专利名称：Il－18结合蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及白细胞介素18(IL-18)结合蛋白，特别涉及它们在急性和慢性炎症疾病的预防和/或治疗中的用途。
背景技术：
最早在1989年白细胞介素-18(IL-18)被描述为γ-干扰素诱导因子(IGIF)，并且是促炎症细胞因子，除了具有诱导γ-干扰素的能力外，还具有多方面功能。这些生物学性能包括NF-κb的激活，Fas配体表达，CC和CXC趋化因子的诱导，感受态人免疫缺陷病毒的增加的产生。由于IL-18有诱导T细胞和巨噬细胞中γ-干扰素产生的功能，它在Th1-型免疫应答中和参与先天和后天免疫性中起着重要作用。IL-18就其结构和功能来说涉及IL-1家族。有关IL-18结构，功能和生物学活性，参见，例如Dinarello，C.等(1998)J.Leukoc.Biol.63658-654；Dinarello，C.A.(1999)Methods 19121-132；和Dinarello，C.A.(1999)J.Allergy Clin.Immunol.10311-24；(McInnes，I.B.等(2000)Immunology Today 21312-315；Nakanishi，K.等(2001)Ann.Rev.Immunol 19423474。
细胞内IL-18-原在内毒素-刺激的细胞中经胱天蛋白酶1(Ghayur，T.等，(1997)Nature 386619-623；Gu，Y.等，(1997)Science275206-209)，在Fas-L或细菌DNA刺激细胞中经胱天蛋白酶4，5和6蛋白酶解加工成18kDa活性形式(Tsutsui，H.等，(1999)Immunity 11359-67；Ghayur，T.，没有出版的Observations)。IL-18-原还被其他蛋白酶解加工，例如嗜中性白细胞蛋白酶3(Sugawara，S.等，(2001)J.Immunol.，167，6568-6575)，胱天蛋白酶3(Akita，K.等，(1997)J.Biol.Chem.272，26595-26603)，和丝氨酸蛋白酶弹性蛋白酶和组织蛋白酶(Gracie J.A.，等，(2003)Journal of Leukocyte Biology73，213-224)。人和鼠IL-18没有常规的前导序列，并且细胞成熟IL-18释放的原理还不十分清楚。
IL-18的生物活性通过IL-18与由两个亚基构成的异二聚体IL-18受体(IL-18R)结合而介导α-亚基(IL-1R家族中的一员，也称作IL-1R-相关蛋白-1或IL-1Rrp1)和β-亚基(也称作IL-18R辅助蛋白，IL-18AP或AcPL)。IL-18Rα亚基直接结合IL-18，但是不能信号传导。β-亚基本身不结合IL-18，但是与α-亚基联合形成信号转导必需的高亲和性受体(KD＝～0.3nM)(Sims，J.E.，(2002)Current OpinImmunol.14117-122)。通过IL-18αβ复合体的IL-18信号传导类似于IL-1R和Toll样受体(TLR)系统。IL-18R信号传导利用信号传导分子，例如MyD88，IRAK，TRAF6，并且产生和IL-1产生的相似的响应(例如，NIK，IkB激酶，NF-kB，JNK和p38 MAP激酶的激活)。介导IL-18生物活性对IL-18Rα和信号传导分子的需要已经分别使用IL-18Rα-亚基(Hoshino K.，等(1999)J.Immunol.1625041-5044；)，MyD88(AdachiO.，等(1998)Immunity 9143-150)或IRAK(Kanakaraj P.，(1999)J.Exp.Med.1891129-1138)敲除证实了。
结合IL-18的抗体是本领域公知的。EP 0 974 600公开了能中和IL-18的小鼠抗体。抗IL-18人抗体在PCT公开WO 0158956中公开，这里引作参考。本发明提供了能以高亲合力结合IL-18，结合并中和IL-18的结合蛋白质的新的家族，人抗体，及其片段。
发明概述本发明提供IL-18结合蛋白，特别是人IL-18的抗体，以及制备和使用这样的蛋白质的方法。本发明的一个方面是提供使用IL-18调谐子调节基因表达的方法。
本发明的一个方面是提供包括能结合人IL-18的抗原结合结构域的结合蛋白质。在一个实施方案中，抗原结合结构域包括至少一个包括选自下面的氨基酸序列的CDRCDR-H1.X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7(SEQ ID NO42)，其中
X1是S，N，H，R，或Y；X2是Y，G，R，S，或C；X3是W，G，Y，D，S，V，或I；X4是I，H，W，Y，M，L，或D；X5是G，Y，S，N，或H；X6是W，或者不存在；和X7是T，S，G，或者不存在；CDR-H2.X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17(SEQ ID NO43)，其中；X1是F，Y，H，S，或V；X2是I，或F；X3是Y，S，或W；X4是P，Y，或S；X5是G，S，R，或D；X6是D，或G；X7是S，T，G，或R；X8是E，T，I，或N；X9是T，Y，N，I，K，或H；X10是R，Y，或S；X11是Y，N，或S；X12是S，P，A，或V；X13是P，S，或D；X14是T，L，或S；X15是F，K，或V；X16是Q，S，或K；和X17是G，或者不存在；CDR-H3.X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18(SEQ ID NO44)，其中；X1是V，D，E，S，或C；X2是G，R，D，S，K，L，Y，或A；X3是S，G，Y，或R；X4是G，S，Y，N，T，或D；
X5是W，S，A，G，Y，或T；X6是Y，G，S，F，W，或N；X7是P，S，F，Y，V，G，W，或V；X8是Y，F，D，P，M，I，或N；X9是T，W，D，L，Y，E，P，F，或G；X10是F，D，Y，H，V，Y，或者不存在；X11是D，Y，F，L，或者不存在；X12是I，D，Y，或者不存在；X13是Y，或者不存在；X14是Y，或者不存在；X15是G，或者不存在；X16是M，或者不存在；X17是D，或者不存在；和X18是V，或者不存；CDR-L1.X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17(SEQ ID NO45)，其中；X1是R，或K；X2是A，G，或S；X3是S；X4是E，R，Q，或H；X5是S，I，T，或N；X6是I，V，L，或F；X7是S，G，L，N，或R；X8和S，G，Y，R，N，H，或D；X9是N，G，Y，R，或S；X10是L，Y，S，或D；X11是A，L，N，V，G，或D；X12是A，N，E，K，G，或者不存在；X13是K，T，N，或者不存在；X14是N，Y，T，或者不存在；X15是Y，L，或者不存在；X16是L，C，Y，或者不存在；和
X17是A，D，或者不存在；CDR-L2.X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7(SEQ ID NO46)，其中X1是T，G，S，W，或E；X2是A，V，T，I，或L；X3是S，或F；X4是T，I，N，S，R，或Y；X5是R，或L；X6是A，Q，E，或F；和X7是T，或S；和CDR-L3.X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10(SEQ ID NO47)，其中X1是Q，或M；X2是Q，H，或Y；X3是Y，N，G，S，或R；X4是N，H，Y，D，G，V，L，或I；X5是N，G，I，Y，S，Q，F，或E；X6是W，S，T，L，I，或F；X7是P，L，T，D，或I；X8是S，L，P，C，W，I，或F；X9是I，T，S，或者不存在；和X10是T，或者不存在。
优选地，抗原结合结构域包括至少一个包括选自由下面的残基构成的组的氨基酸序列的CDRSEQ ID NO.6的残基31-35；SEQ IDNO.6的残基50-66；SEQ ID NO.6的残基99-110；SEQ ID NO.7的残基24-34；SEQ ID NO.7的残基50-56；SEQ ID NO.7的残基89-98；SEQ ID NO.8的残基31-37；SEQ ID NO.8的残基52-67；SEQ ID NO.8的残基100-110；SEQ ID NO.9的残基24-35；SEQ ID NO.9的残基21-27；SEQ ID NO.9的残基90-98；SEQ ID NO.10的残基31-35；SEQ ID NO.10的残基50-65；SEQ ID NO.10的残基98-107；SEQ ID NO.11的残基24-34；SEQ ID NO.11的残基50-56；SEQ ED NO.11的残基89-97；SEQ ED NO.12的残基31-37；SEQ ID NO.12的残基52-67；SEQ ID NO.12的残基100-108；SEQ ID NO.13的残基24-35；SEQ ID NO.13的残基51-57；SEQ ED NO.13的残基90-98；SEQ ID NO.14的残基31-35；SEQ ID NO.14的残基50-66；SEQ ID NO.14的残基99-111；SEQ ID NO.15的残基24-40；SEQ ID NO.15的残基56-62；SEQ ID NO.15的残基95-103；SEQ ID NO.16的残基31-37；SEQ ID NO.16的残基52-67；SEQ ID NO.16的残基100-109；SEQ ID NO.17的残基24-35；SEQ ID NO.17的残基51-57；SEQ ID NO.17的残基90-98；SEQID NO.18的残基31-35；SEQ ID NO.18的残基20-36；SEQ IDNO.18的残基99-108；SEQ ID NO.19的残基24-34；SEQID NO.19的残基50-56；SEQ ID NO.19的残基89-97；SEQ IDNO.20的残基31-35；SEQ ID NO.20的残基52-67；SEQ ID NO.20的残基100-108；SEQ ID NO.21的残基24-35；SEQ ID NO.21的残基51-57；SEQ ID NO.21的残基90-98；SEQ ID NO.22的残基31-35；SEQ ID NO.22的残基50-66；SEQ ID NO.22的残基99-116；SEQ ID NO.23的残基24-39；SEQ ID NO.23的残基55-61；SEQ ID NO.23的残基94-102；SEQ ID NO.24的残基31-37；SEQ ID NO.24的残基52-67；SEQ ID NO.24的残基100-109；SEQ ID NO.25的残基24-35；SEQ ID NO.25的残基51-57；SEQ ID NO.25的残基90-98；SEQ ID NO.26的残基31-37；SEQ ID NO.26的残基52-67；SEQ ID NO.26的残基100-109；SEQ ID NO.27的残基24-35；SEQ ID NO.27的残基51-57；SEQ ID NO.27的残基90-98；SEQ ID NO.28的残基31-37；SEQ ID NO.28的残基52-67；SEQ ID NO.28的残基100-108；SEQ ID NO.29的残基24-35；SEQ ID NO.29的残基51-57；SEQ BD NO.29的残基90-98；SEQ ID NO.30的残基31-37；SEQ ID NO.30的残基52-67；SEQ ID NO.30的残基99-109；SEQ ID NO.31的残基24-35；SEQ ID NO.31的残基51-57；SEQ ID NO.31的残基90-98；SEQ ID NO.32的残基31-37；SEQ ID NO.32的残基52-67；SEQ ID NO.32的残基100-109；SEQ ID NO.33的残基24-35；SEQ ID NO.33的残基51-57；SEQ ID NO.33的残基90-98；SEQ ID NO.34的残基31-37；SEQ ID NO.34的残基52-67；SEQ ID NO.34的残基100-108；SEQ ID NO.35的残基24-35；SEQ ID NO.35的残基51-57；SEQ ID NO.35的残基90-98；SEQ ID NO.36的残基31-35；SEQ ID NO.36的残基50-66；SEQ ID NO.36的残基99-116；SEQ ID NO.37的残基24-39；SEQ ID NO.37的残基55-61；SEQ ID NO.37的残基94-102；SEQ ID NO.38的残基31-35；SEQ ID NO.38的残基50-66；SEQ ID NO.38的残基99-108；SEQ ID NO.39的残基24-35；SEQ ID NO.39的残基51-57；SEQ ID NO.39的残基90-98；SEQ ID NO.40的残基31-37；SEQ ID NO.40的残基52-67；SEQ ID NO.40的残基97-109；SEQ ID NO.41的残基24-40；SEQ ID NO.41的残基56-62；SEQ ID NO.41的残基95-103。优选地，结合蛋白包括至少3个CDRs。
在另一个优选实施方案中，结合蛋白包括一个VH结构域。优选地，VH结构域包括选自下面的氨基酸序列SEQ ID NO6；SEQ ID NO8；SEQ ID NO10；SEQ ID NO12；SEQ ID NO14；SEQ ID NO16；SEQ ID NO18；SEQ ID NO20；SEQ ID NO22；SEQ ID NO24；SEQID NO26；SEQ ID NO28；SEQ ID NO30；SEQ ID NO32；SEQ IDNO34；SEQ ID NO36；SEQ ID NO38；和SEQ ID NO40。在另一个实施方案中，结合蛋白包括一个VL结构域。优选地，VL结构域包括选自下面的氨基酸序列SEQ ID NO7；SEQ ID NO9；SEQ ID NO11；SEQ ID NO13；SEQ ID NO15；SEQ ID NO17；SEQ ID NO19；SEQID NO21；SEQ ID NO23；SEQ ID NO25；SEQ ID NO27；SET M NO29；SEQ ID NO31；SEQ ID NO33；SEQ ID NO35；SEQ ID NO37；SEQ ID NO39；和SEQ ID NO41。
在一个优选的实施方案中，结合蛋白包括一个VH和一个VL结构域。更优选地，结合蛋白包括包括选自下面的氨基酸序列的VH结构域SEQ ID NO6；SEQ ID NO8；SEQ ID NO10；SEQ ID NO12；SEQID NO14；SEQ ID NO16；SEQ ID NO18；SEQ ID NO20；SEQID NO22；SEQ ID NO24；SEQ ID NO26；SEQ ID NO28；SEQID NO30；SEQ ID NO32；SEQ ID NO34；SEQ ID NO36；SEQ IDNO38；和SEQ ID NO40和包括选自下面的氨基酸序列的VL结构域SEQ ID NO7；SEQ ID NO9；SEQ ID NO11；SEQ ID NO13；SEQ ID NO15；SEQ ID NO17；SEQ ID NO19；SEQ ID NO21；SEQID NO23；SEQ ID NO25；SEQ ID NO27；SEQ ID NO29；SEQ IDNO31；SEQ ID NO33；SEQ ID NO35；SEQ ID NO37；SEQ ID NO39；和SEQ ID NO41。最优选地，结合蛋白包括包括SEQ ID NO7的氨基酸序列的VL结构域和包括SEQ ID NO6的氨基酸序列的VH结构域。
在另一个实施方案中，结合蛋白进一步包括选自人IgM恒定区；人IgG1恒定区；人IgG2恒定区；人IgG3恒定区；人IgG4恒定区；人IgE恒定区和人IgA恒定区的重链免疫球蛋白恒定区。优选地，重链免疫球蛋白恒定区是人IgG1恒定区。优选地，重链恒定区中至少一个氨基酸残基被置换，使得抗体的效应子功能被改变。更优选地，人IgG1恒定区包括选自SEQ ID NO.2，和SEQ ID NO.3的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，结合蛋白进一步包括选自人Igκ恒定区，和人Igλ恒定区的轻链免疫球蛋白恒定区。优选地，人Igκ恒定区包括氨基酸序列SEQ ID NO.4，人Igλ恒定区包括氨基酸序列SEQ IDNO.5。
在另一个实施方案中，结合蛋白包括具有选自SEQ ID NO2，和SEQ ID NO3的氨基酸序列的Ig重链恒定区；具有选自SEQ ID NO4，和SEQ ID NO5的氨基酸序列的IG轻链恒定区；具有SEQ ID NO6的氨基酸序列的Ig重链可变区；和具有SEQ ID NO7的氨基酸序列的Ig轻链可变区。
在另一个实施方案中，结合蛋白包括具有SEQ ID NO3的氨基酸序列的Ig重链恒定区；具有SEQ ID NO4的氨基酸序列的IG轻链恒定区；具有SEQ ID NO6的氨基酸序列的Ig重链可变区；和具有SEQ ID NO7的氨基酸序列的Ig轻链可变区。
在另一个实施方案中，结合选自免疫球蛋白分子或者本领域公知的其功能变体，所述变体保持结合蛋白的特征结合性质。具体免疫球蛋白实施方案的例子包括但不限于scFv；单克隆抗体；人抗体；嵌合抗体；人源化抗体；单结构域抗体；Fab片段；Fab′片段；F(ab′)2；Fv；二硫键连接的Fv，和双特异性或双重特异性抗体。最优选地，结合蛋白是人抗体。
本发明的另一方面提供了中和结合蛋白，其包括上文公开的结合蛋白的任一种，其中中和结合蛋白能中和IL-18。优选地，中和结合蛋白能结合中和人IL-18原；成熟-人IL-18或截短的-人IL-18中的任何一种。在另一个实施方案中，中和结合蛋白减小了IL-18结合其受体的能力。优选地，中和结合蛋白减小了人IL-18原；成熟-人IL-18或截短的-人IL-18结合其受体的能力。
在另一个实施方案中，中和结合蛋白能抑制选自下面的IL-18生物活性中的一种或几种Th1调节；Th2调节(Nakanishi K.，等(2001)Cytokine and Growth Facto r Rev.1253-72)；Nk调节；嗜中性白细胞调节；单核细胞-巨噬细胞系调节；嗜中性白细胞调节；e嗜酸性细胞调节；B-细胞调节；细胞因子调节；趋化因子调节；粘着分子调节；和细胞募集调节。
在优选的实施方案中，中和结合蛋白具有选自下面的解离常数(KD)最大大约10-7M；最大大约10-8M；最大大约10-9M；最大大约10-10M；最大大约10-11M；最大大约10-12M；最大大约10-13M。
在另一个实施方案中，中和结合蛋白具有选自下面的生成速率至少大约102M-1s-1；至少大约103M-1s-1；至少大约104M-1s-1；至少大约105M-1s-1；至少大约106M-1s-1。
在另一个实施方案中，中和结合蛋白具有选自下面的离解速率最大大约10-3s-1；最大大约10-4s-1；最大大约10-5s-1；最大大约10-6s-1。
