专利名称：一种同时测定多种抗hiv药物血浆浓度方法
技术领域：
本发明属于医学检验领域，涉及体内药物的分析测定方法。具体涉及一种可同时测定多种抗HIV药物血浆浓度方法。
背景技术：
艾滋�。椿竦眯悦庖呷毕葑酆险�(acquired immunodeficiency syndrome, AIDS)于1981年美国报道首例后开始在世界范围内迅速蔓延。其后的一段时间由于缺乏有效的治疗手段而存在着很高的病死率，在高效抗反转录病毒联合治疗(high activeantiretroviral therapy, HAART)的方案提出后，艾滋病的发病率和病死率有了明显下降。毋庸置疑，HAART的出现是艾滋病治疗史上一个重要的里程碑，通过这种治疗方案， 可将患者体内的HIV载量控制在现有检测方法无法检测的水平(< 50COpieS/ml)，从而延缓HIV(human inmunodeficiency virus)感染的临床进程，重建机体的免疫功能，改善患者预后，提高患者生存质量。但目前，几乎所有的抗反转录病毒药物均会引起相应的不良反应 (adverse reaction, AR)，这也是患者改变抗病毒治疗方案和停药的主要原因。此外，抗反转录病毒药物也常会在临床使用一段时间后发生耐药，进而导致治疗失败，此现象多与血浆抗反转录病毒药物浓度水平相关。作为国内常用的非核苷类反转录酶抑制剂之一的依非韦伦，其半衰期长G0-55小时)，患者每天服用一次即可有效抑制HIV复制，也有利于保持临床治疗用药的依从性。但在临床实践中，发现不少患者服用EFV后可能出现血浆药物浓度偏低而诱使HIV产生耐药。已有的研究表明，当EFV血浆药物浓度低于lmg/L时，治疗失败的概率要显著高于血浆EFV浓度在lmg/L以上的患者。而将EFV治疗浓度的下限值提升至ang/L可获得比lmg/L更高的治疗有效应答率。对于我国而言，由于目前国内抗艾滋病药物均来自国外，相应的药物代谢动力学参数以国外人群如高加索人种为主进行研究，而群体遗传基因组学研究表明，国内人群CYP2B6单核苷酸多态性与国外存在较大差异。因为 CYP2B6是EFV代谢的主要细胞色素P450酶系统成分，所以，我国人群EFV药物代谢水平可能不同于国外，国内患者服用EFV的不良反应以及临床疗效与血药浓度之间的关系有待进一步研究。高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)是以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各待检测成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对待分析物的检测。质谱分析是一种测量离子荷质比(电荷-质量比)的分析方法， 其基本原理是使待检测物品中各组分在离子源中发生电离，生成不同荷质比的带电荷的离子，经加速电场的作用，形成离子束，进入质量分析器。在质量分析器中，再利用电场和磁场使发生相反的速度色散，将它们分别聚焦而得到质谱图，从而确定其质量。目前，已有的多种针对抗HIV药物的分析检测方法，包括液相色谱-紫外光 (HPLC-UV)检测以及液相色谱-质谱(HPLC/MS/MQ联用检测，均存在样品处理方法繁琐以及检测灵敏度不高、不能同时检测多个国内临床常用的抗反转录病毒药物的缺陷。
目前已有的针对EFV浓度检测的临床研究中，多数研究只检测某一时段的患者血浆药物浓度以评估长期的治疗效果，而忽略了药物浓度会随着时间的推移而发生变化；还有研究则在临床研究招募受试者时未将初始接受抗病毒治疗患者和抗病毒治疗失败患者区分，此种研究基线存在异质性，并且可能会干扰研究结果的分析。
发明内容
