专利名称：抗人心肌肌钙蛋白i单克隆抗体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新的抗人心肌肌钙蛋白I(cTnI)单克隆抗体及其应用。
背景技术：
急性心肌梗死(AMI)是一种发病急、病情危重的疾�。枰笛槭艺锒峡焖�、准确，而检测心肌肌钙蛋白具有方便快捷、敏感性高、特异性强、持续时间长等优点。1987年，Cummions等首次报道了使用放射免疫法测定周围血中心肌肌钙蛋白浓度诊断急性心肌梗死。cTnI仅在心肌中表达，血液中其浓度增高，则高度特异性地表明心肌损伤。因此cTnI是心肌特异的抗原。cTnI对AMI的诊断其敏感性与特异性均超过广泛使用的CK-MB等标志物，是一种新的心肌损伤特异性标记物。
cTnI本身生化性质的复杂性和在患者外周血的存在形式，使得cTnI检测试剂的测定值之间存在着差异。如美国临床病理学会(CAP)在1997年对检测cTnI的Access、OpusPlus和Stratus三个系统进行调查，结果发现平均cTnI浓度由于使用的分析系统差异而有实质性的不同。Access的测定值最低，有些甚至比OpusPlus结果低20倍。造成对同一份样品测量差异的原因之一是试剂盒中提供的抗体识别不同的决定簇。cTnI仅具有弱的免疫原性，增加了制备单克隆抗体的难度。在AMI病人中90％以上cTnI以cTnI-TnC复合物形式存在，N-端和C-端对蛋白水解酶作用敏感易受蛋白水解酶作用，最稳定区域在28～110氨基酸残基之间，能够识别这段稳定区的抗体可以提高cTnI检测的敏感性和可重复性，有助于提高cTnI检测的标准化，制备针对人心肌肌钙蛋白I特定区段抗原决定簇的单克隆抗体具有很强的实用价值和广阔的市场前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种特异性高的抗人心肌肌钙蛋白I单克隆抗体。
本发明的另一目的是提供一科能产生特异性高的抗人心肌肌钙蛋白I单克隆抗体的杂交瘤细胞系。
本发明的目的是这样实现的采用基因工程表达并纯化的人心肌肌钙蛋白I免疫小鼠。取其腺细胞与鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合，筛选出具有稳定抗体滴度的克�。玫侥芪榷ǚ置诳谷思〖「频鞍譏的单克隆抗体的杂交瘤细胞系6G3、6A6和5H9。其中6G3、6A6为IgG1，5H9为IgG2B。
对上述杂交瘤细胞用常规培养液培养，可大量生产抗人心肌肌钙蛋白I的单克隆抗体；也可使用同系小鼠体内诱生法，分泌获得抗人心肌肌钙蛋白I的单克隆抗体。
本发明的抗人心肌肌钙蛋白I单克隆抗体具有稳定性好、特异性高的优点。该单克隆抗体能识别cTnT的N-端稳定区段即28-42氨基酸肽段的不同抗原决定簇，利用此特点，可用于制作心肌损伤检测试剂盒。该试剂盒可用诊断伴随cTnT特异性升高的疾�。缧募」Ｈ�、心绞痛、心肌炎等疾病。
下面对本发明作进一步介绍。
1.免疫小鼠由于cTnI分子量�。挥兄质籼匾煨裕锛涿庖叻从θ酰颐遣捎眯〖亮�、长时程免疫方法，并采用了脾内免疫，以达到较好的免疫效果。用基因工程表达并纯化的人心肌肌钙蛋白I免疫BALB/c小鼠，免疫方案如下免疫次数 间隔时间免疫剂量 免疫途径第一次免疫50μg/400μl/只腹腔注射第二次免疫14天30μg/100μl/只脾内注射第三次免疫10天60μg/200μl/只皮下多点注射第四次免疫14天60μg/200μl/只皮下多点注射冲击免疫 30天30μg/100μl/只尾静脉注射2.骨髓瘤细胞的准备在细胞融合7-10天前复苏骨髓瘤细胞SP2/0，保证细胞在融合时正处于对数生长期，活力最好。