本发明的另一方面提供包括上面公开的结合蛋白中任何一种的标记结合蛋白，其中所述结合蛋白与可检测标记物结合。优选地，可检测标记物选自放射性标记物，酶，荧光标记物，发光标记物，生物发光标记物，磁性标记物和生物素。更优选地，放射性标记物是3H，14C，35S，90Y，99Tc，111In，125I，131I，177Lu，166Ho，或153Sm。
本发明的另一方面提供一种包括上面公开的结合蛋白中任何一种的结合蛋白，其中所述结合蛋白与治疗性或细胞毒性物质结合。优选地，所述治疗性或细胞毒性物质选自抗-代谢物；烷基化试剂；抗生素；生长因子；细胞因子；抗-血管生成药物；抗-有丝分裂物质；蒽环霉素A；毒素；编程性细胞死亡剂。
一个实施方案允许分离编码上述公开的结合蛋白中的任何一种的核酸。另一个实施方案提供包括分离的上面公开的核酸的载体，其中所述载体选自pcDNA；pTT(Durocher等，Nucleic Acids Research2002，Vol 30，No.2)；pTT3(有另外多个克隆位点的pTT；pEFBOS(Mizushima，S.和Nagata，S.，(1990)Nucleicacids ResearchVol 18，No.17)；pBV；pJV；和pBJ。
在另一个实施方案中，用载体转染宿主细胞。优选地，宿主细胞是原核细胞。更优选地，宿主细胞是大肠杆菌。在相关实施方案中，宿主细胞是真核细胞。优选地，所述真核细胞选自原生生物细胞，动物细胞，植物细胞和真菌细胞。更优选地，宿主细胞是哺乳动物细胞，包括但不限于，CHO和COS；或者真菌细胞，例如啤酒糖酵母；或昆虫细胞，例如Sf9。
本发明的另一方面提供结合人IL-18的结合蛋白的制备方法，包括在足以产生结合人IL-18的结合蛋白的条件下在培养基中培养上面公开的宿主细胞中的任何一种。另一个实施方案提供根据上面公开的方法制备的结合蛋白。
本发明的另一方面提供包括上面公开的结合蛋白中的任何一种的结晶结合蛋白，其中所述结合蛋白以晶体存在。优选地，所述晶体是没有载体的药学控制释放晶体。在一个实施方案中，作为晶体存在的结合蛋白具有比结合蛋白可溶性配对物更大的体内半存留期。在另一个实施方案中，结合蛋白在结晶之后保留其生物活性。
一个实施方案提供用于释放结合蛋白的成分，其中所述成分包括含有上面公开的结晶结合蛋白和成分；和至少一种聚合物载体的组合物。优选地，所述聚合物载体选自下面的一种或几种聚(丙烯酸)，聚(氰基丙烯酸酯)，聚(氨基酸)，聚(酸酐)，聚(缩肽)，聚(酯)，聚(乳酸)，聚(乳酸-共-羟基乙酸)或PLGA，聚(b-羟基丁酸)，聚(γ-己内酯)，聚(二氧六环酮)；聚(乙二醇)，聚((羟丙基)甲基丙烯酰胺，聚[(有机)磷腈]，聚(原酯)，聚(乙烯醇)，聚(乙烯吡咯烷酮)，马来酸酐-烷基乙烯基醚共聚物，多聚醇，白蛋白，藻酸盐，纤维素和纤维素衍生物，胶原，纤维蛋白，明胶，透明质酸，低聚糖，glycaminoglycans，硫酸多糖，它们的混合物和共聚物。优选地，所述成分选自白蛋白，蔗糖，海藻糖，乳糖醇，明胶，羟丙基-β-环糊精，甲氧基聚乙二醇和聚乙二醇。另一个实施方案提供对哺乳动物治疗的方法，包括对哺乳动物施用有效量的上述组合物的步骤。
本发明的另一方面提供一种感兴趣的基因的基因表达的调节方法，包括下面的步骤提供IL-18多肽或IL-18调节剂；和多肽或调节剂接触细胞，其中感兴趣的基因选自下面Genbank鉴定号确定的基因NM_000389，NM_002198，NM_002163，NM_006144，NM_006515，NM_007185，NM_002288，NM_003661，NM_021958，NM_001335，Hs.382006，NM_020125，NM_007210，NM_021798，NM_013324，M11313，D88152，NM_001103，U37519，NM000697，J03600，NM_014578，S66793，U47054，L19871，M81181，NM～001188，U15460，NM014417，Z23115，NM_001713，U45878，U37546，U72649，U49187，J03507，U50360，XM_071866，NM_005623，Z32765，Z11697，XM071866，U51096，M83667，D87469，L07765，U66468，X14830，L29217，X15880，NM_001851，M27691，M37435，X13589，X16866，X59131，Nu004393，U73328，L19267，U53445，X68277，U48807，NM001950，U87269，M57730，X52541，J04076，X63741，L07077，M62831，M60830，U53786，NM_001988，NM_000141，M23668，U60062，NM_000141，U49973，U89995，U27326，A28102，M25667，L34357，U19523，L01406，U03486，X68285，Z18859，D49958，D43772，AC000099，M57731，X53800，M91036，D16583，X64877，X58431，M16937，NM014468，X92814，L19314，M26665，D10995，L41147，M24283，S81914，J03171，J00219，NM_000619，NM_000585，U31628，X04500，M27492，X01057，M26062，Y00081，Y00787，Z31695，X06256，X57206，U20734，NM014879，D31762，D42038，NM_005551，NM_014846，X06182，Nu005551，X07730，M13955，M57710，S83362，NM_002314，NM_005569，U49957，U89922，X14008，U59914，D14497，X59727，NM000429，U43944，X72755，NM021230，NM005951，X78710，X70991，M32011，S77763，M58603，S76638，M69043，U91616，D86425，L13740，U44848，U79251，M27288，AF000234，D50640，L20971，L10343，U77735，NM003579，U17034，AB000584，X63131，D11428，NM_032940，NM_005035，NM_003579，M18255，L01087，D38128，Y10375，D15049，M31166，U59877，NM_003579，U64675，S57153，NM_002903，NG_000013，X75042，M83221，NM_000537，U22314，S59049，U70426，U22377，U38480，L10338，M23178，M69203，NM_005409，D79206，NM_005065，NM_004186，J03764，NM_006802，D89077，NM_003037，M91463，D82326，L05568，U96094，X83301，D21267，L31529，M62800，NM_021014，Z35093，NM_005816，L25444，M95787，NM005421，L47345，M57732，NM_003205，M96956，U19878，M92357，M59465，X83490，U37518，NM_003294，U19261，U78798，S69790，U53476，L15309，U78722，X57809，U79249，AB000464，X77744，U79248，AI420129，HG2981-HT3127，HG3548-HT3749，HG870-HT870，HG4333-HT4603，HG3111-HT3287，HG4593-HT4998，HG961-HT961，HG1877-HT1917，HG3115-HT3291，HG4115-HT4385，和HG3925-HT4195。
优选地，调节剂是拮抗剂。更优选地，调节剂是结合蛋白或中和结合蛋白。
本发明还提供含有上述结合蛋白或中和结合蛋白和药学可接受载体的药物组合物。在另一个实施方案中，药物组合物含有至少一种用于治疗其中IL-18活性是有害的疾病的另外的治疗药物。优选地，所述另外的药物选自血管生成抑制剂(包括但不限于抗-VEGF抗体或VEGF-诱捕剂)；激酶抑制剂(包括但不限于KDR和TIE-2抑制剂)；共同-刺激分子阻断剂(包括但不限于抗-B7.1，抗-B7.2，CTLA4-Ig，抗-CD20)；粘着分子阻断剂(包括但不限于抗-LFA-1Abs，抗-E/L选择蛋白Abs，小分子抑制剂)；抗-细胞因子抗体或者其功能片段(包括但不限于抗-IL-12，抗-TNF，抗-IL-6/细胞因子受体抗体)；甲氨喋呤；皮质类固醇；环孢菌素；雷帕霉素；FK506；和非甾类抗炎药物。
另一方面，本发明提供一种抑制人IL-18活性的方法，包括使人IL-18接触上述结合蛋白，使得人IL-18活性被抑制。在相关方面，本发明提供对患有其中IL-18活性是有害的疾病的人患者抑制人IL-18活性的方法，包括对人患者施用上述结合蛋白使得人患者中的人IL-18活性被抑制，从而实现治疗。优选地，所述疾病选自类风湿性关节炎，骨关节炎，幼年型慢性关节炎，莱姆关节炎，银屑病关节炎，反应性关节炎，和脓毒性关节炎，脊椎关节�。砗彀呃谴窒扌曰爻ρ祝Ｑ裥越岢ρ祝ρ祝鹊核匾览敌蕴悄虿。鬃聪傺祝涮从膊。Ｆぱⅲぱ子财げ。浦参锟顾拗鞑。鞴僖浦才乓�(包括但不限于骨髓和实体器官排异)，急性或慢性的与器官移植相关的免疫疾病，肉状瘤�。鲋嘌不バ匝苣蹋琄aw阿司匹林ki′s�。珿rave′s�。霾∽酆险鳎云＠妥酆险鳎琖egener′s肉芽肿�。琀enoch-Schoenlein紫癜，肾微结节性脉管炎，慢性活性肝炎，眼色素层炎，脓毒性休克，中毒休克综合征，脓毒症综合征，恶病质，传染�。杉纳嬉鸬募膊。筇烀庖呷毕葑酆险鳎毙院嵯蚬撬柩祝琀untington′s舞蹈�。两鹕。缋闲猿沾簦蟹纾⒏喂δ苷习鸬母斡不苎云堆裥灾琢觯脑嗨ソ撸募」Ｈ珹ddison′s病，散发性，I型多腺缺乏和II型多腺缺乏，Schmidt′s综合征，成人(急性)呼吸抑制综合征，脱发，脱发斑，血清反应阴性关节�。亟诓。琑eiter′s病，牛皮癣关节�。Ｑ裥越岢亟诓。ぱ祝戮笠吆蜕趁攀暇喙毓亟诓。棺倒亟诓。鲋嘌膊�/动脉硬化，特应性变态反应，自身免疫大疱�。俺Ｐ蕴祓宕湟缎蕴祓宕嗵祓宕咝訧gA�。陨砻庖呷苎云堆珻oombs阳性溶血性贫血，后天性恶性贫血，少年恶性贫血，肌痛性大脑炎/Royal Free�。哉衬てし裟钪榫。尴赴亟谘祝⒂不窝祝鹨虿幻髯陨砻庖吒窝祝筇煨悦庖呷毕莶∽酆险鳎筇煨悦庖呷毕菹喙丶膊。腋危危胀ǜ魇礁餮拿庖呷毕�(普通各式各样的血丙种球蛋白减少)，膨胀心肌�。圆辉兄ⅲ殉菜ソ撸绮殉菜ソ撸宋湫苑尾。鹨虿幻鞯南宋橹纬裳啦垩祝缀蠹渲史尾。渲示窒扌苑窝祝爰渲史尾∠喙氐牡藿嶙橹膊。敕尾∠喙氐幕旌系藿嶙橹膊。爰渲史尾∠喙氐娜碛不爰渲史尾∠喙氐睦喾缡怨亟谘祝敕尾∠喙氐娜砗彀呃谴敕尾∠喙氐钠し艏⊙�/多肌炎，与肺病相关的Sjogren′s�。敕尾∠喙氐慕┯布棺笛祝峤谛月龉苎酌稚⒎尾。敕尾∠喙氐暮扑爻磷挪。┪镆鸬募渲史尾。湎宋杖悦钢苎祝允人嵝苑窝祝馨拖赴笮苑尾。静『蠹渲史尾。捶绻亟谘祝陨砻庖吒窝祝�1-型自身免疫肝炎(典型自身免疫或狼疮样肝炎)，2-型自身免疫肝炎(抗-LKM抗体肝炎)，自身免疫介导的低血糖，B型胰岛素抗性微黑棘皮症，甲状旁腺机能减退，与器官移植相关的急性免疫疾�。肫鞴僖浦蚕喙氐穆悦庖呒膊。枪亟谘祝⒂不ü苎祝�1型牛皮癣，2型牛皮癣，自发性白细胞减少，自身免疫中性白细胞减少，肾病NOS，肾小球肾炎，肾microscopic vasulitis，莱姆�。绦魏彀呃谴胤⑿阅行圆辉兄⒒騈OS，精液自身免疫性，多发性硬化(所有亚型)，交感神经眼炎，缔结组织疾病继发性高血压，Goodpasture′s综合征，结节性多动脉炎肺动，急性风湿性发烧，类风湿性脊椎炎，Still′s�。碛不琒jogren′s综合征，Takayasu′s病/动脉炎，自身免疫血小板减少，特发性血小板减少，自身免疫甲状腺�。鬃聪倩芸航鬃聪僦鬃陨砻庖呒鬃聪倩芸航�(Hashimoto′s病)，萎缩性自身免疫甲状腺机能亢进，原发性粘液水肿，晶体抗原性葡萄膜炎，原发性结节性脉管炎，白癜风，急性肝�。愿尾。凭愿斡不凭鸬母嗡鹕耍琧holeosatatis，特应性肝�。┪镆鸬母窝祝蔷凭灾拘愿窝祝溆π员涮从拖珺族链球菌(GBS)感染，精神病(例如，抑郁症和精神分裂症)，Th2型和Th1型介导的疾�。桶┲ⅲ绶伟榉堪赴螂装岢Π认侔殉舶傲邢侔┖椭背Π驮煅裥灾琢�(白血病和淋巴瘤)。
另一方面，本发明提供对患有其中IL-18活性是有害的疾病的患者治疗的方法，包括在施用上述第二种药物之前，同时，或之后对患者施用上述结合蛋白中的任何一种的步骤。
本发明另一方面提供选自人抗体；嵌合抗体；人源化抗体和CDR接枝抗体的中和结合蛋白，其中所述中和结合蛋白能结合成熟-人IL-18，但是不特异性结合人IL-18原。
本发明另一方面提供选自人抗体；嵌合抗体；人源化抗体和CDR接枝抗体的中和结合蛋白，其中所述中和结合蛋白能与125-2H抗体竞争结合人IL-18。
本发明另一方面提供选自人抗体；嵌合抗体；人源化抗体和CDR接枝抗体的中和结合蛋白，其中所述中和结合蛋白不能与125-2H抗体竞争结合人IL-18。
本发明另一方面提供选自人抗体；嵌合抗体；人源化抗体和CDR接枝抗体的中和结合蛋白，其中所述中和结合蛋白不能与选自2.5(E)mg1抗体和IL-18BP的结合蛋白竞争结合人IL-18。
在优选的实施方案中，结合蛋白能结合成熟-人IL-18，但是不特异性结合人IL-18原。在另一个实施方案中，结合蛋白能与125-2H抗体竞争结合人IL-18。在另一个实施方案中，结合蛋白不能与125-2H抗体竞争结合人IL-18。
在另一个实施方案中，结合蛋白不能与选自2.5(E)mg1抗体和IL-18BP的结合蛋白竞争结合人IL-18。
在优选的实施方案中，结合蛋白包括包括SEQ ID NO9的氨基酸序列的VL，和包括SEQ ID NO8的氨基酸序列的VH。
在另一个实施方案中，结合蛋白包括具有选自SEQ ID NO2，和SEQ ID NO3的氨基酸序列的Ig重链恒定区；具有选自SEQ ID NO4，和SEQ ID NO5的氨基酸序列的IG轻链恒定区；具有SEQ ID NO8的氨基酸序列的Ig重链可变区；和具有SEQ ID NO9的氨基酸序列的Ig轻链可变区。
在另一个实施方案中，结合蛋白包括具有选自SEQ ID NO3的氨基酸序列的Ig重链恒定区；具有选自SEQ ID NO4的氨基酸序列的IG轻链恒定区；具有SEQ ID NO8的氨基酸序列的Ig重链可变区；和具有SEQ ID NO9的氨基酸序列的Ig轻链可变区。
本发明的详细描述本发明提供IL-18结合蛋白，特别是抗-Il-18抗体，或者与其结合的其抗原-结合部分。本发明的各方面涉及抗体和抗体片段，及其药物组合物，以及制备这样的抗体和片段的核酸，重组表达载体和宿主细胞。
本发明还包括使用本发明的抗体体外或体内检测人IL-18，抑制人IL-18活性，和调节基因表达的方法。本发明还提供截短的IL-18。在相关方面，本发明还提供用于制备截短的IL-18的核酸，重组表达载体和宿主细胞。
除非在这里另有定义，与本发明相关使用的科学和技术定义应该具有本领域技术人员通常理解的定义。此外，除非上下文必需说明，单数应该包括复数，而复数应当包括单数。在本说明书中，除非另有说明″或″的意思是″和/或″。此外，术语″包括″，以及其他形式，例如，第三人称的和过去式的″包括″的使用，是非限制性的。还有，除非另有说明，术语，例如″元素″或″成分″包括包括一个成分的元素和成分以及包括一个以上子单位的元素和成分。
一般情况下，与这里描述的细胞和组织培养，分子生物学，免疫学，微生物学，遗传学和蛋白质和核酸化学和杂交技术相关使用的术语是本领域公知的和通常使用的。本发明的方法和技术一般根据本领域公知的常规方法和本说明书引述的和讨论的各种概述性的和更专业的参考文献来进行，除非另有说明。根据厂商说明书进行酶促反应和纯化技术，如本领域常规实现的或者如这里描述的。与这里描述的实验步骤，分析化学，合成有机化学和药物化学技术相关的术语是本领域公知的和通常使用的。化学合成，化学分析，药物制备，制剂和送药和对患者的治疗是标准技术。
下面定义选择的术语，可以更容易理解本发明。
这里使用的术语″多肽″指任何氨基酸的聚合链。术语″肽″和″蛋白质″与术语多肽互换使用，也指氨基酸的聚合链。术语″多肽″包括天然或人造蛋白质，蛋白质片段和蛋白质序列的多肽类似物。多肽可以是单体的或聚合的。
术语″分离的蛋白质″或″分离的多肽″是由于其来源或产生来源不与其天然态下伴随它的天然相关成分相关；基本上没有来自相同物种的其他蛋白质；由不同物种的细胞表达；或者在自然中不存在的蛋白质或多肽。因此，化学合成或在不同于其天然起源细胞不同的细胞系中合成的多肽是与其天然相关成分″分离的″。利用本领域公知的蛋白质纯化技术，通过分离，可以使得蛋白质基本上没有天然相关成分。
这里使用的术语″回收″指，例如，利用本领域公知的蛋白质纯化技术，通过分离，使得化学物质例如多肽基本上没有天然相关成分的方法。
这里使用的术语″IL-18″，指也已知为干扰素-γ的细胞因子，包括因子(IGIF)，那是一种促炎性细胞因子，除了诱导扰素-γ的能力外还具有各种功能。与术语″hIL-18″互换使用的术语″人IL-18″包括SEQ ID NO1的多肽及其片段，包括但不限于，人IL-18原，成熟人IL-18原，和保留这里描述的IL-18的生物活性的任何截短的人IL-18。这里使用的术语″人IL-18原″指SEQ ID NO1的多肽。这里使用的术语″成熟人IL-18″，指SEQ ID NO1的残基37-193，这里使用的术语″截短的人″，指SEQ ID NO1的残基59-193。优选地，IL-18，及其片段是生物活性的。这里使用的术语″重组人IL-18″或″rhlL-18″指利用重组DNA技术体外制备的人IL-18。
这里使用的″IL-18的生物活性″指细胞因子IL-18的所有固有的生物学性质。IL-18的生物学性质包括但不限于结合IL-18受体；促进Th1和Tc1细胞的成熟和激活；通过几种细胞型促进细胞因子例如TNF，IFNγ和IL-1β的产生；促进巨噬细胞释放细胞因子例如TNF和IFNγ，产生NO；促进FasL表达，细胞毒性和细胞因子从NK细胞释放(IFNγ)；促进细胞因子/趋化因子释放，突发性呼吸，颗粒释放，嗜中性白细胞中粘着分子表达；促进内皮细胞迁移从而促血管生成；促进GAG释放，软骨细胞中MMP和NO产生；促进某些细胞中COX2表达；和在某些细胞中减少细胞增殖。
关于抗体，蛋白质，或肽与第二化学物质相互作用的这里使用的术语″特异性结合″或″特异地结合″，意思是相互作用取决于化学物质上特定结构(例如抗原决定簇或表位)的存在；例如，抗体识别和结合特定蛋白质结构而不是一般的蛋白质。如果抗体对于表位″A″是特异性的，含有标记的″A″和抗体的反应中，含有表位A(或者游离的，没有标记的A)，的分子的存在，会减少与抗体结合的标记的A的量。
这里使用的术″抗体″，广义上指由四个多肽链构成的任何免疫球蛋白(Ig)分子两个重链(H)和两个轻链(L)，或者保留Ig分子的基本表位结合特征的其任何功能片段，突变体，变体，或衍生物。这样的突变体，变体，或衍生物抗体形式是本领域公知的。下面讨论非限制性实施方案。