本发明的目的是克服已知技术的缺陷，提供一种简便、快速、灵敏的可同时测定多种抗HIV药物血浆浓度方法本发明采用蛋白沉淀联合液液萃取的方法处理临床标本，然后建立液相色谱-质谱联用(LC-MS/MS法)可同时测定多种临床常用的抗HIV药物血浆浓度方法。本方法无需昂贵的设备和试剂，具有操作简便，快速，灵敏度高，血浆用量少，成本低等优点，并且能同时定量测定人血浆中齐多夫定(AZT)、拉米夫定(3TC)、司他夫定 (d4T)、奈韦拉平(NVP)、依非韦伦(EFV)、洛匹那韦(LPV)和利托那韦(RTV) 7种抗反转录病毒药物的浓度，适合常规治疗药物浓度监测。具体的，本发明采用LC-MS/MS法同时测定7种常用抗反转录病毒药物血浆浓度的方法。包括下述步骤1、血浆样品经碱化沉淀蛋白后，用乙酸乙酯液-液萃取；2、以甲醇/0. 1 % 甲酸水溶液(80 20)为流动相，Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18(150mmX4. 6mm, 5 μ m)柱分离；3、采用电喷雾电离源，以多反应监测(MRM)方式进行正离子检测；用于定量分析的离子对629. 6 — 155. 2 (洛匹那韦),721.4- 268. 2 (利托那韦)， 515.2 — 276.2(内标替米沙坦)，拉米夫定(230.2 — 112. 2)，司他夫定(225. 0 ^ 126. 8)， 奈韦拉平(267. 0 — 226. 0)，齐多夫定(268. 0 — 127. 0)，依非韦伦(316. 0 — 243. 9)。检测结果表明，测定血浆中3TC、d4T、AZT线性范围为20-3200ng · mL, EFV和 NVP线性范围为40-6400ng · mL，LPV线性范围为62. 5-10000ng · mL，RTV的线性范围为 12. 5-2000ng · mL, r均大于0.99。平均日内和日间精密度均小于15 %，准确率在85 %到 115%之间。本发明检测方法选择性强、灵敏度高，重现性好、能同时快速、准确测定人血浆中 3TC、d4T、AZT、EFV、NVP、LPV和RTV浓度，为临床开展药物浓度与疗效相关性研究奠定了方法学基础。
图1内标和7种待检测的抗HIV药物母/子离子质谱图分布。图22A为空白血浆色谱图；2B为加入了定量下限值混合标准液的空白血浆；2C， 2D，2E分别为服用了抗HIV治疗药物的临床患者血浆检测图，图中显示抗反转录病毒药物NVP，3TC，d4T，AZT, EFV, LPV, RTV和IS的保留时间分别为3. 55,2. 67,3. 00,3. 22,6. 62、10. 66,7. 68和3. 23分钟。每个样品分析时间为12分钟。
具体实施例方式实施例11、选定试剂与材料标准品拉米夫定，200mg，批号G0F114，齐多夫定，200mg，批号H0M63，奈韦拉平，200mg，批号FOD159,依非韦伦，200mg，批号F0G376，司他夫定，200mg，批号F0E050， 以上5个标准品由U. S Pharmacopeia(USP)公司提供；洛匹那韦(纯度为98 % )， lOOmg，批号20080801，由PI Chemicals公司提供；利托那韦，80mg，批号002VK3，由 EUPharmacopeia(EUDP)提供；内标替米沙坦(纯度为99. 5 % )，批号040511，由北京柏雅方舟医药科技有限公司和天津裕龙药业有限公司研发；乙腈、甲醇均为Merck公司 (MerckLtd. , Germany)的色谱纯试剂，分析纯乙酸铵由国药集团(Sinopharm chemical Ltd.，China.)提供，水为 Milli-Q Gradient 超纯水。2.采用主要仪器HPLC系统(购自Shimadzu，Kyoto, Japan)由双元压力泵(LC_20AD)、自动进样器 (SIL-HTC)以及在线脱气机(D⑶-20A3 prominence)和柱温箱(CT010AVP)构成。色谱柱 Eclipse XDB-C18(150mmX4. 6mm ID,5ym)和预柱 C18 柱(12. 5mmX 4. 6mm ID，5 μ m)购自美国Agilent公司(Agilent Company USA)。API3200三重串联四极杆质谱仪，电喷雾电离源(ESI)购自美国应用生物公司(Applied Biosystems，ABI，USA)，分析软件为ABI公司的 Analyst 质谱工作站(Analyst software version 1.4.2) ；Eppendorf 5415R 低温高速离心机，德国艾本德公司产品；TECHNE氮吹仪，英国TECHNE公司生产。3.实验方法3. 2. 1设定色谱条件流动相为0. 1 %甲酸水溶液-甲醇QO 80，ν/ν)；流速为0. 5mL · mirT1 ；柱温 30°C，双元泵压力为4. 