3.细胞融合冲击免疫后三天进行融合。在融合前一天，取6-8周大的BALB/c小鼠拉颈处死，按照无菌操作规程取腹腔巨噬细胞和脾细胞作为滋养细胞铺96孔培养板。一天后，取免疫小鼠的脾脏获得脾细胞，用1640培养液洗涤一次。将上述培养的骨髓瘤细胞SP2/0离心后用1640培养液洗涤一次后与所取脾细胞混合，细胞数目之比约为1∶8-1∶12，再离心洗涤一次，去上清，充分分散沉淀物，向沉淀物中按体积比1∶1.5-1∶2.5加入浓度为50％的聚乙二醇1000，摇0.5-2分钟，再静置一分钟后离心去上清夜，再加入合适体积的HAT培养基，将融合细胞按100ul/孔加入至96孔细胞培养板中。将该板放置在浓度为5％的二氧化碳培养箱中，37℃，100％湿度下培养，从第五天开始，每隔2-3天每孔半量换液一次。
当每孔内细胞增殖到铺满一半底部面积的时候，取培养上清液，用ELISA方法检测抗人心肌肌钙蛋白1抗体滴度。将抗人心肌肌钙蛋白I抗体阳性、滴度高的杂交瘤细胞转移到另一块96孔板中进行克隆化。该杂交瘤细胞通过有限稀释使平均每空孔中只含有一个单一杂交瘤细胞，进行克隆化培养。克隆过程中采用1640完全培养基，并用ELISA检测克隆细胞孔上清培养液中抗体滴度。对抗体滴度高的孔继续进行克隆2-4次，直至所有克隆孔均成阳性，筛选具有稳定抗体滴度的克隆作为产生抗人心肌肌钙蛋白I抗体的杂交瘤细胞系。
4.单克隆抗体的制备用常规培养液培养上述的杂交瘤细胞，可大量生产单克隆抗体。或使用同系小鼠体内诱生法，将一定杂交瘤细胞注入小鼠腹腔中，在注射一周前，用石蜡油注射该小鼠。这样杂交瘤细胞就在小鼠腹腔中繁殖，大量分泌抗人心肌肌钙蛋白I抗体，2-3周后一次或多次收集腹水，离心除去固体成分，其上清液即含有抗人心肌肌钙蛋白I单克隆抗体。通过正辛酸法或Protein A亲和层析法进一步纯化抗人心肌肌钙蛋白I的单克隆抗体。
具体实施例方式
以下实施例将有助于本领域的普通技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。
1.免疫小鼠用实验室基因工程表达并纯化的人心肌肌钙蛋白I蛋白免疫BALB/c小鼠，第一次腹腔注射，每只50μg；第二次脾内免疫，每只小鼠30μg；此后采用皮下多点注射，每只小鼠60μg。用ELISA测血清抗体滴度，达到一定值后，冲击免疫一次，三天后取免疫小鼠的脾细胞以备融合。
2.骨髓瘤细胞的准备在细胞融合7-10天前复苏SP2/0肿瘤细胞，保证细胞在融合时正处于对数生长期，活力最好。
3.细胞融合在融合前一天，取6-8周大的BALB/c小鼠拉颈处死，按照无菌操作规程取腹腔巨噬细胞和脾细胞作为滋养细胞。一天后，取免疫小鼠的脾脏获得脾细胞，用1640培养液洗涤一次。将上述培养的骨髓瘤细胞SP2/0离心后用1640培养液洗涤一次后与所取脾细胞混合，细胞数目之比约为1∶10，再离心洗涤一次，去上清，充分分散沉淀物，向沉淀物中按体积比1∶2加入浓度为50％的聚乙二醇PEG1000，摇一分钟，再静置一分钟后离心去上清夜，再加入合适体积的HAT培养基，将融合细胞按100ul/孔加入至96孔细胞培养板中。将该板放置在浓度为5％的二氧化碳培养箱中，在温度为37℃中培养，从第五天开始，每隔2-3天用每孔半量HAT液换液一次。
当每空内细胞增殖到铺满一半底部面积的时候，取培养液上清，用ELISA测抗人心肌肌钙蛋白I抗体滴度。将抗人心肌肌钙蛋白I抗体阳性、滴度高的杂交瘤细胞转移到另一块96孔板中进行克隆。通过一种经有限稀释该杂交瘤细胞使一孔中只含有一个单一杂交瘤细胞进行克隆化培养。克降过程中采用1640培养液，并用ELISA检测克隆细胞孔上清培养液中抗体滴度。对抗体滴度高的孔继续进行克隆3次，直至所有克隆孔均成阳性，筛选具有稳定抗体滴度的克隆作为产生抗人心肌肌钙蛋白I抗体的杂交瘤细胞系6G3、6A6、5H9。
4.单克隆抗体的制备用常规培养液培养上述的杂交瘤细胞。大量生产单克隆抗体，使用同系小鼠体内诱生法。将一定杂交瘤细胞注入同系小鼠腹腔中，在注射一周前，用石蜡油注射该小鼠，这样杂交瘤细胞就在小鼠腹腔中繁殖，大量分泌抗人心肌肌钙蛋白I抗体，2至3周后收集腹水，离心除去固体成分，其上清液即含有抗人心肌肌钙蛋白I单克隆抗体。通过Protein A亲和层析法进行纯化。
5.ELISA分别用天然cTnI蛋白和表达的人心肌肌钙蛋白I以及合成的N端一段稳定区28-42氨基酸肽段S28-42作为抗原，用间接ELISA方法检测杂交瘤培养上清，筛选阳性克隆。