在全长抗体中，每条重链由一个重链可变区(这里缩写为HCVR或VH)和一个重链恒定区构成。重链恒定区由三个结构域，CH1，CH2和CH3构成。每条轻链由一个轻链可变区(这里缩写为LCVR或VL)和一条轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域，CL构成。VH和VL区能进一步分为高变区，称作互补性决定区(CDR)，期间散布着更保守的称作构架区(FR)的区。每条VH和VL由三个CDRs和四个FRs构成，从氨基末端至羧基末端以下面的顺序排列FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。
这里使用的术语，抗体的″抗原-结合部分″(或者简单地″抗体部分″)，指保留特异性结合抗原(例如，hIL-18)能力的抗体的一个或几个片段。已经证明通过全长抗体的片段能完成抗体的抗原-结合功能。这样的抗体实施方案还可以是双特异性的，双重特异性的，或多特异性的形式；特异性结合两个或多个不同的抗原。术语抗体的″抗原-结合部分″所包括的结合片段的实施例包括(i)Fab片段，由VL，VH，CL和CH1结构域构成的一价片段；(ii)F(ab′)2片段，包括在铰链区通过二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域构成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域构成的Fv片段，(v)dAb片段(Ward等，(1989)Nature 341544-546)，其包括一个可变区；和(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，虽然Fv片段的两个结构域，VL和VH，由不同的基因编码，利用重组方法，通过使它们制备成其中VL和VH区对形成一价分子(已知是单链Fv(scFv)；参见，例如，Bird等(1988)Science 242423-426；和Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 855879-5883)的蛋白质单链的合成接头，能将它们连接。这样的单链抗体也包括在术语，抗体的″抗原-结合部分″中。也包括其他形式的单链抗体，例如双抗体。双抗体是二价，双特异性抗体，其中VH和VL结构域在单链多肽上表达，但是使用太短不能在相同链上两个结构域之间配对的接头，从而使结构域与另一个链的互补结构域配对，产生两个抗原结合位点(参见，例如，Holliger，P.，等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 906444-6448；Poljak，R.J.，等(1994)Structure 21121-1123)。这样的抗体结合部分是本领域公知的(Kontermann和Dubel编著，Antibody Engineering(2001)Springer-Verlag.New York.790pp.(ISBN 3-540-41354-5)。
此外，抗体或其抗原-结合部分可以是更大的免疫粘着分子，是通过抗体或抗体部分与一个或几个其他蛋白质或肽的共价或非共价结合形成的。这样的免疫粘着分子的；例子包括使用链霉抗生物素蛋白核心区形成四聚体scFv分子(Kipriyanov，S.M.，等(1995)HumanAntibodies and Hybridomas 693-101)，标记肽和C-末端多组氨酸标签形成二价的和生物素化scFv分子(Kipriyanov，S.M.，等(1994)Mol.Immunol.311047-1058)。抗体部分，例如Fab和F(ab′)2片段，能应用常规技术，例如分别对全抗体进行木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化而从全抗体制备。此外，应用这里描述的标准重组DNAa技术能获得抗体，抗体部分和免疫粘着分子。
这里使用的术语″分离的抗体″，意指基本上没有具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，特异性结合hIL-18的分离的抗体基本上没有特异性结合hIL-18以外抗原的抗体)。然而，特异性结合hIL-18的分离的抗体具有与其他抗原例如来自其他物种的IL-18分子的交叉反应性。此外，分离的抗体基本上没有其他细胞材料和/或化学品。
这里使用的术语″人抗体″意指包括具有来自人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区的抗体。本发明的人抗体可以包括不是人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如体外随机或定点诱变或通过体内体突变诱导的突变)，例如在CDRs中，特别是在CDR3中。然而，这里使用的术语″人抗体″不包括其中CDR序列来自另一个哺乳动物种系例如小鼠的种系的抗体接枝到人构架序列上。
这里使用的术语″重组人抗体″意在包括通过重组方法制备，表达，产生或分离的所有的人抗体，例如利用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体(在下面Il C章节进一步描述)，从重组组合人抗体库分离的抗体(Hoogenboom H.R.，(1997)TIB Tech.1562-70；Azzazy H.，和Highsmith W.E.，(2002)Clin.Biochem.35425-445；Gavilondo J.V.，和Larrick J.W.(2002)BioTechniques29128-145；Hoogenboom H.，和Chames P.(2000)lmmunologyToday 21371-378)，从人免疫球蛋白基因转基因的动物(例如小鼠)分离的抗体(参见，例如，Taylor，L.D.，等(1992)Nucl.AcidsRes.206287-6295；Kellermann S-A.，和Green L.L.(2002)Current Opinion in Biotechnology 13593-597；Little M.等(2000)Immunology Today 21364-370)或者通过涉及人免疫球蛋白基因序列与其他DNA序列剪接的任何其他方法制备，表达，产生或分离的抗体。这样的重组人抗体具有来自人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区。但是在一些实施方案中，对这样的重组人抗体体外诱变(或者，当体内体诱变使用人Ig序列的转基因动物时)，从而重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是来自体内人抗体种系全部中天然并不存在的人种系VH和VL序列或者与人种系VH和VL序列相关的序列。
术语″嵌合抗体″指包括来自一个物种的重链和轻链可变区序列和来自另一个物种的恒定区序列的抗体，例如具有与人恒定区连接的鼠重链和轻链可变区的抗体。
术语″CDR-接枝抗体″指包括来自一个物种的重链和轻链可变区，但是其中序列中VH和/或VL中一个或几个CDR区被另一个物种的CDR序列置换，例如具有其中一个或几个鼠CDRs(例如，CDR3)被人CDR序列置换的鼠重链和轻链可变区的抗体。
术语″人源化抗体″指包含来自非人物种(例如小鼠)但是其中VH和/或VL序列中至少一部分被变为更“人-样”，即人种系可变序列更相似的重链和轻链可变区序列的抗体。人源化抗体的一种类型是CDR-接枝抗体，其中人CDR序列导入非人VH和VL序列置换相应的非人CDR序列。
如这里使用的，术语″hIL-18中和结合蛋白″指特异性结合hIL-18并且中和hIL-18的生物活性的蛋白质。优选地，中和结合蛋白是其与hIL-18的结合导致hIL-18的生物活性被抑制的中和抗体。优选地，中和结合蛋白结合hIL-18并且将hIL-18的生物活性减小至少大约20％，40％，60％，80％，85％或更多。中和结合蛋白对hIL-18的生物活性的这种抑制作用能通过测定hIL-18生物活性的一个或几个指标来评定。hIL-18生物活性的这些指标能通过本领域公知的体外或体内分析的几种标准方法中的一种或几种来评定。
术语″表位″包括能特异性结合免疫球蛋白或T-细胞受体的任何多肽决定簇。在一些实施方案中，表位决定簇包括象氨基酸，糖侧链，磷酰基，或磺酰基这样的分子的化学活性表面基团，并且在一些实施方案中，可以具有特定的三维结构特征和/或特定电荷特征。表位是抗体结合的抗原的区。在一些实施方案中，当抗体优先识别蛋白质和/或大分子复合混合物中其靶物抗原时，抗体特异性结合抗原。
如这里使用的术语″表面等离振子共振″指一种光学现象，它使得通过检测生物传感器基体中蛋白质浓度的改变来分析实时生物特异性相互作用，例如利用BIAcore系统(Pharmacia Biosensor AB，Uppsala，Sweden and Piscataway，NJ)。为了进一步描述，参见Jonsson，U.，等(1993)Ann.Biol.Clin.5119-26；Jonsson，U.，等(1991)Biotechniques 11620-627；Johnsson，B.，等(1995)J.Mol.Recognit.8125-131；和Johnnson，B.，等(1991)Anal.Biochem.198268-277。
如这里使用的术语″Kon″，意指本领域公知的抗体与抗原缔合生成抗体/抗原复合体的生成速率常数。
如这里使用的术语″Koff″，意指本领域公知的抗体从抗体/抗原复合体离解的离解速率常数。
如这里使用的术语″Kd″，意指本领域公知的特定抗体-抗原相互作用的离解常数。
如这里使用的术语″标记的结合蛋白″，指带有插入的标记物提供结合蛋白鉴定的蛋白质。优选地，标记物是可检测标记，例如插入放射性标记的氨基酸或连接标记的抗生物素蛋白能检测的生物素基部分的多肽(例如，包含荧光标记物或者光学或比色方法能检测的酶活性的链霉抗生物素蛋白)。多肽的标记物的例子包括但不限于下面的放射性同位素或放射性核素(例如，3H，14C，35S，90Y，99Tc，111In，125I，131I，177Lu，166Ho，或153Sm)；荧光标记物(例如，FITC，罗丹明，镧系磷光剂)，酶学标记(例如，辣根过氧化物酶，荧光素酶，碱性磷酸酶)；化学发光标记物；生物素基团；预先确定的第二报告基团识别的多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列，二次抗体的结合位点，金属结合结构域，表位标签)；和有吸引力的试剂，例如钆螯合剂。
术语″缀合结合蛋白″指与第二化学部分，例如治疗性药物或细胞毒性试剂，化学连接的结合蛋白。术语″试剂″在这里用来指化合物，化合物的混合物，生物大分子，或者从生物材料制备的提取物。优选地，治疗性药物或细胞毒性试剂包括但不限于，百日咳毒素，紫杉酚，细胞松弛素B，短杆菌肽D，溴化乙锭，吐根碱，丝裂霉素，依托泊苷，tenoposide，长春新碱，长春碱，秋水仙碱，阿霉素，柔红霉素，二羟基炭疽菌素二酮，二羟蒽二酮，光辉霉素，放线菌素D，1-脱氢睾酮，糖皮质激素，普鲁卡因，丁卡因，利多卡因，普萘洛尔，和嘌呤霉素，和它们的类似物或同系物。
这里使用的术语″结晶结合蛋白″指以晶体形式存在的多肽。晶体是一种固态形式，它与其他形式例如无定形固态或液晶态截然不同。晶体由原子，离子，分子(例如蛋白质，象抗体)，或分子集合体(例如抗原/抗体复合体)有序的重复的三维排列组成。这些三维排列根据本领域公知的特殊数学关系排列。晶体中重复的基础单元，或者构件，称作不对称单元。证实给出确定的结晶学对称性的排列中重复的不对称单元提供晶体的″晶胞″。所有三个方向规则转换的晶胞的重复得到晶体。参见Giege，R.和Ducruix，A.Barrett，Crystallizationof Nucleic Acids and Proteins，a Practical Approach，2nd ea.，pp.201-16，Oxford University Press，New York，NewYork，(1999)″。
这里称作″多核苷酸″的术语在这里指两个或多个核苷酸，核糖核酸或脱氧核糖核酸或任何类型核苷酸的修饰形式的聚合形式。该术语包括单链和双链形式的DNA，但是优选双链DNA。
这里使用的术语″分离的多核苷酸″意思是多核苷酸(例如基因组的，cDNA，或者合成来源，或者它们的组合)，其由于其来源，″分离的多核苷酸″与自然界发现″分离的多核苷酸″的多核苷酸的全部或部分不相缔合；与自然界不连接的多核苷酸操作连接；或者在自然界不作为更大序列的部分而存在。
这里使用的术语″载体″意指能将它所连接的另一个核酸转运的核酸分子。载体的一种类型是″质粒″，它指其中可以连接另外的DNA片段的环状双链DNA环。载体的另一种类型是病毒载体，其中另外的DNA片段连接到病毒基因组中。一些载体能在导入它们的宿主细胞中自主复制(例如，有细菌复制起点的细菌载体和游离基因哺乳动物载体)。其他载体(例如，非游离型哺乳动物载体)在导入宿主细胞中时能被整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。此外，一些载体能指导它们操作连接的基因的表达。这样的载体在这里称作″重组表达载体″(或者简单地，″表达载体″)。一般情况下，重组DNA技术中使用的表达载体经常是质粒形式。本说明书中，″质粒″和″载体″可以互换使用，因为质粒是最常使用的载体形式。然而，本发明意在包括这样的表达载体的其他形式，例如病毒载体(例如，复制缺陷逆转录病毒，腺病毒和腺-相关病毒，它们起着同等的功能。
术语″操作连接″指其中将描述的成分相关联使得它们以期望的方式发挥功能的连接。与编码序列″操作连接″的调控序列以这样的方式连接使得在与调控序列相匹配的条件下实现编码序列的表达。″操作连接″序列包括与感兴趣的基因邻接的表达调控序列和以反式起作用或者与感兴趣的调控基因有距离的表达调控序列。
这里使用的″表达调控序列″指进行表达和加工它们连接的编码序列所必需的多核苷酸序列。表达调控序列包括合适的转录起始序列，中止序列，启动子和增强子序列；有效RNA加工信号，例如剪接和多腺苷酸酸化信号；稳定胞质mRNA的序列；提高翻译效率的序列(剂，Kozak共有序列)；提高蛋白质稳定性的序列；如果期望，增强蛋白质分泌的序列。这样的调控序列的性质根据宿主生物而不同；在原核生物中，这样的调控序列一般包括启动子，核糖体结合位点，和转录终止序列；在真核生物中，一般情况下，这样的调控序列包括启动子和转录终止序列。术语″调控序列″意在包括其存在对于表达和加工是必须的成分，并且还包括其存在是有利的附加成分，例如前导序列和融合配对物序列。
这里定义的″转化″指外源DNA进入宿主细胞的任何过程。利用本领域公知的各种各样的方法在天然或人为条件下可以发生转化。转化可以依赖公知的方法将外来核酸序列插入原核或真核宿主细胞。根据转化的宿主细胞选择方法并且包括但不限于，病毒感染，电穿孔，脂质转染，和粒子轰击。这样的″转化″细胞包括稳定转化的细胞，其中插入的DNA能作为自身复制质粒或者作为宿主染色体的部分复制。它们还可以包括瞬时表达插入的DNA或RNA有限时间的细胞。
这里使用的″重组宿主细胞″(或者简单地″宿主细胞″)意指其中已经导入外源DNA的细胞。应该理解这样的术语意在不仅指特定受体细胞，而且还有这样的细胞的后代。因为由于突变或环境影响，在后代中可能发生一些改变，这样的后代事实上可能与母本细胞不同，但是它仍然包括在这里使用的术语″宿主细胞″的范围内。优选地，宿主细胞包括选自生命界任何原核和真核细胞。优选的真核细胞包括原生生物，真菌，植物和动物细胞。最优选地，宿主细胞包括但不限于原核细胞系大肠杆菌；哺乳动物细胞系CHO和COS；昆虫细胞系Sf9；和真菌细胞啤酒糖酵母。
标准技术可以用于重组DNA，寡核苷酸合成，和组织培养和转化(例如，电穿孔，脂质转染)。酶促反应和纯化技术可以根据厂商说明书进行或者以本领域常规做法或者根据这里的描述进行。上述技术和方法一般根据本领域公知的常规方法和各种概述和更具体说明的参考文献的描述进行，这些参考文献在本说明书中引述并讨论。参见，例如，Sambrook等Molecular CloningA Laboratory Manual(第二版，冷泉港出版社，冷泉港，纽约(1989))，这里为了所有的目的引作参考。
正如本领域公知的和这里使用的，″转基因生物″，指有包含转基因的细胞的生物，其中导入生物体中的转基因(生物体的祖先)表达在生物体中天然并不表达的多肽。″转基因″是DNA构建体，其稳定操作整合导产生转基因生物体的细胞的基因组中，在转基因生物的一种或几种细胞类型或组织中指导编码基因产物的表达。
术语″调控″和″调节″互换使用，如这里使用的，指感兴趣的分子活性(例如，hIL-18的生物活性)的变化或改变。调控可以是感兴趣的分子的某些活性或功能大小的增加或减小。举例的分子的活性和功能包括但不限于，结合特征，酶活性，细胞受体激活，和信号转导。
相应地，这里使用的术语″调节剂″是能改变或变化感兴趣的分子的活性或功能(例如，hIL-18的生物活性)的化合物。例如，调节剂可以引起分子的某些活性或功能的大小与不存在调节剂所发现的活性或功能的大小相比有所增大或降低。在一些实施方案中，调节剂是抑制剂，其降低分子的至少一种活性或功能大小。举例的抑制剂包括但不限于蛋白质，肽，抗体，，peptibodies，碳水化合物或小有机分子。Peptibodies描述于，例如，WO01/83525。
这里使用的术语″激动剂″指一种调节剂，其当与感兴趣的分子接触时，引起分子的某些活性或功能的大小与不存在激动剂所发现的活性或功能的大小相比有所增大。特别感兴趣的激动剂包括但不限于，IL-18多肽，核酸，碳水化合物，或结合hIL-18的任何其他分子。
这里使用的术语″拮抗剂″或″抑制剂″指一种调节剂，其当与感兴趣的分子接触时，引起分子的某些活性或功能的大小与不存在拮抗剂所发现的活性或功能的大小相比有所增大。特别感兴趣的拮抗剂包括阻断或调节hIL-18的生物学或免疫学活性的那些。hIL-18的拮抗剂和抑制剂包括但不限于，蛋白质，核酸，碳水化合物，或结合hIL-18的任何其他分子。
这里使用的术语″样品″以其广义使用。这里使用的″生物样品″包括但不限于，来自活体或活体前的一定量物质。这样的活体包括但不限于，人，小鼠，大鼠，猴，狗，兔和其他动物。这样的物质包括但不限于，血液，血清，尿液，滑液，细胞，器官，组织，骨髓，淋巴结和脾。
这里使用的，一般公知的，本领域技术人员使用的，术语″竞争″，指一种蛋白质与第二种结合蛋白结合这两种结合蛋白共同的配体(例如，IL-18)的相互干扰或者阻碍的能力。用于测定结合蛋白的竞争特征的试验是本领域公知的。这里描述优选的竞争试验。
I.结合人IL-18的人抗体本发明的一个方面提供以高亲合力，低解离速率和高中和能力，结合I L-18分离的人抗体，其抗原结合部分。优选地，抗体，或者其部分是分离的抗体。优选地，本发明的人抗体是中和人抗-IL-18抗体。
A.抗IL-18抗体的制备方法通过本领域公知的多种技术可以制备本发明的抗体。制备本发明的抗-IL-18抗体的特别优选的方法包括使用XENOMOUSE转基因小鼠，并且使用本领域公知的用于制备抗体的杂交瘤和SLAM细胞操作技术(Abgenix，Inc.，Fremont，CA)，并且使用包括实施例3.2描述的IL-18肽的抗原，即，包括SEQ ID NO.1的氨基酸序列和其片段的人IL-18。