2Mpa，分析时间为每个样品12min，流动相用0. 45 μ m滤膜过滤。进样量为10yL，自动进样器内温度保持在4°C，采用自动进样方式。3. 2. 2设定质谱条件电喷雾电离(ESI)，采用正电荷检测模式。离子源条件为温度550°C，源喷射电压4500V，气帘气压35psi，CAD :6psi，Gas 1 :40psi，Gas 2 :50psi，扫描方式为多反应监测(MRM)，用于定量反应的离子反应分别为为629.6 — 155.2(洛匹那韦)， 721. 4 — 268. 2 (利托那韦)和 515. 2 — 276. 2 (内标替米沙坦)，3TC(230. 2 — 112. 2)， d4T (225. 0 — 126. 8)，NVP (267. 0 — 226. 0)，AZT (268. 0 — 127. 0)，EFV (316. 0 — 243. 9)，3. 3溶液配制3. 3. 1标准母液的配制AZT，d4T，3TC，NVP, LPV和RTV等六种分析物用50%甲醇配成1. Omg · mL—1的储液；EFV用70%甲醇配制成1. Omg · mL—1储液；内标储液则用50%甲醇配制为0. Img · mL—1。所有的储液均保存于_20°C冰箱中。3. 3. 2标准曲线和质控样本的制备用50%的甲醇将上述标准储液分别配制为浓度梯度如下的标准曲线系列d4T，3TC 和 AZT 200，400，800，1600，3200，6400，12800， 25600,32000ng ‘ mL_1 ；EFV 和 NVP 为 400，800，1600，3200，6400，12800，25600，51200 和 64000ng · ml/1 ；LPV 为 625，800，6250，8000，12500，25000，50000，80000 和 IOOOOOng · πι Λ RTV 为 125，150，1250，1500，2500，5000,10000,15000 和 20000ng Γ1 的混合标准储液。内标储液 IOOng · Iiir1O3. 3. 3血浆标准曲线和血浆质控样本的制备将20μ L的混合标准曲线储液以及 20 μ L内标储液加入200 μ L空白血浆，按照“3. 4血样处理方法”处理，以此制备成为d4T， 3TC禾口 AZT的血浆浓度为20，80，160，640，1280，3200ng · mL-1，EFV禾口 NVP血浆标曲浓度为 40，160，320，1280，2560，6400ng · πι Λ LPV 为 62. 5，625，1250，2500，5000，IOOOOng · πι Λ RTV % 12. 5,125，250，500，1000，2000ng .ι Γ1以及低、中、高3个血浆质控样本浓度分别为 d4T，3TC 和 AZT 为 40、320、2560ng · mL_1 ；EFV 和 NVP 为 80、640、5120ng · ml/1 ；LPV 为 80、 800、8000ng · mL_1 ； RTV 为 15、150、1500ng · mlA3. 4血样处理方法精密移取血浆200 μ L，置于1.5ml离心管中，精密加入IOOng mr1内标液10 μ L， 有机溶剂A(50mmol .L—1醋酸铵乙腈=1 6, ν ν) 200 μ L，涡流混合;3min，再加入Iml 乙酸乙酯，涡流混合5min，4°C，12000rpm高速离心lOmin，吸取上清液(乙酸乙酯层)至另一 1. 5ml离心管中，37°C氮气吹干，下层溶液用Iml乙酸乙酯按上述方法再提取一次，上清液吸至相应离心管中，氮气吹干，残渣用200 μ L流动相复溶，涡流混合，取上清液10 μ L进行LC-MS/MS分析。4.方法学验证4. 1方法专属性分别取健康志愿者空白血浆和临床服药患者血浆考察方法的选择性，结果表明在 MRM模式下，各样品峰具有很好的分辨率，内源性杂质无干扰，内标响应稳定。空白血浆、空白血浆加齐多夫定、拉米夫定、司他夫定、奈韦拉平、依非韦伦以及洛匹那韦和利托那韦和内标替米沙坦标准溶液、及艾滋病患者口服相应抗反转录病毒药物的色谱图本发明在临床病例以及标本选择上，本发明前瞻性入组开始服用包括EFV抗病毒药物而未接受过抗HIV治疗的患者42例，收集患者一般人口学资料并规律随访、收集记录患者临床一般资料以及治疗疗效和不良反应资料。以明确EFV浓度与患者年龄、性别以及体重和体重指数的相互关系，同时初步分析对于中国患者，服用EFV进行抗HIV治疗的血浆有效治疗浓度范围和EFV相关中枢神经系统不良反应发生率。4. 2 基质效应(matrix effects, ME)取空白血浆15份，按照“3. 4血浆处理方法”进行处理后，分成3组，每组分别加入高、中、低浓度混合质控溶液和内标液涡旋混合提取后10μ L进样。测定各样品中各组分峰面积与内标峰面积的比值Α。同时取高、中、低浓度混合质控溶液以及内标溶液10 μ L进样分析3次。测定各样
