风湿病(η = 30)、免疫性肝炎(η = 30)等自身免疫系统疾病的 检测，未发现交叉反应。自身免疫系统疾病的血清来自本申请人临床确诊患者。9)稳定性检测应用Arrhenius法则，将梅毒特异性IgM抗体与特异性总抗体联 合检测试剂条放置37°C 20天后检测，以上各项指标无显著变化，确保成品在室温干燥条件 下保存，有效期为18个月。以下给出具体实施例。实施例1第1试剂条A在硝酸纤维素膜(NC膜)IgM检测线上包被抗人IgM特异性片段μ 链单克隆抗体，第2试剂条B的特异性总抗体检测线上包被抗人Ig单克隆抗体，在对照线 处C包被羊抗梅毒抗原ΤΡΝ17和ΤΡΝ47抗体，室温晾干，密封室温保存备用。其中，抗人IgM 特异性片段μ链单克隆抗体、抗人Ig单克隆抗体的浓度为lmg/mL，羊抗梅毒抗原(TPN17 和TPN47) IgG抗体由抗TPm7-IgG抗体与抗TPN47_IgG抗体按体积比1 1混合，其终浓 度为lmg/mL ；三者点样量为1 μ L/cm。将已纯化的金标记的梅毒重组抗原TPN17和TPN47以体积比1 1混合后，均勻 地涂于玻璃纤维纸上，在37°C烘干，制备成金胶体垫，密封备用。将固相化的纤维膜与胶体 金结合的玻璃纤维、吸水纸等按一定顺序，通过PVC不干胶底板组合在一起，用切条机切成 一定宽度检测条。再用玻璃纤维纸在加样垫处将第1试剂条和第2试剂条连接。或将第1 试剂条和第2试剂条放入相应规格的塑料盒内，做成检测卡。把梅毒特异性IgM抗体与特异 性总抗体联合检测试剂条或检测试剂盒与干燥剂一起装入铝箔袋中，机器封口，密封保存。取1 10稀释的待检标本血清120 μ L，加样于梅毒特异性IgM抗体与特异性总抗 体联合检测试剂条加样区，静置20min观察结果。只在梅毒特异性IgM抗体与特异性总抗 体联合检测试剂条对照区有一紫红色条带出现，则判为阴性；在检测区及对照区均有一紫 红色条带出现，则判为阳性；加样检测后，检测区T和对照区C均不出现紫红色条带，为无效 结果。(参见图3)实施例2与实施例1相似，区别在于金胶体垫、梅毒特异性总抗体检测线仅由TPW7组成， 不含有TPN47。结果判断与实施例1相同。实施例3与实施例1相似，区别在于金胶体垫、梅毒特异性总抗体检测线仅由TPN47组成， 不含有TPm7。结果判断与实施例ι相同。实施例4与实施例1相似，区别在于待检标本为脑脊液标本，结果判断与实施例1相同。实施例4性能验证试验按实施例1的方案制备梅毒特异性IgM抗体与特异性总抗体联合 快速检测试剂条，然后进行性能验证。[0079]1)外观检查白色包被反应膜平整、干净无污染斑点、无裂缝，胶带无开胶，梅毒 特异性IgM抗体与特异性总抗体联合快速检测试剂条宽度在3士0. 1mm，无切斜现象。2)阳性标本符合率50份经FTA-ABS (德国欧蒙公司)检测确定的TP-IgM阳性参 比血清，采用梅毒特异性IgM抗体与特异性总抗体联合快速检测试剂条检出TP-IgM阳性50 份，阳性标本符合率100% ；而50份经梅毒螺旋体特异性抗体明胶凝集试验(TPPA)(日本 富士株式会社)检测确定的梅毒特异性总抗体阳性参比血清，采用梅毒特异性IgM抗体与 特异性总抗体联合快速检测试剂条检出梅毒特异性抗体49份，阳性标本符合率98%。3)阴性标本符合率50份经FTA-ABS (德国欧蒙公司)检测确定的TP-IgM阴性参 比血清，采用梅毒特异性IgM抗体与特异性总抗体联合快速检测试剂条检出TP-IgM阴性50 份，阴性标本符合率100% ；而50份经梅毒螺旋体特异性抗体明胶凝集试验(TPPA)(日本 富士株式会社)检测确定的梅毒特异性总抗体阴性参比血清，采用梅毒特异性IgM抗体与 特异性总抗体联合快速检测试剂条检出梅毒特异性抗体50份，阴性标本符合率100%。4)灵敏度检测用卫生部室内质控血清(批号200902001)检测，最低检出限度 4NCU/mL。