在本发明的一个实施方案中，通过用IL-18抗原免疫包括人免疫球蛋白基因座全部或部分的非人动物制备人抗体。在优选的实施方案中，非人动物是XENOMOUSE转基因小鼠，包括人免疫球蛋白基因座的大片段并且在小鼠抗体产生中缺乏的基因工程小鼠品系。参见，例如，Green等Nature Genetics 713-21(1994)和美国专利5,916,771，5,939,598，5,985,615，5,998,209，6,075,181，6,091,001，6,114,598和6,130,364。还参见1991年7月25日公开的WO91/10741，1994年2月3日公开的WO 94/02602，1996年10月31日公开的WO 96/34096和WO 96/33735，1998年4月23日公开的WO98/16654，1998年6月11日公开的WO 98/24893，1998年11月12日公开的WO 98/50433，1999年9月10日公开的WO 99/45031，1999年10月21日公开的WO 99/53049，2000年2月24日公开的WO 0009560，和2000年6月29日公开的WO 00/037504。XENOMOUSE转基因小鼠产生全人抗体的成人-样人抗体库，并且产生抗原-特异性人Mabs。XENOMOUSE转基因小鼠通过导入兆碱基大小的，人重链基因座和x轻链基因座的种系构型YA片段而包含大约80％人抗体库。参见Mendez等，Nature Genetics 15146-156(1997)，Green和Jakobovits J.Exp.Med.188483-495(1998)，其公开内容引作参考。
本发明还提供了通过免疫包括人免疫球蛋白基因座的非人转基因动物从非人非小鼠动物制备抗-IL-18抗体的方法。人们可以利用上面刚描述的方法制备这样的动物。这些专利文献中公开的方法可以根据美国专利5,994,619的描述改进。在优选实施方案中，非人动物可以是大鼠，绵羊，猪，山羊，牛或马。
在另一个实施方案中，包括人免疫球蛋白基因座的非人动物是人免疫球蛋白“小基因座”的动物。在小基因座研究中，通过从Ig基因座包含各个基因来模拟外源Ig基因座。这样，一个或几个VH基因，一个或几个DH基因，一个或几个JH基因，一个μ恒定区，和一个第二恒定区(优选γ恒定区)形成用于插入动物中的构建体。这项研究具体描述于美国专利No.5,545,807，5,545,806，5,625,825，5,625,126，5,633,425，5,661,016，5,770,429，5,789,650，5,814,318，5,591,669，5,612,205，5,721,367，5,789,215，和5,643,763，这里引作参考。
小基因座研究的好处是快捷，能产生包括Ig基因座的部分的构建体并且导入动物中。然而，小基因座研究的潜在的缺点是可能没有足够的免疫球蛋白多样性来支持全B-细胞发育，使得抗体产生较少。
为了制备人抗-IL-18抗体，用IL-18抗原免疫包括人免疫球蛋白基因座的一些或全部的非人动物，并且从动物分离抗体或产生抗体的细胞。IL-18抗原可以是分离的和/或纯化的IL-18，并且优选是人IL-18。在另一个实施方案中，IL-18抗原是IL-18的片段，优选成熟IL-18。在另一个实施方案中，IL-18抗原是包括至少一个IL-18的表位的片段。
对动物的免疫可以通过本领域公知的任何方法来进行。参见，例如，Harlow和Lane，AntibodiesA Laboratory Manual，纽约冷泉港出版社，1990。对非人动物例如小鼠，大鼠，绵羊，山羊，猪，�：吐斫忻庖叩姆椒ㄊ潜玖煊蚬�。参见，例如，Harlow和Lane，美国专利5,994,619。在优选的实施方案中，IL-18抗原与辅助剂一起施用刺激免疫应答。这样的辅助剂包括完全或不完全福氏佐剂，RIBI(胞壁酰二肽)或ISCOM(免疫刺激复合体)。这样的辅助剂通过局部沉积分离它而可以保护多肽不快速散播，或者它们可以含有刺激宿主分泌对巨噬细胞和免疫系统的其他成分有趋化性的物质。优选地，如果施用多肽，免疫程序包括施用两次或多次多肽，延续几周。
实施例2.2.A提供用磷酸盐缓冲盐水中人IL-18免疫XENOMOUSE转基因小鼠的方案。
B.抗体和产生抗体的细胞系的产生用IL-18抗原免疫动物之后，可以从动物获得抗体和/或产生抗体的细胞。通过从动物取血或杀死动物而从动物获得含有抗-IL-18抗体的血清。可以使用从动物获得的血清，从血清获得的免疫球蛋白级分，或者从血清纯化的抗-IL-18抗体。以这种方式获得的血清或免疫球蛋白是多克隆的，因此带有一系列异源性质。
在另一个实施方案中，可以从受免疫动物制备产生抗体的无限繁殖杂交瘤。免疫之后杀死动物，并且根结本领域公知的，将B脾细胞与无限繁殖骨髓瘤细胞融合。参见，例如，Harlow和Lane，上文。在优选实施方案中，骨髓瘤细胞不分泌免疫球蛋白多肽(非分泌细胞系)。融合抗生素选择之后，使用IL-18，或者其部分，或表达IL-18的细胞筛选杂交瘤。在优选实施方案中，利用酶联免疫分析(ELISA)或者放射免疫分析(RIA)进行最初的筛�。叛LISA。WO 00/37504中提供了ELISA筛选的实施例，这里引作参考。
选择产生抗-IL-18抗体的杂交瘤，克�。⑶医徊缴秆∑谕奶卣鳎ㄇ拷≡咏涣錾ぃ呖固宀推谕目固逄卣鳎旅娼徊教致�。培养杂交瘤并且在同源动物体内，在没有免疫系统的动物，例如，裸鼠，中展开，或者在培养基中体外培养。筛�。寺『屠┱乖咏涣龅姆椒ㄊ潜玖煊蚣际跞嗽惫�。
优选地，免疫动物是表达人免疫球蛋白基因并且B脾细胞与来自和非人动物相同物种的骨髓瘤融合的非人动物。更优选地，免疫动物是XENOMOUSE转基因小鼠，骨髓瘤细胞系是非-分泌小鼠骨髓瘤，例如骨髓瘤细胞系是P3X63Ag8.653(参见，例如，实施例2.2.B)。
一方面，本发明提供产生人抗-IL-18抗体的杂交瘤。在优选的实施方案中，杂交瘤是小鼠杂交瘤，如上所述。在另一个优选的实施方案中，杂交瘤是在非人非小鼠物种中产生的，例如大鼠，绵羊，猪，山羊，牛或马。在另一个实施方案中，杂交瘤是人杂交瘤，其中人非分泌骨髓瘤与表达抗-IL-18抗体的人细胞融合。
在本发明的另一个方面，利用本领域称作筛选淋巴细胞抗体方法(SLAM)的方法从单一的分离的淋巴细胞制备重组抗体，如美国专利No.5,627,052，PCT公开WO 92/02551，和Babcock，J.S.等(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 937843-7848所述。在该方法中，应用抗原特异性溶血血小板测试来筛选I(A)章节中描述的任何一种免疫动物得到的分泌感兴趣的抗体的单一细胞，例如淋巴细胞，在抗原特异性溶血血小板测试中，抗原IL-18，或者其片段，利用接头，例如生物素，与绵羊红细胞偶联，并且用来鉴定分泌对IL-18有特异性的抗体的单一细胞。鉴定感兴趣的分泌抗体的细胞之后，通过逆转录酶-PCR从细胞获得重链和轻链可变区cDNAs，然后在哺乳动物细胞例如COS或CHO细胞中，在合适的免疫球蛋白恒定区(例如，人恒定区)的上下游表达这些可变区。用来自体内筛选的淋巴细胞的扩增的免疫球蛋白序列转染宿主细胞，然后进一步分析并体外筛�。缤ü棺鞠赴掷氡泶锟笽L-18抗体的细胞。进一步体外操作扩增的免疫球蛋白序列，例如通过体外亲和性成熟方法，例如PCT公开WO 97/29131和PCT公开WO 00/56772中描述的那些。
也可以利用体外方法来制备本发明的抗体，其中筛选抗体库来鉴定具有期望的结合特异性的抗体。这样筛选重组抗体库的方法是本领域公知的并且包括例如下面文献中描述的方法Ladner等，美国专利No.5,223,409；Kang等，PCT公开No.WO92/18619；Dower等，PCT公开No.WO 91/17271；Winter等，PCT公开No.WO 92/20791；Markland等，PCT公开No.WO 92/15679；Breitling等，PCT公开No.WO 93/01288；McCafferty等，PCT公开No.WO 92/01047；Garrard等，PCT公开No.WO 92/09690；Fuchs等(1991)BiolTechnology 91370-1372；Hay等(1992)Hum Antibod Hybridomas381-85；Huse等(1989)Science 2461275-1281；McCafferty等，Nature(1990)348552-554；Griffiths等，(1993)EMBO J12725-734；Hawkins等(1992)J Mol Biol 226889-896；Clackson等(1991)Nature 352624-628；Gram等(1992)PNAS893576-3580；Garrad等(1991)Bio/Technology 91373-1377；Hoogenboom等(1991)Nucl Acid Res 194133-4137；和Barbas等(1991)PNAS 887978-7982，美国专利申请公开20030186374，和PCT公开No.WO 97/29131，这些文献的内容在此引作参考。
重组抗体库可以来自用IL-18，或IL-18的部分免疫的受试者。或者，重组抗体库可以来自裸受试者，即，没有用IL-18免疫的受试者，例如从没有用人IL-18免疫的人受试者获得的人抗体库。通过用包括人IL-18的肽(例如，相应于hIL-18的部分的肽)筛选重组抗体库来筛选本发明的抗体，从而筛选识别IL-18的那些抗体。实施这样的筛选和选择的方法是本领域公知的，例如上一段中的参考文献中描述的的。为了筛选对hIL-18具有特定的结合亲和性的本发明的抗体，例如以特定解离速率常数从人IL-18离解的那些，能利用本领域公知的表面等离振子共振的方法来筛选具有期望的解离速率常数的抗体。为了筛选对hIL-18具有特定中和活性的本发明的抗体，例如具有特殊IC50的那些，可以利用本领域公知的评价hIL-18活性的抑制作用的本领域公知的标准方法。
一方面，本发明提供分离的抗体，或者结合人IL-18的其抗原结合部分。优选地，抗体是中和抗体。优选地，抗体是人抗体。在很多实施方案中，抗体是重组抗体或单克隆抗体。本发明最优选的中和抗体在这里称作2.5(E)，并且具有SEQ ID NO7的氨基酸序列的VL和SEQ IDNO6的氨基酸序列的VH。最优选地，2.5(E)抗体结合人IL-18，Kd小于5×1010M(参见实施例2.2.F)。
优选地，本发明的抗-IL-18抗体，例如2.5(E)抗体和相关抗体，具有减小或中和IL-18活性的能力，例如，根据本领域公知的几种体外和体内测试所测定的(例如，参见实施例3.2.F)。例如，这些抗体中和KG-1细胞中人γ干扰素的IL-18-诱导的产生，IC50值的范围至少大约10-8M，大约10-9M，或者大约10-10M。此外，这些抗体还中和全血细胞中人γ干扰素的IL-18-诱导的产生，IC50值的范围至少大约10-8M，大约10-9M，或者大约10-10M。
在特别优选的实施方案中，抗-IL-18抗体2.5(E)结合各种形式的人IL-18，包括IL-18原，成熟IL-18和截短的IL-18。抗体2.5(E)不特异性结合其他细胞因子，例如IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12，IL-13，IL-15，IL-16，IL-17，IL-21，TNF，LT(淋巴毒素)，LTα1β2，和LTα2β1。但是，抗体2.5(E)与来自其他物种的IL-18没有交叉反应性。例如，抗体中和来自cynomolgus猴的IL-18的活性(IC50for cyno IL-18＝9.E×10-11；参见实施例2.2.J1)。
一方面，本发明提供2.5(E)抗体和功能抗体部分，2.5(E)-相关抗体和功能抗体部分，与2.5(E)等同性质的其他人抗体和功能抗体部分，例如以低离解动力学和高中和能力结合IL-18的高亲和性。在优选的实施方案中，分离的抗体，或者其抗原-结合部分，结合人IL-18，根据表面等离振子共振所测定的，其中抗体，或者其抗原-结合部分，其中抗体，或者其抗原-结合部分，以大约0.1s-1或更小的Koff速率常数从人IL-18离解，或者其以大约1×10-6M或更小的IC50抑制人IL-18活性。或者，根据表面等离振子共振所测定的，抗体，或者其抗原-结合部分，可以以大约1×10-2s-1或更小的Koff速率常数从人IL-18离解，或者其以大约1×10-7M或更小的IC50抑制人IL-18活性。或者，根据表面等离振子共振所测定的，抗体，或者其抗原-结合部分，可以以大约1×10-3s-1或更小的Koff速率常数从人IL-18离解，或者其以大约1×10-8M或更小的IC50抑制人IL-18活性。或者，根据表面等离振子共振所测定的，抗体，或者其抗原-结合部分，可以以大约1×10-4s-1或更小的Koff速率常数从人IL-18离解，或者其以大约1×10-9M或更小的IC50抑制人IL-18活性。或者，根据表面等离振子共振所测定的，抗体，或者其抗原-结合部分，可以以大约1×10-5s-1或更小的Koff速率常数从人IL-18离解，或者其以大约1×10-10M或更小的IC50抑制人IL-18活性。或者，根据表面等离振子共振所测定的，抗体，或者其抗原-结合部分，可以以大约1×10-5s-1或更小的Koff速率常数从人IL-18离解，或者其以大约1×10-11M或更小的IC50抑制人IL-18活性。
在另一个实施方案中，本发明提供分离的人抗体，或其抗原结合部分，具有包括SEQ ID NO7；SEQ ID NO9；SEQ ID NO11；SEQ IDNO13；SEQ ID NO15；SEQ ID NO17；SEQ ID NO19；SEQ IDNO21；SEQ ID NO23；SEQ ID NO25；SEQ ID NO27；SEQ ID NO29；SEQ ID NO31；SEQ ID NO33；SEQ ID NO35；SEQ ID NO37；SEQ ID NO39；或SEQ ID NO41的氨基酸序列的轻链可变区(VL)，和包括SEQ ID NO6；SEQ ID NO8；SEQ ID NO10；SEQ ID NO12；SEQ ID NO14；SEQ ID NO16；SEQ BD NO18；SEQ ID NO20；SEQ ID NO22；SEQ ID NO24；SEQ ID NO26；SEQ ID NO28；SEQ ID NO30；SEQ ID NO32；SEQ ID NO34；SEQ ID NO36；SEQID NO38；或SEQ ID NO40的氨基酸序列的重链可变区(VH)。
在一些实施方案中，抗体包括重链恒定区，例如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA，IgE，IgM或IgD恒定区。优选地，重链恒定区是IgG1重链恒定区或IgG4重链恒定区。此外，抗体包括轻链恒定区，κ轻链恒定区或λ轻链恒定区。优选地，抗体包括κ轻链恒定区。或者，抗体部分可以是，例如，Fab片段或单链Fv片段。
Fc部分中氨基酸残基的置换改变抗体效应子功能是本领域公知的(Winter，等，美国专利No.5,648,260；5624821)。抗体的Fc部分介导几种重要效应子功能，例如细胞因子诱导，ADCC，吞噬作用，补体依赖性细胞毒性(CDC)和抗体和抗原-抗体复合体的半衰期/清除率。在一些情况下，对于治疗性抗体，这些效应子功能是所期望的，但是在另一些情况下可能是不需要的甚至是有害的，取决于治疗目标。一些人IgG同位型，特别是IgG1和IgG3，分别通过与FcγRs和补体C1q结合而介导ADCC和CDC。新生Fc受体(FcRn)是决定抗体的循环半衰期的关键成分。在另一个实施方案中，抗体的恒定区例如抗体的Fc区中至少一个氨基酸残基被置换，使得抗体的效应子功能被改变。
一个实施方案提供了标记的结合蛋白，其中本发明的抗体或抗体部分被衍生化或者连接另一个功能分子(例如，另一个肽或蛋白质)。例如，通过将本发明的抗体或抗体部分(通过化学偶联，基因融合，非共价结合或者其他)与一个或几个其他分子部分功能连接，能衍生本发明的标记的结合蛋白，所述其他分子部分例如另一种抗体(例如，双特异性抗体或二联抗体)，可检测试剂，细胞毒性试剂，药物物质，和/或能介导抗体或抗体部分与另一种分子(例如链霉抗生物素蛋白核心区或多组氨酸标签)结合的蛋白质或肽。
本发明的抗体或抗体部分可以被衍生化的有用可检测试剂包括荧光化合物。举例的荧光可检测试剂包括荧光素，荧光素异硫氰酸酯，罗丹明，5-二甲基胺-1-萘磺酰基氯，藻红蛋白等等。还可以用可检测酶将抗体衍生化，例如用碱性磷酸酶，辣根过氧化物酶，葡萄糖氧化酶等等能够。当用可检测酶将抗体衍生化时，通过加入另外的试剂检测它，酶用来产生可检测反应产物。例如，当存在可检测试剂辣根过氧化物酶时，加入过氧化氢和二氨基联苯胺产生有色反应产物，其是可检测的。也可以用生物素将抗体衍生物化，并且通过间接测定抗生物素蛋白或链酶抗生物素蛋白结合来测定。
本发明的另一个实施方案提供结晶结合蛋白。优选地，本发明涉及这里公开的全抗-IL-18抗体及其片段的结晶，含有这样的结晶的制剂和组合物。在一个实施方案中，结晶的结合蛋白具有比结合蛋白的可溶配对物更长的体内半存留期。在另一个实施方案中，结合蛋白在结晶之后保留了生物活性。
根据本领域公知的方法和根据中公开的，可以制备本发明的结晶结合蛋白，WO 02072636在此引作参考(也参见例如2.2.M)。
本发明另一个实施方案提供糖基化结合蛋白，其中抗体或抗原-结合部分包括一个或几个糖残基。最初的体内蛋白质的产生可以进一步加工，这是翻译后修饰。特别地，糖(乙二醇)残基可以酶促加上，这个过程是糖基化作用。得到的带有共价连接的寡糖侧链的蛋白质已知是糖基化蛋白质或糖蛋白。蛋白质糖基化作用取决于感兴趣的蛋白质的氨基酸序列，以及其中表达蛋白质的宿主细胞。不同的生物体可以产生不同的糖基化作用酶(例如，糖基转移酶和糖苷酶)，并且具有不同的底物(核苷酸糖类)。由于这样的因素，蛋白质糖基化模式，糖基残基的成分可以根据其中表达特定蛋白质的宿主系统而不同。本发明中使用的糖基残基可以包括但不限于，葡萄糖，半乳糖，甘露糖，岩藻糖，n-乙酰氨基葡萄糖和唾液酸。优选地，糖基化结合蛋白包括糖基化残基，使得糖基化模式是人的。
本领域技术人员公知不同的蛋白质糖基化作用可以产生不同的蛋白质特征。例如，与哺乳动物例如CHO细胞系中表达的相同蛋白质相比，微生物宿主例如使用酵母内源途径的酵母中产生的糖基化的治疗性蛋白质的功效可能被减小。这样的糖蛋白在人体中也可以是免疫原性的并且具有给药后减小的体内半存留期。人和其他动物中的特异受体可以识别特异糖基残基并且促进蛋白质在血液中的快速清除。其他副作用包括蛋白质折叠，可溶性，对蛋白酶的灵敏性，运输，转运，区室化，分泌，被其他蛋白质或因子识别，抗原性，或变应原性的改变。因此，医师可能优选具有特定糖基化作用成分和模式的治疗性蛋白质，例如与人细胞中或关注的受试者动物的物种-特异性细胞中产生的相同或至少相似的糖基化成分和模式。
通过基因修饰宿主细胞来表达异源糖基化酶，可以实现与宿主细胞不同的糖基化蛋白质的表达。应用本领域公知的技术，医师可以获得具有人蛋白质糖基化作用的抗体或其抗原-结合部分。例如，对酵母菌株进行基因修饰来表达非天然存在的糖基化酶，使得这些酵母菌株中产生的糖基化蛋白质(糖蛋白)具有与动物细胞特别是人细胞产生的相同的蛋白质糖基化作用(美国专利申请20040018590和20020137134)。
此外，本领域技术人员明白，使用经基因工程处理的表达各种糖基化酶的宿主细胞库，可以表达感兴趣的蛋白质，使得库中成员宿主细胞产生具有不同糖基化作用模式的感兴趣的蛋白质。医师可以选择并分离具有特定糖基化作用模式的感兴趣的蛋白质。优选地，具有特定的选择的新的糖基化作用模式的蛋白质具有改善的或改变的生物性质。