6.结果采用小剂量、长时程免疫方法，以及脾内免疫方法用基因工程表达的人心肌肌钙蛋白I免疫BALB/c小鼠，融合鼠脾细胞和骨髓瘤细胞；采用ELISA鉴定筛选阳性克隆并连续克隆化直至100％孔阳性，得到3株能稳定分泌抗人心肌肌钙蛋白I N-端稳定区的特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别为6G3、6A6和5H9。
7.通过以下方法进行抗人cTnI单克隆抗体的特异性鉴定(1)ELISA结果 杂交瘤细胞株6G3、6A6和5H9的培养上清均与基因工程表达的cTnI蛋白和天然cTnI蛋白反应，用合成的cTnI的N-端肽S28-42检测，三种杂交瘤细胞株也都与S28-42反应。说明该三株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体针对cTnI蛋白稳定区段。
其中，肽段S28-42的序列如下CAYATEPHAKKKSKIS-NH2。
(2)Western blot结果 用基因工程表达cTnI蛋白和天然cTnI蛋白作为抗原，三株抗体分别做为一抗，经Western blot鉴定在分子量为28 KU处有特异性抗原-抗体结合的条带。进一步证明杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体是特异性结合cTnI蛋白的单克隆抗体。
(3)竞争ELISA结果 用天然cTnI蛋白作为抗原用竞争ELISA测定三株单抗之间的增值反应。三种单抗相互之间都有明显的增值反应。说明三种单克隆抗体针对cTnI上不同的抗原决定簇。
8.具体应用(1)利用三株单克隆抗体能够分别识别cTnI蛋白不同抗原决定簇的特点，可以用于心肌损伤检测试剂盒的开发。具体实施如下可以用与鼠异源(如兔)的多克隆抗体包被，把三种单克降抗体用生物素标记后选择其中之一用于检测从而制备成心肌损伤检测试剂盒。或者选用一种单克隆抗体作为捕捉抗体，另一种生物素标记的单克隆抗体作为检测抗体制备成为检测试剂盒。
(2)病人血清检测采用双抗夹心ELISA法检测病人血清。用纯化的大鼠多抗包被酶标板，加入待检测心肌损伤病人血清样本及正常人对照血清样本，然后依次加入生物素标记6G3抗体，HRP标记的链霉亲和素，显色。对于检测样品，结果和实际结果符合率为96％。
权利要求
1.一种能持续稳定分泌抗人心肌肌钙蛋白I的单克隆抗体的杂交瘤细胞系6G3、6A6和5H9，它们由下述步骤获得采用基因工程表达并纯化的人心肌肌钙蛋白I免疫小鼠，取其腺细胞与鼠骨髓瘤细胞SP2/O进行融合，筛选出具有稳定抗体滴度的克隆。
2.一种制备权利要求1所述的杂交瘤细胞系的方法，其特征在于采用基因工程表达并纯化的人心肌肌钙蛋白I免疫小鼠，取其脾细胞与鼠骨髓瘤细胞SP2/O进行融合，筛选出能稳定分泌抗人心肌肌钙蛋白I的单克隆抗体的杂交瘤细胞。
3.一种产生上述抗人心肌肌钙蛋白I单克隆抗体的方法，其特征在于对权利要求1所述的杂交瘤细胞用常规培养液培养，或者用同系小鼠体内诱生法，获得抗人心肌肌钙蛋白I的单克隆抗体。
4.如权利要求3所述的抗人心肌肌钙蛋白I的单克隆抗体在制备心肌损伤检测用试剂盒中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种抗人心肌肌钙蛋白I(cTnI)的单克隆抗体及其杂交瘤细胞系，特点是特异性敏感性高，制备方法简单。本发明的单克隆抗体能识别人心肌肌钙蛋白I(cTnI)的N－端稳定区段即28－42氨基酸肽段S
文档编号G01N33/53GK1644685SQ200410093480
公开日2005年7月27日 申请日期2004年12月23日 优先权日2004年12月23日
发明者朱乃硕, 李 瑞 申请人:复旦大学
专业数控铣床产品供应商
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