5)批内差异同一批次梅毒特异性IgM抗体与特异性总抗体联合快速检测试剂 条，用特征性阳性血清(高、中、低血清)检测，相同滴度检测结果显示色带的颜色深浅一 致，阴性血清检测的结果阴性。6)批间差异不同批次梅毒特异性IgM抗体与特异性总抗体联合快速检测试剂 条，用特征性阳性血清(高、中、低血清)检测，相同滴度检测结果显示色带的颜色深浅一 致，阴性血清检测的结果阴性。7)干扰试验检测结果不受标本溶血(η = 50)、脂血(η = 50)和黄疸(η = 50) 的干扰。8)交叉反应采用梅毒特异性IgM抗体与特异性总抗体联合快速检测试剂条或检 测盒，进行系统性红斑狼疮(η = 30)、类风湿病(η = 38)、免疫性肝炎(η = 40)等自身免 疫系统疾病的检测，未发现交叉反应。9)稳定性检测将梅毒特异性IgM抗体与特异性总抗体联合快速检测试剂条放置 370C 20天后检测，以上各项指标无显著变化。
权利要求梅毒特异性IgM抗体与特异性总抗体联合检测试剂条，其特征在于设有第1试剂条和第2试剂条；第1试剂条设有第1载体板、第1加样垫、第1胶体金垫、第1硝酸纤维膜、梅毒特异性IgM抗体检测线、第1对照线和第1吸收垫；第1加样垫、第1胶体金垫、第1硝酸纤维膜和第1吸收垫依次粘贴在第1载体板上表面，第1加样垫的一端设在第1胶体金垫的一端上，第1胶体金垫的另一端设在第1硝酸纤维膜的一端上，第1吸收垫的一端设在第1硝酸纤维膜的另一端上，梅毒特异性IgM抗体检测线和第1对照线依次设在第1硝酸纤维膜上；在梅毒特异性IgM抗体检测线处包被抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体，在第1对照线处包被羊抗梅毒抗原TPN17和TPN47的IgG抗体；第2试剂条设有第2载体板、第2加样垫、第2胶体金垫、第2硝酸纤维膜、特异性总抗体检测线、第2对照线和第2吸收垫；第2加样垫、第2胶体金垫、第2硝酸纤维膜和第2吸收垫依次粘贴在第2载体板上表面，第2加样垫的一端设在第2胶体金垫的一端上，第2胶体金垫的另一端设在第2硝酸纤维膜的一端上，第2吸收垫的一端设在第2硝酸纤维膜的另一端上，特异性总抗体检测线和第2对照线依次设在第2硝酸纤维膜上；在特异性总抗体检测线处包被抗人Ig单克隆抗体或梅毒特异性抗原TPN17和/或梅毒特异性抗原TPN47，在第2对照线处包被羊抗梅毒抗原TPN17和TPN47IgG抗体。
2.如权利要求1所述的梅毒特异性IgM抗体与特异性总抗体联合检测试剂条，其特征 在于第1试剂条的第1加样垫与第2试剂条的第2加样垫之间用玻璃纤维膜连接。
3.如权利要求1所述的梅毒特异性IgM抗体与特异性总抗体联合检测试剂条，其特征 在于所述第1载体板和第2载体板为PVC板。
专利摘要梅毒特异性IgM抗体与特异性总抗体联合检测试剂条，涉及一种梅毒特异性IgM抗体与特异性总抗体联合检测试剂。设有2条试剂条，2条试剂条均设有载体板、加样垫、胶体金垫、硝酸纤维膜、对照线和吸收垫；第1、2条试剂条分别设有梅毒特异性IgM抗体检测线和特异性总抗体检测线。制备梅毒重组抗原TPN17、TPN47；硝酸纤维素膜的点样；制备胶体金；胶体金与TPN17、TPN47的标记；制备免疫层析检测条。可用于全血、血清、血浆及脑脊液等标本中梅毒特异性IgM抗体和特异性总抗体的检测。检测时标本量极�。恍杼厥庖瞧鳎庋壑苯优卸两峁觳饧虮憧焖伲匾煨郧浚槊舳雀撸既房煽浚杀镜停τ霉惴�。
文档编号G01N33/532GK201697920SQ20102019888
公开日2011年1月5日 申请日期2010年5月19日 优先权日2010年5月19日
发明者张忠英, 张长弓, 杨天赐, 林丽蓉 申请人:厦门大学附属中山医院
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