C.重组IL-18抗体的产生通过本领域公知的各种技术可以制备本发明的抗体。例如，从宿主细胞表达，其中编码重链和轻链的表达载体通过标准技术被转染导宿主细胞中。各种形式的术语″转染″意在包括通常用于将外源DNA导入原核或真核细胞中的各种技术，例如，电穿孔，磷酸钙沉淀，DEAE-葡聚糖转染等。虽然有可能在原核或真核宿主细胞中表达本发明的抗体，但是在真核细胞中表达是优选的，最优选在哺乳动物宿主细胞中表达抗体，因为这样的真核细胞(特别是哺乳动物细胞)比原核细胞更有可能装配和分泌适当地折叠并具有免疫活性的抗体。
用于表达本发明的重组抗体的优选的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)(包括dhfr-CHO细胞，描述于Urlaub和Chasin，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 774216-4220，与DHFR选择标记物一起使用，例如，如R.J.Kaufman和P.A.Sharp(1982)Mol.Biol.159601-621)所述，NSO骨髓瘤细胞，COS细胞和SP2细胞。当将编码抗体基因的重组表达载体导入哺乳动物宿主细胞中时，通过将宿主细胞培养足以使抗体在宿主细胞中表达的时间来制备抗体，或者，更优选地，抗体分泌到宿主细胞在其中生长的培养基中。
利用标准蛋白质纯化技术从培养基中回收抗体。宿主细胞还可以用来制备功能抗体片段，例如Fab片段或scFv分子。理解上述方法中的变化在本发明的范围内。例如，可以预期用编码本发明的抗体的轻链和/或重链的功能片段的来转染宿主细胞。还可以利用重组DNA技术来去除对于与感兴趣的抗原结合不是必需的编码轻链和重链之一的DNA的一些或部分。这样截短的DNA分子表达的分子也包括在本发明的抗体内。另外，可以制备双功能抗体，其中一个重链和一个轻链是本发明的抗体，而另一个重链和轻链对于感兴趣的抗原之外的抗原是特异性的，通过标准化学交联方法使本发明的抗体与第二抗体交联。
在本发明抗体或抗原-结合部分的重组表达的优选系统中，通过磷酸钙介导的转染，将编码抗体重链和抗体轻链的重组表达载体导入dhfr-CHO细胞。在重组表达载体中，抗体重链和轻链基因各自操作连接于CMV增强子/AdMLP启动子调控元件，驱动高水平基因转录。重组表达载体还带有DHFR基因，其用于使用甲氨喋呤筛选/扩增用载体转染的CHO细胞的筛选。培养选择的转化子宿主细胞让它表达抗体重链和轻链，并且从培养基回收完整抗体。利用标准分子生物技术来制备重组表达载体，转染宿主细胞，选择转化子，培养宿主细胞，并且从培养基回收抗体。本发明还提供通过在合适的培养基中培养本发明的宿主细胞直到合成本发明的重组抗体来合成本发明的重组抗体的方法。该方法进一步包括从培养基分离重组抗体。
表1是本发明优选的抗-hIL-18抗体的VH和VL区的氨基酸序列的表。在VH区中，氨基末端(N-末端)的位置1中天然存在的氨基酸是谷氨酸(E)或谷氨酰(Q)。但是，为了在包括VH区的蛋白质的大规模生产中产生带有同源N-末端的重组蛋白质，N-末端的位置1优选谷氨酸(E)。
表1 VH和VL区的氨基酸序列列表
上面分离的抗-IL-18抗体CDR序列确立了根据本发明分离的并且包括下面表2列出的CDR序列的多肽的IL-18结合蛋白的新家族。为了制备和选择具有优选IL-18结合和/或中和活性的本发明的CDR，可以使用本领域公知的标准方法来制备本发明的结合蛋白并且评价那些结合蛋白的IL-18结合和/或中和特征，包括但不限于这里具体描述的那些。
表2共有IL-18 CDR亲和配体(下面列出每个氨基酸位置可供选择的残基；-表示残基可以不存在)。
D.抗-IL-18抗体的应用由于它们与人IL-18结合的能力，本发明的抗-人IL-18抗体，或者其部分能用来检测人IL-18(例如，生物样品中的，例如血清或血浆)，利用常规的免疫分析，例如常用的酶联免疫吸着测定法(ELISA)，放射免疫测定法(RIA)或组织免疫组织化学法。本发明提供检测生物样品中人IL-18的方法，包括使生物样品接触本发明的抗体或抗体部分，并且检测与IL-18结合的抗体(或抗体部分)或没有结合的抗体(或抗体部分)，从而检测生物样品中的人IL-18。用可检测物质直接或间接标记抗体有利于结合或没有结合的抗体的检测。合适的可检测物质包括各种酶，非朊基基团，荧光材料，发光材料和放射性材料。合适的酶的例子包括辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的非朊基基团复合体的例子包括链霉抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适的荧光材料的例子包括7-羟基香豆素，荧光素，荧光素异硫代氰酸酯，罗丹明，二氯三嗪基胺荧光素，丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的例子包括鲁米诺；合适的放射性材料的例子包括3H，14C，35S，90Y，99Tc，111In，125I，131I，177Lu，166Ho，或153Sm。
供标记抗体可选择的，通过使用用可检测物质标记的hIL-18标准物和没有标记的抗-人IL-18抗体的竞争免疫测定能测定生物液体中的人IL-18。在该项分析中，生物样品，标记的rhIL-18标准物和抗-人IL-18抗体合并，并且测定与没有标记的抗体结合的标记的rhIL-18标准物的量。样品中，人IL-18的量与和抗-人IL-18抗体结合的标记的rhIL-18标准物的量成反比。
本发明的抗体和抗体部分优选能体外和体内中和人IL-18活性。因此，例如，在含有hIL-18的细胞培养物中，在IL-18与本发明的抗体有交叉反应的人受治疗者中或者其他哺乳动物受治疗者中，这样的本发明的抗体和抗体部分能用来抑制hIL-18活性。在一个实施方案中，本发明提供抑制IL-18活性的方法，包括使IL-18接触本发明的抗体或抗体部分，使得IL-18活性被抑制。优选地，IL-18是人IL-18。例如，在含有或怀疑含有hIL-18的细胞培养物中，向培养基加入本发明的抗体或抗体部分，抑制培养物中的hIL-18活性。
在另一个实施方案中，本发明提供减小受治疗者IL-18活性的方法，有利地对患有其中IL-18活性是有害的疾病或病症的患者减小IL-18活性。本发明提供对患有这样的疾病或病症的患者减小IL-18活性的方法，该方法包括对受治疗者施用本发明的抗体或抗体部分，使得患者体内IL-18活性被减小。
优选地，IL-18是人IL-18并且受治疗者是人受治疗者。或者，受试者可以是表达能结合本发明的抗体的IL-18的哺乳动物。还有，受治疗者还可以是导入了hIL-18的哺乳动物(例如，通过施用hIL-18或者通过hIL-18转基因的表达)。为了治疗目的，可以对人受治疗者施用本发明的抗体。此外，为了兽医的目的或者作为人疾病的动物模型，能对表达IL-18的非人哺乳动物施用本发明的抗体，其中抗体能结合。关于后一种情况，这样的动物模型对于评价本发明的抗体的治疗功效是有用的(例如，剂量试验和给药持续时间)。
如这里使用的，术语″其中IL-18活性是有害的疾病″意在包括其中已经确诊患有疾病的患者体内存在IL-18是或者怀疑是疾病病理原因或者使疾病恶化原因的因素的疾病或其他病症。因此，其中IL-18活性是有害的疾病是其中预期IL-18活性的减小减轻疾病的症状和/或进展的疾病。患有疾病的患者的生物液体中IL-18浓度的增加可以证实这种疾病(例如，患者的血清，血浆，滑液等中IL-18浓度的增加)，利用例如上述抗-IL-18抗体能检测。能使用本发明的抗体治疗的疾病的非限制性例子包括下面涉及本发明的抗体的药物组合物的章节中讨论的那些疾病。
D.药物组合物本发明还提供含有本发明的抗体或其抗原-结合部分和药学可接受载体的药物组合物。在一个实施方案中，药物组合物进一步含有至少一种用于治疗其中IL-18活性是有害的疾病另外的治疗药物。
本发明的抗体和抗体部分能被掺入适合对患者给药的药物组合物中。典型地，药物组合物含有本发明的抗体或抗体部分和药学可接受载体。这里使用的，″药学可接受载体″包括生理相容的任何和所有溶剂，分散介质，抗细菌剂和抗真菌剂，等张剂和吸收延迟剂等。药学可接受载体的例子包括下面的一种或几种水，盐水，磷酸盐缓冲盐水，葡萄糖，甘油，乙醇等，以及它们的组合。很多情况下，组合物中优选含有等张剂，例如糖，多元醇，例如甘露糖醇，山梨醇或氯化钠。药学可接受载体还包括少量辅助物质，例如湿润剂或乳化剂，防腐剂或缓冲液，它们提高抗体或抗体部分的贮存期或效率。
本发明的抗体和抗体部分能被掺入适合肠胃外给药的药物组合物中。优选地，抗体或抗体-部分制备成含有0.1-250毫克/毫升抗体的注射液。注射液包括硬质或琥珀小瓶，安瓿或预先装填的注射器中的液体或冻干剂型。缓冲剂可以是L-组氨酸(1-50mM)，最佳5-10mM，pH 5.0质7.0(最佳pH 6.0)。合适的缓冲剂包括但不限于，琥珀酸钠，柠檬酸钠，磷酸钠或磷酸钾。可以用氯化钠来改变0-300mM(对于液体剂型最佳150mM)浓度的溶液的毒性。冻干剂型可以含有抗冻剂，主要是0-10％蔗糖(最佳0.5-1.0％)。其他合适的抗冻剂包括海藻糖和乳糖。冻干剂型可以含有膨胀剂，主要是1-10％甘露糖醇(最佳2-4％)。液体和冻干剂型可以含有稳定剂，主要是1-50mM L-甲硫氨酸(最佳5-10mM)。其他合适的膨胀剂包括甘氨酸，精氨酸，可以含有0-0.05％吐温-80(最佳0.005-0.01％)。另外的表面活性剂包括但不限于吐温20和BRIJ表面活性剂。
本发明的组合物可以是各种各样的剂型。这些包括，例如，液体，半固体和固体剂型，例如溶液(例如，注射液和灌注液)，分散剂或悬浮剂，片剂，丸剂，粉末剂，脂质体和栓剂。优选剂型取决于想要的给药方式和治疗应用。典型优选组合物是注射液或灌注液，例如与用其他抗体对人被动免疫使用的那些相似的组合物。优选的给药方式是肠胃外(例如，静脉内，皮下，腹膜内，肌内)。在优选的实施方案中，通过静脉内灌注或注射施用抗体。在另一个优选的实施方案中，通过肌内或皮下施用抗体。
治疗性组合物一般必须是灭菌的并且在制备和贮存条件下是稳定的。组合物可以配制成溶液，微乳剂，分散剂，脂质体，或者适合高药物浓度的其他有序结构。通过将活性化合物(即抗体或抗体部分)与上面例举的成分的一种或组合一起掺入需要量的合适的溶剂，如果需要，接着无菌过滤，能制备灭菌注射液。一般情况下，通过将活性成分掺入到含有基本分散基质和上面例举的那些的其他成分的无菌赋形剂中来制备分散剂。在无菌情况下，无菌注射液制剂的冻干粉末剂，制剂的优选方法是真空干燥和喷雾干燥，得到活性成分加预先灭菌过滤的溶液的任何附加期望的成分的粉末剂。例如，通过使用包衣例如卵磷脂，通过在分散剂情况下保持要求的粒度和通过使用表面活性剂，能保持溶液的合适的流动性。通过组合物中含有延迟吸收的物质，例如一硬脂酸盐和明胶，能使可注射组合物延续吸收。
通过本领域公知的各种方法能施用本发明的抗体和抗体-部分，但是对于很多治疗性应用，优选的给药途径/方式是皮下注射，静脉内注射或输液。如本领域技术人员明白的，给药途径/方式根据预期结果而不同。在一些实施方案中，使用保护化合物抗快速释放的载体可以制备活性化合物制剂，例如控制释放制剂，包括植入物，透皮贴，和微胶囊送药系统。可以使用可生物降解生物匹配聚合物，例如乙烯醋酸乙烯酯，聚酐类，聚乙二醇酸，胶原，聚原酯，和聚乳酸。这样的制剂的很多制备方法申请了专利或者一般为本领域技术人员公知的。参见，例如，Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems，J.R.Robinson，编著，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。
在一些实施方案中，本发明的抗体或抗体部分可以例如和惰性稀释剂或可同化可食用载体一起口服给药。化合物(如果期望，和其他成分)还可以在硬或软外壳明胶胶囊中封闭，压制成片，或者直接掺到患者的食物中。对于口服治疗给药，化合物可以与赋形剂混合并且以摄食片剂，口腔片剂，锭剂，胶囊，酏剂，悬浮剂，糖浆，糯米纸囊剂等剂型使用。对于通过肠胃外给药之外的本发明化合物的施用，必需用防止它失活的材料将化合物包衣，或者与化合物共同给药。
还可以向组合物中掺入补充活性化合物。在一些实施方案中，本发明的抗体或抗体部分与用于治疗其中IL-18活性是有害的疾病的一种或几种另外的治疗药物共同配制和/或共同给药。例如，本发明的抗-hIL-18抗体或抗体部分可以与结合其他靶物的一种或几种另外的抗体(例如，结合其他细胞因子或结合细胞表面分子的抗体)共同配制和/或共同给药。此外，本发明的一种或几种抗体可以与上述治疗药物的一种或几种联合使用。这样的联合治疗可以有利地使用较低剂量的施用的治疗药物，从而避免与各种单一治疗相关的可能的毒性或并发症。
在一些实施方案中，抗IL-18抗体或者其片段与本领域公知的半存留期伸长赋形剂连接。这样的赋形剂包括但不限于，Fc结构域，聚乙二醇，和葡萄糖。这样的赋形剂描述于，例如，美国申请顺序号No.09/428,082和公开的PCT申请No.WO 99/25044，它们为了任何目的在此引作参考。
在与各种涉及免疫和炎症元素的疾病相关的病理中，白介素18起着关键作用。这些疾病包括但不限于类风湿性关节炎，骨关节炎，幼年型慢性关节炎，脓毒性关节炎，莱姆关节炎，银屑病关节炎，反应性关节炎，和脓毒性关节炎，脊椎关节�。砗彀呃谴窒扌曰爻ρ祝Ｑ裥越岢ρ祝ρ祝鹊核匾览敌蕴悄虿。鬃聪傺祝涮从膊。Ｆぱⅲぱ子财げ。浦参锟顾拗鞑。鞴僖浦才乓欤毙曰蚵缘挠肫鞴僖浦蚕喙氐拿庖呒膊。庾戳霾。鲋嘌不バ匝苣蹋琄awapapki′s�。珿rave′s病，肾病综合征，慢性疲劳综合征，Wegener′s肉芽肿�。琀enoch-Schoenlein紫癜，肾微结节性脉管炎，慢性活性肝炎，眼色素层炎，脓毒性休克，中毒休克综合征，脓毒症综合征，恶病质，传染�。杉纳嬉鸬募膊。筇烀庖呷毕葑酆险鳎毙院嵯蚬撬柩祝琀untington′s舞蹈�。两鹕。缋闲猿沾簦蟹纾⒏喂δ苷习鸬母斡不苎云堆裥灾琢觯脑嗨ソ撸募」Ｈ珹ddison′s�。⒎⑿裕琁型多腺缺乏和II型多腺缺乏，Schmidt′s综合征，成人(急性)呼吸抑制综合征，脱发，脱发斑，血清反应阴性关节�。亟诓。琑eiter′s�。Ｆぱ⒐亟诓。Ｑ裥越岢亟诓。ぱ祝戮笠吆蜕趁攀暇喙毓亟诓。棺倒亟诓。鲋嘌膊�/动脉硬化，特应性变态反应，自身免疫大疱�。俺Ｐ蕴祓宕湟缎蕴祓宕嗵祓宕咝訧gA�。陨砻庖呷苎云堆珻oombs阳性溶血性贫血，后天性恶性贫血，少年恶性贫血，肌痛性大脑炎/Royal Free�。哉衬てし裟钪榫。尴赴亟谘祝⒂不窝祝鹨虿幻髯陨砻庖吒窝祝筇煨悦庖呷毕莶∽酆险鳎筇煨悦庖呷毕菹喙丶膊。腋危危胀ǜ魇礁餮拿庖呷毕�(普通各式各样的血丙种球蛋白减少)，膨胀心肌�。圆辉兄ⅲ殉菜ソ撸绮殉菜ソ撸宋湫苑尾。鹨虿幻鞯南宋橹纬裳啦垩祝缀蠹渲史尾。渲示窒扌苑窝祝爰渲史尾∠喙氐牡藿嶙橹膊。敕尾∠喙氐幕旌系藿嶙橹膊。爰渲史尾∠喙氐娜碛不爰渲史尾∠喙氐睦喾缡怨亟谘祝敕尾∠喙氐娜砗彀呃谴敕尾∠喙氐钠し艏⊙�/多肌炎，与肺病相关的Sjogren′s�。敕尾∠喙氐慕┯布棺笛祝峤谛月龉苎酌稚⒎尾。敕尾∠喙氐暮扑爻磷挪。┪镆鸬募渲史尾。宋湎宋杖悦钢苎祝允人嵝苑窝祝馨拖赴笮苑尾。静『蠹渲史尾。捶绻亟谘祝陨砻庖吒窝祝�1-型自身免疫肝炎(典型自身免疫或狼疮样肝炎)，2-型自身免疫肝炎(抗-LKM抗体肝炎)，自身免疫介导的低血糖，B型胰岛素抗性微黑棘皮症，甲状旁腺机能减退，与器官移植相关的急性免疫疾病，与器官移植相关的慢性免疫疾�。枪亟谘祝⒂不ü苎祝�1型牛皮癣，2型牛皮癣，自发性白细胞减少，自身免疫中性白细胞减少，肾病NOS，肾小球肾炎，肾microscopic vasulitis，莱姆病，盘形红斑狼疮，特发性男性不孕症或NOS，精液自身免疫性，多发性硬化(所有亚型)，交感神经眼炎，缔结组织疾病继发性高血压，Goodpasture′s综合征，结节性多动脉炎肺动，急性风湿性发烧，类风湿性脊椎炎，Still′s�。碛不琒jogren′s综合征，Takayasu′s病/动脉炎，自身免疫血小板减少，特发性血小板减少，自身免疫甲状腺�。鬃聪倩芸航鬃聪僦鬃陨砻庖呒鬃聪倩芸航�(Hashimoto′s病)，萎缩性自身免疫甲状腺机能亢进，原发性粘液水肿，晶体抗原性葡萄膜炎，原发性结节性脉管炎，白癜风，急性肝�。愿尾。凭愿斡不凭鸬母嗡鹕耍琧holeosatatis，特应性肝�。┪镆鸬母窝祝蔷凭灾拘愿窝祝溆π员涮从拖珺族链球菌(GBS)感染，精神病(例如，抑郁症和精神分裂症)，Th2型和Th1型介导的疾�。毙院吐蕴弁�(不同疼痛类型)，和癌症，例如肺癌，乳房癌，胃癌，膀胱癌，结肠癌，胰腺癌，卵巢癌，前列腺癌和直肠癌，和造血恶性肿瘤(白血病和淋巴瘤)。本发明的人抗体和抗体部分能用来治疗患有自身免疫疾病的患者，特别是与炎症相关的那些，包括类风湿性脊椎炎，变态反应，自身免疫糖尿病，自身免疫葡萄膜炎。
优选地，本发明的抗体或者其抗原-结合部分被用来治疗类风湿性关节炎，Crohn′s�。喾⑿杂不鹊核匾览敌吞悄虿。悄虿『团Ｆぱⅰ�
本发明的抗体，或抗体部分还可以与用于治疗自身免疫和炎症疾病的一种或几种治疗性药物一起给药。
本发明的抗体或者其抗原-结合部分可以单独使用或联合治疗这样的疾病。应该明白本发明的抗体或者其抗原-结合部分可以单独使用或与附加的药物例如治疗性药物联合，所述附加的药物由技术人员为了想要的目的来选择。例如，附加的药物可以是本领域认为用于本发明的抗体治疗的疾病或症状的治疗药物。附加药物也可以是对治疗组合物有有益贡献的药物，例如，影响组合物粘度的药物。
还应该明白本发明所包括的联合是用于它们想要的目的的那些联合。下面列出的药物是为了详细说明的目的而不是为了限制。作为本发明一部分的联合治疗是本发明的抗体和至少一种选自下面列出的附加药物。联合给药还可以包括一种以上的附加药物，例如两种或三种附加药物，如果如此联合，则形成的组合物能实现它想要的功能。
优选的联合给药是非甾类抗炎药，也称作NSAIDS，包括象布洛芬的药物。其他优选的联合给药是皮质类固醇，包括氢化泼尼松；当与本发明的抗-IL-18抗体联合治疗患者时，通过减小甾类剂量能减小甚至消除使用甾类的公知的副作用。本发明的抗体，或抗体部分可以与之联合的用于类风湿性关节炎的治疗药物的非限制性例子包括下面的细胞因子抑制抗炎药物(CSAIDs)；其他细胞因子或生长因子的抗体或拮抗剂，例如，TNF，LT，IL-1，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-12，IL-15，IL-16，IL-21，IL-23，干扰素，EMAP-II，GM-CSF，FGF，和PDGF。本发明的抗体，或其抗原结合部分能与细胞表面分子的抗体联合，细胞表面分子例如CD2，CD3，CD4，CD8，CD25，CD28，CD30，CD40，CD45，CD69，CD80(B7.1)，CD86(B7.2)，CD90，CTLA或它们的配体，包括CD154(gp39或CD40L)。