品中各组分峰面积与内标峰面积的比值C。基质效应计算公式为提取回收率$10(Κ。当
ME值等于或接近100时，表明不存在基质效应的影响；当ME值大于100时，表明存在离子增强作用；当ME值小于100时，表明存在离子抑制作用。本检测方法中，存在少量离子增强和离子抑制的情况，但是介于86. 2-116. 2%，不会明显影响标准曲线线性关系(如表1所示)°表1七种待测药物的高、中、低浓度质控样品(各5份)之基质效应
权利要求
1.一种同时测定多种抗Hiv药物血浆浓度方法，其特征在于，采用蛋白沉淀联合液液萃取的方法处理临床标本，然后建立液相色谱-质谱联用同时测定常用多种抗反转录病毒药物血浆浓度，包括下述步骤1)血浆样品经碱化沉淀蛋白后，用乙酸乙酯液-液萃�。�2)以甲醇/0.1 %甲酸水溶液(80 20)为流动相，Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18(150mmX4. 6mm, 5 μ m)柱分离；3)采用电喷雾电离源，以多反应监测(MRM)方式进行正离子检测。
2.按权利要求1所述的同时测定多种抗HIV药物血浆浓度方法，其特征在于，所述的常用多种抗反转录病毒药物是齐多夫定(AZT)、拉米夫定(3TC)、司他夫定(d4T)、奈韦拉平 (NVP)、依非韦伦(EFV)、洛匹那韦(LPV)和利托那韦(RTV)。
3.按权利要求1所述的同时测定多种抗HIV药物血浆浓度方法，其特征在于，所述的步骤3)中用于定量分析的离子对包括洛匹那韦:629.6- 155. 2，利托那韦:721.4-268. 2， 内标替米沙坦515. 2 — 276. 2，拉米夫定:230. 2 — 112. 2，司他夫定225. 0 — 126. 8，奈韦拉平267. 0 — 226. 0，齐多夫定268. 0 — 127. 0，依非韦伦 316. 0 — 243. 9。
4.按权利要求1所述的同时测定多种抗HIV药物血浆浓度方法，其特征在于，所述的血浆中 3TC、d4T、AZT 线性范围为 20-3200ng · mL, EFV 和 NVP 线性范围为 40_6400ng · mL, LPV 线性范围为 62. 5-10000ng · mL, RTV 的线性范围为 12. 5_2000ng · mL, r 均大于 0. 99。
5.按权利要求4所述的同时测定多种抗HIV药物血浆浓度方法，其特征在于，所述的血浆中多种抗反转录病毒药物血浆浓度平均日内和日间精密度均小于15%，准确率在85% 到115%之间。
全文摘要
本发明属于医学检验领域，涉及体内药物的分析测定方法。具体涉及一种可同时测定多种常用抗反转录病毒HIV药物血浆浓度的方法。本发明方法将血浆样品经碱化沉淀蛋白后，用乙酸乙酯液-液萃取，以甲醇/0.1％甲酸水溶液(80∶20)为流动相，Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18柱分离；采用电喷雾电离源，以多反应监测方式进行正离子检测，用于定量分析多种抗药物血浆浓度。本方法选择性强、灵敏度高，重现性好、能同时快速、准确测定人血浆中多种常用抗反转录病毒HIV药物血浆浓度，为临床开展药物浓度与疗效相关性研究奠定了方法学基础。
文档编号G01N30/14GK102253129SQ20101017998
公开日2011年11月23日 申请日期2010年5月21日 优先权日2010年5月21日
发明者卢洪洲, 姚亚敏, 张丽军 申请人:上海市公共卫生临床中心
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