在自身免疫和接着的炎症级联中不同点，治疗药物优选的联合可能干涉；优选的例子包括TNF拮抗剂，象嵌合，人源化或人TNF抗体，D2E7，(PCT公开No.WO97/29131)，CA2(RemicadeTM)，CDP 571，和可溶性p55或p75TNF受体，其衍生物，(p75TNFRIgG(EnbrelTM)或p55TNFRIgG(Lenercept)，还有TNFα转化酶(TACE)抑制剂；类似地，IL-1抑制剂(白介素-1-转化酶抑制剂，IL-1RA等)对于相同原因是有效的。其他优选联合包括白介素。还有另一个优选联合是自身免疫应答的其他关键起作用者，其作用平行于，依赖于或与IL-18功能一致；特别优选的是IL-12拮抗剂包括IL-12抗体或可溶性IL-12受体，或IL-12结合蛋白。已经证明IL-12和IL-18重叠但是功能不同，两者的拮抗剂的联合可能最有效。还有另一个优选的联合是非耗尽抗-CD4抑制剂。还有其他优选的联合包括共同刺激途径CD80(B7.1)或CD86(B7.2)的拮抗剂，包括抗体，可溶性受体或拮抗剂配体。
本发明的抗体，或其抗原结合部分还可以与下面的药物联合，例如甲氨喋呤，6-MP，硫唑嘌呤，柳氮磺胺吡啶，美沙拉秦，奥沙拉秦，氯化喹啉/羟氯喹，pencillamine，金硫丁二钠(肌内和口服)，硫唑嘌呤，cochicine，皮质类固醇(口服，吸入和局部注射)，β-2腺受体激动剂(沙丁胺醇，特布他林，沙美特洛)，黄嘌呤(茶叶碱，氨茶碱)，色甘酸盐，萘多罗米，酮替芬，阿托品和溴乙东碱，环孢菌素，FK506，瑞帕霉素，霉酚酸酯，来氟洛米，NSAIDs，例如，布洛芬皮质类固醇，例如，氢化泼尼松，磷酸二酯酶抑制剂，腺苷激动剂，抗血栓形成剂，补体抑制剂，肾上腺素能剂，干扰通过促炎症细胞因子例如TNFα或IL-1传导信号的药物(例如IRAK，NIK，IKK，p38或MAP激酶抑制剂)，IL-1β转化酶抑制剂，TNFα转化酶(TACE)抑制剂，T-细胞信号传导抑制剂，例如激酶抑制剂，金属蛋白酶抑制剂，柳氮磺胺吡啶，硫唑嘌呤，6-巯基嘌呤，血管紧张肽转化酶抑制剂，可溶性细胞因子受体和其衍生物(例如可溶性p55或p75 TNF受体和衍生物p75TNFRIgG(EnbrelTMH p55TNFRIgG(Lenercept))，sIL-1RI，sIL-1RII，sIL-6R)，抗炎细胞因子(例如，IL-4，IL-10，IL-11，IL-13和TGFβ)，塞来昔布，叶酸，羟氯喹硫酸盐，罗非克西，etanercept，英夫单抗，萘普生，valdecoxib，柳氮磺胺吡啶，甲泼尼龙，美洛昔康，甲泼尼龙乙酸盐，金硫丁二钠，阿司匹林，去炎松，待所利德，丙氧芬，二硫硫胺/扑热息痛，叶酸盐，萘普酮，二氯酚酸钠，吡罗昔康，依托度酸，双氯芬酸钠，丙嗪，氧可酮盐酸盐，氢可酮二酒石酸盐/扑热息痛，双氯芬酸钠/米索普特，芬太尼，anakinra，人重组体，曲马朵盐酸盐，双水杨酯，舒林酸，维生素B12/脂肪酸/维生素B6，扑热息痛，阿仑特罗钠，氢化泼尼松，硫酸吗啡，利多卡因盐酸盐，消炎痛，硫酸葡萄糖胺/软骨素，盐酸阿米替林，磺胺嘧啶，盐酸氧可酮/扑热息痛，盐酸奥洛他定，米索普特，萘普生钠，奥美拉唑，环磷酰胺，利妥希玛，IL-1 TRAP，MRA，CTLA4-IG，IL-18 BP，抗-IL-12，抗-IL15，BIRB-796，SCIO-469，VX-702，AMG-548，VX-740，Roflumilast，IC-485，CDC-801，和甲基氢化泼尼松。优选的联合包括甲氨喋呤或来氟洛米，在中等或严重类风湿性关节炎情况下，环孢菌素。
本发明的抗体，或抗体部分能与之联合一起治疗肠炎的治疗药物的非限制性例子包括下面的budenoside；表皮生长因子；环孢菌素，柳氮磺胺吡啶；氨基水杨酸盐；6-巯基嘌呤；硫唑嘌呤；甲硝哒唑；脂氧合酶抑制剂；美沙拉嗪；奥沙拉嗪；巴柳氮；抗氧化剂；血栓烷抑制剂；IL-1受体拮抗剂；抗-IL-1β单克隆抗体；抗-IL-6单克隆抗体；生长因子；弹性蛋白酶抑制剂；吡啶-咪唑化合物；其他人细胞因子或生长因子的抗体或拮抗剂，例如，TNF，LT，IL-1，L-2，IL-6，L-7，IL-8，IL-12，IL-15，IL-16，EMAP-II，GM-CSF，FGF，和PDGF。本发明的抗体或者其抗原结合部分能与细胞表面分子的抗体联合，例如CD2，CD3，CD4，CD8，CD25，CD28，CD 30，CD40，CD45，CD69，CD90或者它们的配基。本发明的抗体或者其抗原结合部分还可以与药物联合，例如与甲氨喋呤，环孢菌素，FK506，瑞帕霉素，霉酚酸酯，来氟洛米，，NSAIDs，例如，布洛芬，皮质类固醇，例如氢化泼尼松，磷酸二酯酶抑制剂，腺苷激动剂，抗血栓剂，补体抑制剂，肾上腺素能剂，干扰促炎症细胞因子例如TNFα或IL-1传导信号的药物(例如IRAK，NIK，IKK，p38或MAP激酶抑制剂)，IL-1β转化酶抑制剂，TNFα转化酶抑制剂，T-细胞信号传导抑制剂，例如激酶抑制剂，金属蛋白酶抑制剂，柳氮磺胺吡啶，硫唑嘌呤，6-巯基嘌呤，血管紧张肽转化酶抑制剂，可溶性细胞因子受体和其衍生物(例如可溶性p55或p75TNF受体，sIL-1RI，sIL-1RII，sIL-6R)，抗炎细胞因子(例如，IL-4，IL-10，IL-11，IL-13和TGFβ)。
本发明的抗体，或抗原结合部分能与之联合一起治疗Crohn′s病的治疗药物的优选例子包括下面的TNF拮抗剂，例如，抗-TNF抗体，D2E7(PCT公开No.WO97/29131；HUMIRA)，CA2(REMICADE)，CDP571，TNFR-Ig构建体，(p75TNFRIgG(ENBREL)和p55TNFRIgG(LENERCEPT))抑制剂和PDE4抑制剂。本发明的抗体，或其抗原结合部分能与皮质类固醇联合，例如budenoside和地塞米松。本发明的抗体，或其抗原结合部分还可以与药物例如柳氮磺胺吡啶，5-氨基水杨酸和奥沙拉嗪，和干扰炎性细胞因子例如IL-1的合成或作用的药物，例如IL-1β转化酶抑制剂和IL-1ra联合。本发明的抗体，或其抗原结合部分还可以与T细胞信号传导抑制剂使用，例如，酪氨酸激酶抑制剂6-巯基嘌呤。本发明的抗体，或其抗原结合部分能与IL-11联合。本发明的抗体，或其抗原结合部分能与下面的药物联合美沙拉嗪，泼尼松，硫唑嘌呤，巯基嘌呤，英夫单抗，甲泼尼龙，琥珀酸钠，地芬诺酯/硫酸阿托品，盐酸洛派丁胺，甲氨喋呤，奥美拉唑，叶酸盐，环丙沙星/葡萄糖-水，重酒石酸二氢可待因酮/扑热息痛，盐酸四环素，氟轻松醋酸酯，甲硝哒唑，硫贡撒/硼酸，消胆胺/蔗糖，盐酸环丙沙星，硫酸天仙子胺，盐酸杜冷�。嗡徇浯镞蚵兀嗡嵫蹩赏�/扑热息痛，盐酸异丙嗪，磷酸钠，新诺明/甲氧苄定，塞来昔布，聚丙烯酸树脂，萘磺酸丙氧芬，氢化可的松，多种维他命，巴柳氮二钠，磷酸可卡因/扑热息痛，colesevelam盐酸盐，维生素B12，叶酸，左氟沙星，甲泼尼龙，natalizumab和干扰素-γ。
本发明的抗体，或抗体部分能与之联合治疗多发性硬化的治疗药物的非限制性例子包括下面的皮质类固醇；氢化泼尼松；甲泼尼龙；硫唑嘌呤；环磷酰胺；环孢菌素；甲氨喋呤；4-氨基吡啶；替扎尼定；干扰素-β1a(AVONEX；Biogen)；干扰素-β1b(BETASERON；Chiron/Berlex)；干扰素α-n3)(Interferon Sciences/Fujimoto)，干扰素-α(Alfa Wassermann/J&J)，干扰素-β1A-IF(Serono/Inhale Therapeutics)，Peginterferon α2b(Enzon/Scher ing-Plough)，共聚物1(Cop-1；格拉太咪尔；TevaPharmaceutical Industries，Inc.)；高压纯氧；静脉内免疫球蛋白；克拉利平；其他人细胞因子或生长因子和它们的受体的抗体或拮抗剂，例如，TNF，LT，IL-1，IL-2，IL-6，IL-7，IL-8，IL-12，IL-23，IL-15，IL-16，EMAP-II，GM-CSF，FGF，和PDGF。本发明的抗体或者其抗原结合部分能与细胞表面分子的抗体联合，例如CD2，CD3，CD4，CD8，CD19，CD20，CD25，CD28，CD30，CD40，CD45，CD69，CD80，CD86，CD90或者它们的配基。本发明的抗体或者其抗原结合部分还可以与药物联合，例如与甲氨喋呤，环孢菌素，FK506，瑞帕霉素，霉酚酸酯，来氟洛米，，NSAIDs，例如，布洛芬，皮质类固醇，例如氢化泼尼松，磷酸二酯酶抑制剂，腺苷激动剂，抗血栓剂，补体抑制剂，肾上腺素能剂，干扰促炎症细胞因子例如TNFα或IL-1传导信号的药物(例如IRAK，NIK，IKK，p38或MAP激酶抑制剂)，IL-1β转化酶抑制剂，TACE抑制剂，T-细胞信号传导抑制剂，例如激酶抑制剂，金属蛋白酶抑制剂，柳氮磺胺吡啶，硫唑嘌呤，6-巯基嘌呤，血管紧张肽转化酶抑制剂，可溶性细胞因子受体和其衍生物(例如可溶性p55或p75TNF受体，sIL-1RI，sIL-1RII，sIL-6R)，抗炎细胞因子(例如，IL-4，IL-10，IL-11，IL-13和TGFβ)。
本发明的抗体或者其抗原结合部分能与之联合治疗多发性硬化的治疗药物优选例子包括干扰素-β，例如，IFNβ1a和IFNβ1b；格拉太咪尔，皮质类固醇，胱天蛋白酶抑制剂，例如胱天蛋白酶-1的抑制剂，IL-1抑制剂，TNF抑制剂，和CD40配体和CD80的抗体。
本发明的抗体或者其抗原结合部分还可以与药物联合，例如alemtuzumab，四氢大麻酚，Unimed，daclizumab，米托蒽醌，xaliproden hydrochloride，4-氨基吡啶，乙酸格拉太咪尔，natalizumab，sinnabidol，a-immunokine NNSO3，ABR-215062，AnergiX.MS，趋化因子受体拮抗剂，BBR-2778，calagualine，CPI-1189，LEM(脂质体胶囊米托蒽醌)，THC.CBD(类大麻素激动剂)MBP-8298，甲基氢化泼尼松(PDE4抑制剂)，MNA-715，抗-IL-6受体抗体，neurovax，派非尼酮，allotrap 1258(RDP-1258)，sTNF-R1，talampanel，teriflunomide，TGF-β2，tiplimotide，VLA-4拮抗剂(例如，TR-14035，VLA4 Ultrahaler，Antegran-ELAN/Biogen)，γ干扰素拮抗剂，IL-4激动剂。
本发明的抗体或抗体部分能与之联合治疗咽痛的治疗药物的非限制性例子包括下面的阿司匹林，硝酸甘油，单硝酸异山梨酯，琥珀酸美托洛尔，阿替洛尔，酒石酸美托洛尔，阿罗地平磺酸盐，硫氮翁酮盐酸盐，硝酸异山梨酯，氯吡格雷硫酸氢盐，心痛定，阿托伐他汀钙，氯化钾，呋塞米，辛伐他汀，盐酸维拉帕米，地高辛，盐酸心得安，卡维地洛，萘诺普利，螺内酯，二氢氯噻，依那普利马来酸盐，纳多洛尔，雷米普利，依诺肝素钠，肝素钠，缬沙坦，盐酸甲磺胺心定，降脂异丙酯，ezetimibe，布美他尼，氯沙坦钾，萘诺普利/二氢氯噻，非洛地平，卡托普利，比索洛尔富马酸盐。
本发明的抗体或抗体部分能与之联合治疗关节强硬脊椎炎的治疗药物的非限制性例子包括下面的布洛芬，二氯酚酸钠和米索普特，萘普生，美洛昔康，消炎痛，二氯酚酸钠，塞来昔布，罗非克西，柳氮磺胺吡啶，甲氨喋呤，硫唑嘌呤，米诺环素，泼尼松，etanercept，英夫单抗。
本发明的抗体或抗体部分能与之联合治疗哮喘的治疗药物的非限制性例子包括下面的沙丁胺醇，沙美特罗/氟地松，孟鲁司特钠，氟地松丙酸盐，步地奈德，泼尼松，沙美特罗xinafoate，levalbuterol盐酸盐，硫酸沙丁胺醇/异丙托品，泼尼松龙磷酸钠，曲安柰德，倍氯米松二丙酸盐，溴化异丙托品，阿奇霉素，乙酸吡布特罗，氢化泼尼松，无水茶叶碱，甲泼尼龙钠琥珀酸盐，克拉霉素，扎鲁司特，福莫特罗富马酸盐，流感病毒疫苗，甲泼尼龙，阿莫西林三水合物，氟尼缩松，变应性变态反应注射液，色氨酸钠，盐酸甲美芳铵，氟尼缩松/薄荷醇，阿莫西林/克拉维酸钾，左氟沙星，吸入器辅助装置，愈创甘油醚，地塞米松钠磷酸盐，莫西沙星盐酸盐，盐酸多西环素，愈创甘油醚/d-消旋啡烷，p-麻黄素/cod/扑尔敏，加替沙星，西替利嗪盐酸盐，糠酸毛他松，沙美特罗xinafoate，退嗽，头孢氨苄，pe/氢可酮/扑尔敏，西替利嗪盐酸盐/伪麻黄碱，苯福林/cod/异丙嗪，可卡因/异丙嗪，头孢罗齐，地塞米松，愈创甘油醚/假麻黄碱，扑尔敏/氢可酮，奈多罗米钠，硫酸特布他林，肾上腺素，甲泼尼龙，硫酸奥西那林。
本发明的抗体或抗体部分能与之联合治疗COPD的治疗药物的非限制性例子包括下面的硫酸沙丁胺醇/异丙托品，溴化异丙托品，沙美特罗/氟地松，沙丁胺醇，沙美特罗xinafoate，倍氯米松二丙酸盐，泼尼松，无水茶叶碱，甲泼尼龙钠琥珀酸盐，孟鲁司特钠，布地奈德，福莫特罗富马酸盐，曲安柰德，左氟沙星，愈创甘油醚，阿奇霉素，倍氯美松二丙酸盐，levalbuterol盐酸盐，氟尼缩松，头孢曲松钠，阿莫西林三水合物，加替沙星，扎鲁司特，阿莫西林/克拉维酸钾，氟尼缩松/薄荷醇，扑尔敏/氢可酮，硫酸奥西那林，甲泼尼龙，糠酸毛他松，p-黄麻碱/cod/扑尔敏，乙酸吡布特罗，p-黄麻碱/氯雷他定，硫酸特布他林，tiotropium bromide，(R，R)-福莫特罗，TgAAT，Cilomilast，Roflumilast。
本发明的抗体或抗体部分能与之联合治疗HCV的治疗药物的非限制性例子包括下面的干扰素-α-2a，干扰素-α-2b，干扰素-α-conl，干扰素-α-n1，PEG化干扰素-α-2a，PEG化干扰素-α-2b，利巴韦林，PEG化干扰素-α-2b+利巴韦林，熊去氧胆酸，甘草酸，胸腺法新，Maxamine，VX-497和用下面的靶物干扰用来治疗HCV的任何化合物HCV聚合酶，HCV蛋白酶，HCV helicase，HCV IRES(内部核糖体进入位点)。
本发明的抗体或抗体部分能与之联合治疗特发性肺纤维化的治疗药物的非限制性例子包括下面的泼尼松，硫唑嘌呤，沙丁胺醇，秋水仙碱，硫酸沙丁胺醇，地高辛，γ干扰素，甲泼尼龙钠琥珀酸盐，劳拉西泮，呋塞米，赖诺普利，硝酸甘油，螺内酯，环磷酰胺，异丙托品，放线菌素d，阿替普酶，丙酸氟地松，左氟沙星，硫酸奥西那林，硫酸吗啡，盐酸羟可待酮，氯化钾，曲安奈德，无水他克莫司，钙，干扰素-α，甲氨喋呤，霉酚酸酯，干扰素-γ-1β。
本发明的抗体或抗体部分能与之联合治疗心肌梗塞的治疗药物的非限制性例子包括下面的阿司匹林，硝酸甘油，酒石酸美托洛尔，依诺肝素钠，肝素钠，氯吡格雷二硫酸盐，卡维地洛，阿替洛尔，硫酸吗啡，琥珀酸美托洛尔，法华林钠，赖诺普利，单硝酸异山梨酯，地高辛，呋塞米，辛伐他�。酌灼绽婺崞彰福砝此嵋滥瞧绽瑃orsemide，瑞替普酶，氯沙坦钾，盐酸喹那普利，碳酸镁，布美他尼，阿替普酶，依那普利拉，胺碘酮盐酸盐，盐酸替罗非班m-水合物，盐酸地尔硫卓，卡托普利，依贝沙坦，缬沙坦，盐酸普萘洛尔，福辛普利钠，盐酸利多卡因，表非替得，头孢唑啉钠，硫酸阿托品，亮氨酸，螺内酯，干扰素，盐酸索他洛尔，氯化钾，琥珀辛酯钠，盐酸多巴酚丁胺，阿普唑仑，普伐他汀钠，阿托伐他汀钙，盐酸咪达唑仑，盐酸度冷�。跛嵋焐嚼骢ィ錾舷偎兀嗡岫喟桶罚确ヂǎ瑀osuvastatin，ezetimibe/辛伐他汀，avasimibe，cariporide。
本发明的抗体或抗体部分能与之联合治疗牛皮癣的治疗药物的非限制性例子包括下面的钙泊三烯，丙酸氯倍他索，曲安奈德，halobetasol丙酸盐，他佐罗�。装编┻剩崴纱姿狨ィ龀さ谋端姿桑崴桑⑽珹，焦油香波，缬草酸倍他米松，糠酸毛他松，酮康唑，普拉莫星/氟轻松，缬草酸氢化可的松，氟氢缩松，脲，倍他米松，丙酸氯倍他索/伊莫，氟地松丙酸盐，阿奇霉素，氢化可的松，加湿配方，叶酸，地奈德，pimecrolimus，煤焦油，二乙酸二氟拉松，etanercept folate，乳酸，甲氧沙林，hc/bismuthsubgal/znox/resor，乙酸甲泼尼龙，强的松，防晒剂，哈西奈德，水杨酸，蒽林，新戊酸氯可托龙，煤提取物，煤焦油/水杨酸，煤焦油/水杨酸/硫，去羟米松，安定，润滑药，氟轻松醋酸酯/润滑药，矿物油/蓖麻油/nalact，矿物油/花生油，石油/十四酸异丙酯，补骨脂素，水杨酸，皂/三溴沙仑，硫贡撒/硼酸，塞来昔布，英夫单抗，环孢菌素，alefacept，efalizumab，tacrolimus，pimecrolimus，PUVA，WB，柳氮磺胺吡啶。
本发明的抗体或抗体部分能与之联合治疗牛皮癣关节炎的治疗药物的非限制性例子包括下面的甲氨喋呤，etanercept，罗非克西，塞来昔布，叶酸，柳氮磺胺吡啶，萘普生，来氟洛米，乙酸甲泼尼龙，消炎痛，硫酸羟氯喹，强的松，舒林酸，渐增的二丙酸倍他米松，英夫单抗，甲氨喋呤，叶酸盐，曲安奈德，二氯酚酸钠，二甲基亚砜，吡罗昔康，双氯芬酸钠，酮洛芬，美洛昔康，甲泼尼龙，萘普酮，托美丁钠，钙泊三烯，环孢菌素，双氯芬酸钠/米索普特，氟轻松醋酸酯，硫酸葡萄糖胺，硫羟苹果酸金钠，氢可酮酒石酸氢酯/扑热息痛，布洛芬，利塞膦酸钠，磺胺嘧啶，硫鸟嘌呤，valdecoxib，alefacept，efalizumab。
本发明的抗体或抗体部分能与之联合治疗再狭窄的治疗药物的非限制性例子包括下面的西罗莫司，紫杉醇，everolimus，tacrolimus，ABT-578，扑热息痛。
本发明的抗体或抗体部分能与之联合治疗坐骨神经痛的治疗药物的非限制性例子包括下面的氢可酮酒石酸氢酯/扑热息痛，罗非克西，盐酸环苯扎林，甲泼尼龙，萘普生，布洛芬，盐酸氧可酮/扑热息痛，塞来昔布，valdecoxib，乙酸甲泼尼龙，强的松，磷酸可卡因/扑热息痛，盐酸曲马朵/扑热息痛，美他沙酮，美洛昔康，美索巴莫，盐酸利多卡因，双氯芬酸钠，加巴喷�。厝姿桑⑵斩啵逅幔倍∪迹淄矗巳认⑼矗捕ǎ疗胀嗡嵫蹩赏嬖岫ㄑ嗡嵫危确宜崮�/米索普特，丙氧芬二硫硫胺/扑热息痛，阿司匹林/oxycod/羟可待酮ter，布洛芬/少量氢可酮，盐酸曲马朵，乙哚乙酸，盐酸丙氧芬，盐酸阿米替林，肌安宁/磷酸可卡因/阿司匹林，硫酸吗啡，多种维他命，萘普生钠，邻甲苯海拉明柠檬酸盐，替马西泮。
本发明的抗体或抗原结合部分能与之联合治疗SLE(狼疮)的治疗药物的优选例子包括下面的NSAIDS，例如，双氯芬酸，萘普生，布洛芬，吡罗昔康，消炎痛；COX2抑制剂，例如，塞来昔布，罗非克西，valdecoxib；抗疟药，例如，羟氯喹；类固醇，例如，强的松，氢化泼尼松，budenoside，地塞米松；细胞毒素，例如，硫唑嘌呤，环磷酰胺，霉酚酸酯，甲氨喋呤；PDE4的抑制剂或嘌呤合成抑制剂，例如麦考酚酸吗啉乙酯。本发明的抗体或抗原结合部分还可以与下面的药物联合，例如柳氮磺胺吡啶，5-氨基水杨酸，奥沙拉嗪，硫唑嘌呤，和干扰促炎性细胞因子例如IL-1的合成，制备或作用的药物，例如胱天蛋白酶抑制剂，象IL-1β转化酶抑制剂和IL-1ra联合。本发明的抗体，或其抗原结合部分还可以与T细胞信号传导抑制剂使用，例如，酪氨酸激酶抑制剂；或瞄向T细胞激活分子的分子，例如，CTLA-4-IgG或抗-B7家族抗体，抗-PD-1家族抗体。本发明的抗体或抗原结合部分还可以与IL-11或抗-细胞因子抗体联合，例如，fonotolizumab(抗-IFNg抗体)，或抗-受体受体抗体，例如，抗-IL-6受体抗体和抗B-细胞表面分子抗体。本发明的抗体或抗原结合部分还可以与下面的药物联合使用LJP 394(abetimus)，减少或灭活B-细胞的药物，例如，利妥希玛(抗-CD20抗体)，lymphostat-B(抗-BlyS抗体)，TNF拮抗剂，例如，抗-TNF抗体，D2E7(PCT公开No.WO97/29131；HUMIRA)，CA2(REMICADE)，CDP 571，TNFR-Ig构建体，(p75TNFRIgG(ENBREL)和p55TNFRIgG(LENERCEPT))。
本发明的药物组合物可以含有″治疗有效量″或″预防有效量″本发明的抗体或抗体部分。″治疗有效量的″指实现期望的治疗结果的必需的剂量和给药时间的有效量。本发明的抗体或抗体部分的治疗有效量可以由本领域技术人员确定并且根据个体因素例如疾病状态，年龄，性别和体重，以及抗体或抗体部分激发个体期望的响应的能力而不同。治疗有效量也是其中治疗有益作用比抗体或抗体部分的毒性或有害作用更重要的量。″预防有效量″指实现期望的预防结果的必需的剂量和给药时间的有效量。典型地，在疾病之前或早期使用预防剂量，预防有效量比治疗有效量小。
调节给药方案提供最佳期望响应(例如，治疗或预防响应)。例如，可以施用一次大丸剂，也可以在一定时间施用几次分开的剂量，或者根据治疗状况紧急情形显示的，可以相应减小或增加剂量。以易于给药和剂量均匀性的单位剂型配制肠胃外用组合物是特别有利的。这里使用的单位剂型指适合作为要治疗的哺乳动物受治疗者的单一剂量的物理分散的单位；各个单位含有经计算产生期望的治疗效果的预定量的活性化合物和必需的药物载体。根据(a)活性化合物的独特特征和要实现的特定的治疗或预防效果，和(b)化合物领域固有的限制如活性化合物对于个体治疗灵敏性，指示本发明的单位剂型的说明，并且该说明直接根据(a)和(b)。
作为例子，本发明的抗体或抗体部分治疗或预防有效量的非限制范围是0.1-20毫克/千克，更优选1-10毫克/千克。注意，剂量值可以随着要减轻的症状的类型和严重程度而变化。要进一步明白，对于任何特定受治疗者，应该根据个体需要和实施或监督组合物的给与的人的专业判断，随时间调节具体给药方案，这里给出的剂量范围只是例举而不是为了限制要求的组合物的范围或实施。
II.IL-18易感基因IL-18在巨噬细胞，树突状细胞，星形细胞，小神经胶质细胞，上皮细胞，角质形成细胞，肠上皮细胞，软骨细胞，滑液成纤维细胞和成骨细胞，以及在肾上腺皮质和脑垂体腺中表达。在一些细胞中，例如人单核细胞和树状细胞中，表达是组成型的，而在其他细胞中，一定是重新诱导。
除了γ干扰素表达之外，对于IL-18单独诱导的或者与其他细胞因子协调的其他基因知之甚少。
本发明的一个实施方案提供了调控感兴趣的基因的基因表达的方法，包括下面的步骤提供IL-18或IL-18调节剂；使IL-18或调节剂接触细胞，细胞中感兴趣的基因选自下面的表中给出的基因。
表3 IL-18易感基因
实施例3公开了IL-18调控的基因的鉴定方法。这些研究表明IL-18是真实促炎性细胞因子，并且能直接调控编码其他炎性原介质的几种基因的表达。使用人血样的研究表明对于IL-18的很多响应在人群中广泛发生，并且证实了它们作为生物化学标记的用途，以及接着的抗-IL18功能。
IL-18的调节剂可以是激动剂和拮抗剂。优选地，调节剂是结合蛋白或中和结合蛋白。
举例的IL-18抑制剂包括但不限于，结合IL-18的抗体及其片段；结合IL-18R的抗体；结合IL-18RAcP的抗体；IL-18bp；IL-18R片段(例如，IL-18受体的溶解的胞外结构域)；结合IL-18并且减小或防止它与IL-18R相互作用的肽；结合IL-18R并且减小或防止它与IL-18或IL-18RAcP相互作用的肽；结合IL-18RAcP并且减小或防止它与IL-18R相互作用的肽；减小或防止IL-18产生或者IL-18，IL-18R，和IL-18RAcP任何一个之间的相互作用的小分子。
下面文献描述了一些IL-18抑制剂，例如，1994年7月14日公开的美国专利No.5,912,324；1999年12月8日公开的EP 0962531；1994年11月15日公开的EP 712931；1994年7月14日公开的美国专利No.5,914,253；1997年7月10日公开的WO 97/24441；2000年5月9日公开的美国专利No.6,060,283；1996年12月26日公开的EP850 952；1998年9月16日公开的EP 864 585；1998年9月24日公开的WO 98/41232；2000年4月25日公开的美国专利No.6,054,487；1997年8月14日公开的WO 99/09063；1997年11月3日公开的WO 99/22760；1998年1月23日公开的WO 99/37772；1998年3月20日公开的WO 99/37773；2000年1月26日公开的EP0 974 600；2000年3月9日公开的WO 00112555；1997年10月31日公开的日本专利申请JP 111,399194；1998年2月8日公开的以色列专利申请IL 121554AO；这些文献为了任何目的在此引作参考。
对于本领域技术人员显而易见的是这里描述的本发明的其他合适的修饰和改变是显而易见的，并且不脱离本发明的范围或这里公开的实施方案使用合适的等同物可以进行。在详细描述本发明的基础上，参照下面的实施例，更清楚地理解，实施例只是为了详细说明的目的而不是要限制本发明的范围。
实施例实施例1重组IL-18的制备和表征实施例1.1IL-18生物活性测定试验实施例1和实施例2中，除非另有说明，利用下面的试验测定IL-18的生物活性。
实施例1.1.AKG-1生物测定KG-1(ATCC#CCL-246)是组成型表达低水平功能IL-18受体的人骨髓单核细胞系。使用TNF治疗增量调节这些细胞上功能IL-18受体的IL-18Rα和β亚基。通过ELISA，将TNF-处理的KG-1细胞与重组人IL-18(rhu-IL-18)温育进行KG-1生物测定，测定IL-18-诱导的人IFNγ产生的水平(Konishi，K.，等(1997)J.Immunol.Methods209187-191)。利用KG-1生物测定来测定IL-18拮抗剂的中和能力。例如，抗-IL-18抗体与不同浓度的rhu-IL-18温育，然后在37℃下在96-孔板中与TNF-处理的KG-1细胞温育16-18小时。收集上清液并且通过ELISA测定人IFNγ水平。该项试验测得IL-18拮抗剂低至4×10-11至6×10-11M的IC50值实施例1.1.B人全血分析简要地说，人全血分析(WBA)测定生理学背景下IL-18拮抗剂抗天然IL-18的中和效力。在各项试验中，读出的是内源IL-18-依赖性人IFNγ产生的抑制。在37℃下在存在或不存在IL-18拮抗剂下，用LPS(1μg/mL)加IL-12(50pg/mL)刺激全血。LPS加IL-12刺激之后18-24小时通过ELISA测定人IFNγ浓度。
实施例1.1.C受体结合试验简要地说，在受体结合试验(RBA)中，125I标记的rhu-IL-18被用来测定IL-18与IL-18受体的结合。125I-rhu-IL-18特异性结合TNF处理的KG-1细胞上IL-18Rαβ(～7,000位点/细胞)。.125I-rhu-IL-18具有和没有标记的IL-18一样的特异活性并且能被没有标记的IL-18竞争掉。
定义两种抑制方式，A和B。在中和模式A中，IL-18与高亲和性IL-18受体(IL-18Rαβ)的结合没有效果，但是IL-18-介导的信号转导(即IFNγ产生)被阻断。在中和模式B中，IL-18与IL-18Rαβ的结合被阻断，从而接着没有发生受体-介导的信号转导。
实施例1.2重组IL-18的产生实施例1.2.A质粒构建，人IL-18原的表达和纯化通过在SF-9昆虫细胞中表达IL-18母体形式产生重组人IL-18。应用本领域公知的标准分子生物学方法，一公开的序列(Ushio，S.，等(1996)J.Immunol.1564274-4279)为基础利用特异PCR引物制备全长人IL-18原cDNA，并且接着克隆到杆状病毒(BV)转移载体pVL1393(BD Biosciences，San Jose，CA；Cat#51-21201P)。用来制备全长人IL-18原cDNA的5′PCR引物包含编码6-组氨酸区的序列，使得IL-18原的N-末端包含6-HIS-标签。
用带有包含IL-18cDNA的pVL1393载体的杆状病毒转染SF9 I昆虫细胞。将转染的SF9细胞溶解并且将溶胞产物流经镍柱以纯化重组HIS-标记的IL-18原(rhu proIL-18)(BD Biosciences，San Jose，CA；Cat#554802)。通过用人胱天蛋白酶-1消化进一步处理重组HIS-标记的IL-18原，产生生物活性IL-18(成熟IL-18)(Ghayur T.，(1997)Nature 386619-623)。
实施例1.2.BIL-18的NEM处理从日本Hayashibara Biochemical Laboratories获得的重组人IL-18表现特异活性和IL-18结合亲和性的分批差异。成熟IL-18中四个半胱氨酸不同对之间，IL-18包含二硫键。这些引起分批的结构和功能异质性，和差异。利用IL-1b配位的人IL-18的同源性模型表明，成熟人IL-18的位置38和68的半胱氨酸残基是暴露的，因此是有活性的。
用N-乙基马来酰亚胺(NEM)处理实施例1.2，A获得的重组人IL-18，保护半胱氨酸不被氧化。NEM-IL-18是单体的，不形成聚集体，它是稳定的并且随着时间保持高特异活性。NEM-IL-18保留中和表位，因为抗-huIL-18中和抗体结合并中和NEM-IL-18。尽管NEM处理IL-18，根据抗-IL-18抗体中和人WBA中NEM-IL-18和天然人IL-18的生物活性的能力所测定的，NEM-IL-18上中和表位保留了。NEM-IL-18用于测定全长人抗-人-IL-18mAbs的最优化和选择和初步特征。
实施例1.2.CIL-18的4C/A突变体的产生和表征通过将成熟IL-18中四个半胱氨酸突变成丙氨酸制备IL-18的4C/A突变体(″4C/A-huL-18″)。根据下面表4中总结的，IL-18的4C/A突变体与NEM-huIL-18比较，表明两种蛋白质的生物学和生物化学性质完全不同。通过动态光散射(DLS)和大小排阻层析(SEC)分析，IL-18和NEM-huIL-18的4C/A突变体是单体，圆二色性分析表明构象和物理稳定性相似。IL-18和NEM-huIL-18的4C/A突变体的生物活性在KG-1试验中是相同的，IL-18结合的IL-18BP和抗-IL-18抗体的两种形式具有相似的亲和性。4C/A-huL-18没有氧化不稳定性，并且容易在大肠杆菌中高水平表达。
表4 NEM-IL-18和4C/A-huIL-18的比较表明它们的构象和寡聚物纯度，物理稳定性，和与抗体或细胞结合的受体结合的量度是相等的。
实施例1.2.D生物素化rhuIL-18(生物素化-IL-18)的产生和表征利用本领域公知的标准技术，子阿赖氨酸残基上对来自实施例1.2.B的NEM-IL-18进行生物素化(Sulfo-NHS-LC-Biotin，Pierce，Rockford，IL；Cat#21335)，获得的生物素化rhu-IL-18(biot-IL-18)是每huIL-18含有带有1，2，3，或4个生物素的物质的不均匀混合物。此外，在biot-IL-18中每个huIL-18带有2或3个生物素的物质是主要物质。根据ELISA分析，Biot-IL-18是生物活性的，结合的抗-IL-18抗体，并且被试验的所有中和抗-huIL-18抗体中和。Biot-IL-18结合的KG-1细胞在细胞表面上表达高亲和性的IL-18Rαβ，利用抗-生物素抗体(Sigma-Aldrich，St Louis，MO；cat#B 3640)通过FACS分析检测KG-1细胞表面上biot-IL-18。因此生物素化作用不干扰受体结合，不屏蔽rhuIL-18的中和表位。
实施例1.2.E125I标记的rhuIL-18的产生和表征应用Amersham描述的条件(Piscataway，NJ；Cat#IM5861)，用125I标记实施例1.2.B获得的NEM-IL-18上赖氨酸残基。保留了其特异活性的125I标记的IL-18与没有修饰的IL-18竞争，并且特异性结合KG-1细胞上的IL-18R。通过中和抗-huIL-18单克隆抗体阻断125I标记的IL-18与IL-18受体的结合。因此，碘化作用不影响IL-18的受体结合，因此不屏蔽中和IL-18上的表位。在受体结合试验中，使用125I标记的IL-18测定抗-IL-18抗体的中和模式和能力。
实施例2抗IL-18抗体的产生和分离实施例2.1鉴定抗-IL-18抗体的试验在实施例3中，除非另有说明，利用下面的试验鉴定和表征抗-IL-18抗体。
实施例2.1.AELISA进行ELISA，筛选结合人IL-18的抗体。在这项ELISA中，生物素化NEM-huIL-18(参见实施例1.2.B)被山羊-生物素化IgG捕获或者被捕获到链霉抗生物素包被的平板上。使用杂交瘤或B细胞上清液，并且利用HRP-偶联的抗-人IgGs，根据本领域公知的标准ELISA方法，检测IL-18-结合的抗体。
实施例2.1.B应用BIACORE技术的亲和性测定BIACORE试验(Biacore，Inc，Piscataway，NJ)测定抗体的亲和性，测定生成，离解速率常数的动力学常数。利用共价连接的第二抗体(例如山羊抗-人IgG或抗-小鼠IgG)，将抗体捕获到生物传感器芯片上，然后使用不同浓度的重组IL-18。结合记录为时间的函数，并且计算动力学速率常数。在该项试验中，测得生成速率象106M-1s-1这样快，离解速率象10-6M-1s-1这样慢。
实施例2.1.C表位图谱应用BIACORE技术测绘IL-18拮抗剂例如抗-IL-18抗体识别的表位的图谱。简要地说，一种IL-18拮抗剂被捕获到Biacore芯片上，rhuIL-18与固定化试剂结合。然后分析另一种抗-IL-18拮抗剂与这种复合体的结合。两种试剂同时结合证明，这两者识别不同的表位。
实施例2.2使用XENOMOUSE的抗-IL-18HuMAbs的产生应用XENOMOUSE转基因小鼠技术(Abgenix，Inc.，Fremont，CA)获得全人抗-人IL-18单克隆抗体(HuMAbs)。这项技术包括转基因小鼠携带带有VH，DH，和JH，Cμ，Cδ的人可变重链基因座，和单链人IgG恒定重链基因座和轻链基因座。用感兴趣的抗原免疫之后，这些小鼠产生抗该抗原的全人抗体。
实施例2.2.A用IL-18抗原对XENOMOUSE的免疫对于所有注射，通过足垫途径对XENOMOUSE动物接种。每次注射的总体积是每只小鼠50微升，每只足垫25微升。对于每只小鼠，初次免疫注射，在与TiterMax Gold以1∶1v/v混合的无热源DPBS中含有40微克人IL-18(NEM-rhuIL-18)。接着对每只小鼠施用与25微克Adju-Phos(磷酸铝凝胶)混合的无热源DPBS中40微克人IL-18进行加强免疫6次，然后对每只小鼠使用没有辅助剂的无热源DPBS中40微克人IL-18进行最后一次加强免疫。在此方案中，在第0，4，8，11，17，21，25和35天对动物免疫接种。在第39天进行融合。上述免疫方案后，将小鼠处以安乐死，然后回收腹股沟和腰部淋巴结。
实施例2.2.B杂交瘤的制备通过对腹股沟和腰部淋巴结机械破碎来释放根据实施例2.2.A获得的淋巴细胞，使用组织研磨机，通过CD90阴性选择排除T细胞。以1∶1的比例混合洗涤过的富集B细胞和从ATCC购得的非分泌骨髓瘤P3X63Ag8.653细胞，cat#CRL 1580(Kearney等，J.Immunol.123，1979，1548-1550)，进行杂交瘤融合。通过以800g离心使细胞混合物温和沉淀。完全去除上清液之后，细胞用2-4毫升链霉蛋白酶溶液(CalBiochem，San Diego，CA；cat.#53702；0.5毫克/毫升PBS溶液)处理不超过2分钟。然后加入3-5毫升FBS以中止酶活性，并且使用电细胞融合溶液，ECFS(0.3M蔗糖，Sigma-Aldrich，St Louis，MO；Cat#S7903，0.1mM乙酸镁，Sigma，Cat#M2545，0.1mM乙酸钙，Sigma-Aldrich，St Louis，MO；Cat#C4705)将悬浮液调节至40毫升总体积。离心之后去除上清液，并且将细胞再悬浮于40毫升ECFS。反复这种洗涤步骤，再次将细胞重新悬浮于ECFS至2×106细胞/毫升浓度。
使用ECM2001型，Genetronic，Inc.，San Diego，CA融合发生器进行电-细胞融合。使用的融合室大小是2.0毫升，使用下面的仪器设置校准条件电压50v，时间50秒；膜破碎条件电压3000v，时间30秒；融合后保留时间3秒。
融合之后，细胞重新悬浮于杂交瘤融合培养基中DMEM(JRHBiosciences)，15％FBS(Hyclone)，含有0.5XHA(Sigma-Aldrich，St Louis，MO；cat#A9666)，并且补加有L-谷氨酰，pen/strep，OPI(草酰乙酸盐，丙酮酸盐，牛胰岛素)(都从Sigma获得)和IL-6(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)，在37℃和10％CO2的空气中培养。以每孔4×104细胞在平底96-孔组织培养板上将细胞平板培养。培养物在杂交瘤融合培养基中保持2周，然后转移到杂交瘤培养基DMEM(JRH Biosciences，Lenexa，KS)，15％FBS(Hyclone，Logan，Utah)，并且补充有L-谷氨酰，pen/strep，OPI(草酰乙酸盐，丙酮酸盐，牛胰岛素)(都从Sigma获得)和IL-6(BoehringerMannheim，Indianapolis，IN)。以在0.5XHA杂交瘤融合培养基中存活来筛选杂交瘤，并且通过ELISA对含有杂交瘤的那些孔筛选抗原反应性。ELISA格式详细描述了在抗原包被的平板(人IL-18包被平板)上温育上清液，并且使用辣根过氧化物酶(HRP)标记的小鼠抗-人IgG检测人抗-人IL-18结合抗体，然后通过平行进行两组ELISA来证实所有的阳性样品，详细描述了在抗原包被的平板(人IL-18包被平板)上温育上清液，并且使用辣根过氧化物酶(HRP)标记的小鼠抗-人γ和κ链检测人抗-人IL-18结合抗体。
利用限制稀释平板培养在选择的抗原-阳性孔上进行克隆。对平板目测检查单一菌落生长的存在，然后通过上述抗原-特异性ELISA筛选单一菌落孔的上清液。通过多样ELISA，使用Luminex仪器，分析高反应性克�。な等甩煤挺柿吹拇慷取�
实施例2.2.CXENOMAX技术或者，对实施例2.2.B中获得的淋巴细胞实施选择淋巴细胞抗体-产生方法(SLAM)，该方法确定了XENOMAX抗体选择技术(Abgenix，Inc.，Fremont，CA)。在96孔板中平板培养单一B细胞，通过空斑形成细胞试验鉴定在产生抗期望抗原(人IL-18)的人单克隆抗体的B细胞(Babcook，J.S.，Leslie，K.B.，Olsen，O.A.，Salmon，R.A.，和Schrader，J.W.，Isolation of functional antibodygenes from single lymphocytes of defined antigen-specificity.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，937843-7848，1996)，对于VH和Vk前导序列使用5′引物，和对于人Cγ和Cκ特异的3′引物，通过对分离的B细胞进行单细胞RT-PCR，克隆IgG基因。根据实施例2.2.E和2.2.G所述在哺乳动物细胞中表达获得的重组IgG基因。
实施例2.2.D抗-IL-18抗体的鉴定应用生物素化IL-18ELISA(参见实施例2.1.A)，鉴定根据实施例2.2.B和2.2.C制备的杂交瘤和产生结合IL-18的抗体的B-细胞。然后在根据实施例1.1.A进行的KG-1生物试验中，对含有结合IL-18的抗体的杂交瘤和B细胞上清液测定IL-18中和能力。将中和抗-IL-18抗体(来自杂交瘤和SLAM aproaches)亚克隆导哺乳动物载体中，在COS细胞中表达，纯化，并且在KG-1生物试验中再次试验(参见表5)。
表5KG-1生物试验中抗-IL-18HuMAbs的中和能力
在表1中描述了表5中抗体的可变区。
实施例2.2.E中和抗-IL-18HuMAbs亚克隆到哺乳动物表达载体中根据生产商说明书，在CMV启动子的调控下，在pCDNA(Invitrogen，Carlsbad，Ca)载体中克隆抗体的重链和轻链基因。通过电穿孔，使用本领域公知的标准条件，用相应于各克隆的重链和轻链，使用包含人基因组γ-2和κ序列的这些质粒共同转染COS细胞。
回收细胞，在补充有谷酰胺的无血清DMEM中培养细胞，并分泌抗体72小时。然后收集培养物上清液，离心澄清并且过滤，并且上Protein-A树脂。用PBS洗涤柱子，用低pH缓冲剂洗脱抗体，并且用1MTris溶液快速中和。在Amicon-30旋转过滤器上用PBS对抗体制备物进行缓冲剂交换。通过在OD280下的光谱测定法和SDS-PAGE分析抗体的浓度和纯度，然后对它们测定IL-18中和能力。
为了实现人抗体在COS细胞中更高水平表达，在延长因子启动子的调控下，一些抗体的重链和轻链亚克隆导载体pEF-BOS(Mizushima，S.和Nagata，S.(1990)Nucleic acids Research Vol 18，No.17)。
简言之，以这样的方式设计用于重链可变区的PCR引物，使得它们被插入包含IgG信号肽和人IgG1恒定区的序列[野生型(SEQ ID No.2)或失活突变体(SEQ ID No.3)]的盒pEF-BOS质粒中。前向VHPCR引物包含限制位点NruI，象信号肽的核苷酸序列一样。反向VHPCR引物包含SalI限制位点，它也经基因工程导入γ-1Fc序列的5′端。用NruI/SalI消化VHPCR片段，并且克隆到pEF-BOS人IgG1野生型或pEF-BOS人IgG1突变体构建体中。通过HindE限制消化，整个轻链以来自pCDNA载体的κ形式存在，转移到pEF-BOS载体中，用T4聚合酶填充突出端，接着用NotI消化。然后将这些钝的/NotI轻链片段克隆到Srfl/NotI消化的pEF-BOS载体中。
从最初杂交瘤系克隆抗体的VH和VL区。从产生抗体的细胞制备RNA，使用如上所述设计的引物进行RT-PCR，即对于VH用Nrul/SaII引物，对VL用NruI/BsiWI引物。将全长IgG1和κ链组装成盒载体。
进一步修饰选择的抗体。天然存在的抗体有谷酰胺(Q)或谷氨酸(E)，这好似重链和/或轻链NH2-末端。Q作为NH2-末端的抗体的制备得到NH2-末端异源性，由于谷酰胺环化为谷氨酸。因此，一些抗体的NH2-末端处谷酰胺残基突变为谷氨酸。还有两个残基，Fc部分的绞合区中亮氨酸234和亮氨酸235突变，妨碍了抗体的效应子功能。简要地说，利用标准分子生物学技术，用丙氨酸置换亮氨酸234和亮氨酸235(Lund，J.等，J.Immunology(1991)1472657-2662；Winter，等美国专利No.5,648,260；5624821；5,624,821)。这些Fc-突变抗体有专门术语(mg1)。下面实施例2.2.J 6进一步表征了这些突变体。
实施例2.2.F选择的中和抗-IL-18抗体的表征在哺乳动物细胞中产生具有不同种系序列的几种重组抗-人IL-18抗体，纯化并且在各种试验中进行功能表征(见表6)。
表6一些抗-IL-18抗体的体外抗原结合，细胞检测和骨架序列特征
使用NEM-cys保护的rhuIL-18。
括号中的数字指明克隆盒中氨基酸与种系序列的差异。
实施例2.2.G产生2.5(E)mg1的CHO细胞系的产生根据下面描述的方法制备表达2.5(E)mg1抗体的稳定的CHO细胞系。
实施例2.2.G 1表达载体的构建构建质粒pA510用于哺乳动物细胞系中抗体的高水平表达。这种pUC19-衍生的质粒包含大肠杆菌ColE1复制起点和用于氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因。
简要地说，应用标准分子生物学技术，克隆相应于2.5(E)mgl抗体的VH和VL区的cDNA，分别与突变的人γ-1和κ恒定区基因，制得编码天然全人IgG1/κ抗体的DNA。将这些DNAs导入表达构建体pA510。得到的质粒包含下面顺序的基因或调控元件的序列(不包括pUC19)5′-CMV增强子，腺病毒主要晚期启动子，人免疫球蛋白信号肽，2.5(E)mg1重链免疫球蛋白可变区，人γ-1免疫球蛋白恒定区，SV40聚腺苷酸化序列，人促胃液素转录中止序列，SV40复制起点(SV40启动子/增强子)，鼠二氢叶酸还原酶序列，来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶聚腺苷酸化序列，CMV增强子，腺病毒主要晚期启动子，人免疫球蛋白信号肽，2.5(E)mg1轻链免疫球蛋白可变区，人κ免疫球蛋白恒定区，SV40聚腺苷酸化序列-3′。将该编码区插入趋动抗体基因转录的强病毒启动子的下游。载体还编码小鼠DHFR基因的表达，根据不存在核苷的培养基中的生长能力筛选转化的细胞。
实施例2.2.G 2表达载体转染到双亲细胞系使用细胞系，CHO DUX B11.(Urlaub，G.和Chasin L.A.ProcNatl Acad Sci USA 774216-4220(1980))，二氢叶酸还原酶(DHFR)基因表达缺陷，转染实施例2.2.G1中描述的表达载体。应用本领域公知的磷酸钙沉淀法用载体转染CHODUX B 11细胞(CurrentProtocols in Molecular Biology；Ausubel，F.V.，Brent，R.，Moore，D.M.，Kingston，R.E.，Seidman，J.G.，Smith，J.A.，和K.Struhl eds；Wiley Interscience，N.Y.，N.Y.(1990))，有下面的改进。对培养板抽吸并且向各板加入9毫升F12培养基。培养板在37℃保温2小时。将150微克DNA溶解于50毫升圆锥形试管中2.7毫升水中。加入300微升2.5M CaCl2，一次一滴，将该DNA混合物加给50毫升圆锥形试管中3毫升2x Hepes缓冲盐水(HeBS)。
将得到的混合物涡流5秒钟并且在室温下温育20分钟。各个板均匀分布1毫升(仍然在F12中)，培养板在37℃保温4小时。温育之后，对培养板抽吸，并且向各板加入2毫升F12中10％DMSO。DMSO处理持续1分钟，然后向各板加入5毫升磷酸盐缓冲盐水(PBS)稀释DMSO。
对培养板抽吸，并且用PBS洗涤两次以上。加入10毫升有核苷的Gibco αMEM，培养板在37℃保温过夜。第二天，培养基换成没有核苷的有5％透析的胎牛血清(FBS)t的GibcoαMEM，6小时之后，如下将细胞接种到96-孔板中。利用胰蛋白酶消化收获10厘米板中的细胞，并且重新悬浮于总共300毫升没有核苷有5％血清(FBS)t的GibcoαMEM中。以10毫升/板，100微升/孔，接种20个96-孔板。加入100毫升相同的培养基，保持100毫升细胞，并且如上所述接种20个另外的96-孔板(这是第二次稀释)。一周之后更换96-孔板中的培养基，又一周后再次更换。使用没有核苷的αMEM培养基选择表达DHFR的细胞，从而选择表达载体。
实施例2.2.G 3产生2.5(E)mg1细胞的选择应用对于人IgG特异性的ELISA，对转染CHO细胞的培养物上清液检测分泌的抗体2.5(E)mg1的存在。一旦筛选了一组CHO转染子用于表达人抗体，用另外的选择分离有扩增数目的整合到CHO基因组中的表达载体的那些细胞。使用药物甲氨喋呤(MTX)选择扩增系。对MTX存在下培养的培养物测定它们产生免疫球蛋白的能力。对比它们MTX-敏感前期物质表达更多抗体的MTX-抗性系进行另一轮更高浓度MTX的筛�。⑶也舛庖咔虻鞍撞�。在1或15升生物反应器中培养表达2.5(E)mg1的CHO细胞，并且在进行两周时测定抗体产率是～1.0克/升。
实施例2.2.HCHO细胞-产生的2.5(E)mg1的物理化学特征进行CHO产生的2.5(E)mg1的初步物理和化学表征。试验测定2.5(E)mg1的分子量大约是149kDa，与理论分子量很好吻合。应用肽图谱技术(K Biemann Annu.Rev.Biochem.1992，61 977-1010；D A.Lewis Accelerated Articles，Anal.Chem.1994，66，585-595)，证明2.5(E)mg1对于轻链和重链具有正确的N-末端。有非常小的重链C末端可变性，因为99％的2.5(E)mg1分子重链羧基末端没有赖氨酸。各个2.5(E)mg1重链包含有寡甘露糖和复合体的单一N-连接糖基化位点，有0，1或2个半乳糖残基的岩藻糖基化两耳结构。
实施例2.2.1CHO细胞-产生的2.5(E)mg1的溶解性和稳定性纯的2.5(E)mg1是可溶的，在pH 5，6和7缓冲剂中至少62毫克/毫升最短4周。在37℃下在这些缓冲剂中进行使用2.5(E)mg1的加速稳定性研究来鉴定稳定性-指征分析和最佳长期贮存pH。通过大小排阻HPLC和SDS-PAGE 周间隔对样品进行分析，测定聚集作用和片段化作用，用于S-S键检测的LC-MS/MS肽图谱，用于活性测定的抗原-ELISA和/或以细胞为基础的生物试验，和阳离子交换HPLC和用于电荷不均匀性测定的iso-Asp定量测定。SEC(大小排阻色谱法)，SDS-PAGE和阳离子交换色谱法对样品的初步分析表明所有三项分析证明了稳定性，因此2.5(E)mg1在～pH6下更稳定。
实施例2.2.JCHO-细胞-产生的抗-IL-18HuMAb，2.5(E)mg1的表征实施例2.2.J 1IL-18物种特异性评价了2.5(E)mg1结合和/或中和人，cynomolgus猴，小鼠，大鼠和狗的IL-18的能力。利用BIACORE分析，根据生产商说明书(参见实施例2.1.B)，证明2.5(E)mg1结合成熟人IL-18，但是不结合小鼠IL-18。另外，免疫沉淀数据表明2.5(E)mg1结合cynomolgus猴IL-18(对于狗IL-18的IC50＝9.1E×10-11)，但是不结合狗或大鼠IL-18。2.5(E)mg1以相似方式功能结合人和cynomolgus IL-18生物活性，但是没有看到狗，大鼠或小鼠IL-18的抑制作用。
实施例2.2.J 2人细胞因子特异性根据生产商说明书(参见实施例2.1.B)，利用BIACORE分析，评价了2.5(E)mg1对于IL-18的特异性。2.5(E)mg1抗体被捕获到生物传感器芯片上，并且测定其与溶液中一组已知人细胞因子结合的能力。如表7所示，2.5(E)mg1结合重组人成熟IL-18和IL-18-原。相反，2.5(E)mg1不结合试验的其他23种人细胞因子的任何一种，包括IL-1家族成员IL-1α和IL-1β。
表7 2.5(E)mg1与细胞因子结合的Biacore分析
a对另外的细胞因子检测结合，包括IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12，IL-13，IL-15，IL-16，IL-17，IL-21，TNF，LT，LTα1β2，和LTα2β1。
2.5(E)mg1与这些细胞因子的任一种都不结合。
半胱氨酸＞丙氨酸突变体BV产生的重组人IL-18实施例2.2.J 3亲和性测定表8给出应用BIACORE试验根据生产商说明书测定的2.5(E)mg1的体外IL-18结合性质。2.5(E)mg1抗体具有快的生成速率，缓慢的解离速率，总亲和性是0.196nM。为了比较，给出两种参照IL-18拮抗剂(125-2H和IL-18结合蛋白)的动力学速率参数。
表8 2.5(E)mg1和参照试剂的IL-18结合性质
在BIACORE中分析(4C/A)-HuIL-18。
b-125-2H，中和小鼠抗-人IL-18IgG1 mAbc-IL-18BP-Fc，天然IL-18拮抗剂的Fc融合实施例2.2.J 4体外IL-18中和能力在KG-1生物实验中，受体结合试验(RBA)和人WBA(参见实施例1.1.A-1.1.C)，测定2.5(E)mg1的体外中和能力。如表8所示，2.5(E)mg1抗体中和重组(KG-1和RBA)和中和IL-18(WBA)，(在KG-1中IC50＜0.5nM，在RBA中＜2nM，在WBA中＜5nM)，并且与其IL-18结合亲和性吻合。
表8 2.5(E)mg1和参照试剂的中和能力
bKG-1生物试验，平均值c在该项试验中使用(4C/A)-huIL-18d受体结合分析使用4-6个供体的人全血分析。给出平均值。
125-2H中和IL-18生物活性，虽然不能抑制受体结合。
实施例2.2.J 52.5(E)mg1的体内中和能力为了评价2.5(E)mg1体内在炎症环境中中和天然人IL-18-诱导的IFNγ的能力，使用严重合并免疫缺陷(SCID)小鼠模型，对小鼠注射人PBMCs，并且体内刺激细胞产生人IL-18(HuPBMC-SCID模型)。结果(表9)表明2.5(E)mg1体内抑制人IL-18-依赖性人IFNγ产生，两种给药途径都是清除的剂量-响应关系。分别通过腹膜内或静脉内给药，2.5(E)mg1的ED50大约是1微克或0.1微克/小鼠(＝0.05毫克/千克或0.005毫克/千克)。
表9A 对HuPBMC-SCID小鼠模型i.p.施用2.5(E)mg1的体内功效
表9B 对HuPBMC-SCID小鼠模型i.v.施用2.5(E)mg1的体内功效
实施例2.2.J 6效应子功能抗体的Fc部分介导几种重要的效应子功能，例如细胞因子诱导，抗体-依赖性细胞-介导的细胞毒性(ADCC)，吞噬作用，补体依赖性细胞毒性(CDC)，和抗体和抗原-抗体复合体的半存留期/清除速率。在一些情况下，这些效应子功能对于治疗性抗体是期望的，但是在其他情况下，可能不是必需的，甚至可能是有害的，取决于治疗主体。一些人IgG同位型，特别是IgG1和IgG3，通过分别与FcγRs和补体C1q结合而介导ADCC和CDC。新生Fc受体(FcRn)是测定抗体的循环半存留期的重要成分。
与2.5(E)mg1相比，2.5(E)mg1中L234A和L235A突变不影响2.5(E)mg1 HuMAb总的亲合力或中和能力(表10)。然而，正如所预期的，这些突变消除与FcγR和C1q的结合。
表10残基L234和L235突变为丙氨酸不影响2.5(E)mg1的亲合力或中和能力
实施例2.2.J 6.1FcγRI结合人FcγRI(CD64)对于IgG1免疫复合体具有相对高的亲合力(KD1E-8～1E-9M)。在单核细胞和巨噬细胞和多种骨髓细胞系上表达，包括U937。通过荧光-激活细胞分类(FACS)(CURRENT PROTOCOLS INIMMUNOLOGY.Vol(1)5.3.1，J.E.Coligan等编著，John Wiley&Sons，Inc.出版，2002)测定2.5(E)wtg1和2.5(E)mg1与U937细胞的结合。获得的数据(参见表11)证明2.5(E)wtg1结合U937细胞，但是正如所预料的，2.5(E)mg1不结合。为了证实这种结合通过FcγRI介导，使用小鼠抗-hFcγRI阻断抗体(10.1)进行竞争试验。这些结果表明，在下面试验的浓度下，抗体10.1以剂量依赖性方式阻断2.5(E)wtg1与U937细胞的结合，因此，2.5(E)wtg1结合U937细胞上的FcγRI。
表11.证明与2.5(E)wtg1相反，2.5(E)wg1不能结合U937细胞上的FcγRI(数据以MFI+/-SD给出)
实施例2.2.J 6.2FcγR II结合人FcγRII(CD32)对于IgG1免疫复合体具有相对低的结合亲合力(KD1E-5～1E-7M)。在生理条件下，它要求生成多价免疫复合体用于激活。使用对于FcγR I，II源特异性的荧光素异硫代氰酸酯(FITC)标记的抗体，并且通过流式细胞计数进行测定，我们证实K562细胞上FcγRII的表达。单体2.5(E)wtg1与K562细胞的结合非常弱。因此，使用抗-κ链抗体使IgG1分子与模拟多价免疫复合体预先交联，并且测定它们与K562细胞上FcγRII的结合。交联之后，2.5(E)wtg1与K562细胞结合，但即使交联之后，2.5(E)wtg1即使表现出，也只是非常小的结合(表12)。抗-FcγRII抗体，克隆IV3，阻断2.5(E)wtg1的结合，因此2.5(E)wtg1与K562的结合是FcγRII介导的。
表12.交联之后2.5(E)wtg1和2.5(E)wg1与K562细胞上FcγRII的结合(数据以MFI+/-SD给出)
实施例2.2.J 6.3C1q结合通过C1q与IgG分子的Fc部分的结合，通过常规途径的细胞的补体激活和溶解被激活。应用本领域公知的标准ELISA技术(Hezareh，M.，等，(2001)J.Virology，75(24)12161-12168)，测定C1q与2.5(E)wtg1和2.5(E)mg1的结合。将2.5(E)wtg1和2.5(E)mg1HuMAbs包被到塑料板上，接着与人C1q温育。然后用山羊-抗-人C1q和兔抗-山羊IgG碱性磷酸酶偶联物的混合物检测结合的C1q分子。结果表明2.5(E)wtg1结合C1q，但是2.5(E)mg1不结合(表13)。
表13.ELISA证明与2.5(E)wtg1相反，2.5(E)wg1不能结合C1q(数据以D405+/-SD给出)
实施例2.2.J 6.4新生儿Fc受体(FcRn)结合提出IgG与内皮细胞中新生儿Fc受体(也称作Bramble受体)的相互作用是IgG质量控制系统和IgG长半寿期的关键决定因素[Ghetie，V.，等(1997)Nat.Biotechnol.15637-640]。通过饮液吸收的IgG分子以及成功地与细胞液泡中FcRn结合返回循环。不能结合FcRn的IgG分子降解。
对人IgG与FcRn结合的关键残基作出图谱连接CH2-CH3结构域(Kim J.K.，等(1999)Eur.J.Immunol.292819-2825)。重要地，这些FcRn结合残基在人和小鼠免疫球蛋白之间是保守的，并且人免疫球蛋白结合小鼠FcRn，使得可以对小鼠进行结构活性相关性研究。
为了测定L234A和L235A突变对FcRn结合的影响，利用FcRn表达CHO细胞系，测定野生型2.5(E)wtg1和突变体2.5(E)mg1与FcRn体外结合。2.5(E)wtg1和2.5(E)mg1与FcRn表达CHO细胞在pH 6.5下温育，接着与FITC-偶联抗-人IgG(2Ab)温育。将细胞洗涤并且通过FACS分析。
与0.5nM浓度相比，500nM浓度的2.5(E)mg1和2.5(E)wtg1表现出与FcRn显著结合，这与单独用细胞的背景类似。
实施例2.2.K小鼠药动学在筛选小鼠研究中评价2.5(E)mg1的药动学(PK)，测定Fc突变的引入(L234A，L235A)是否防止2.5(E)mg1结合FcγR，以及C1q是否副作用影响血清PK曲线。小鼠FcRn结合小鼠和人IgG同样好地使小鼠成为相关物种，用于小鼠结构活性相关性研究(Ober，R.J.，等(2001)Int.Immunol.131551-1559)。在小鼠中，估计最终2.5(E)mg1半寿期是12天。在类似研究中，其他人单克隆抗体的半寿期是10-14天。
对雌性小鼠(Jackson Labs，C57BL/6n)评价2.5(E)mg1的药动学，一次静脉内施用剂量0.2毫克(相当于10毫克/千克的平均值)。总共对24小鼠给药，并且从每只小鼠取3个样品。取样方案持续7天。2.5(E)mg1显示一个分布期，接着是一个排除期。分布和消除半寿期估计值大约是1.6小时和12天，取决于两个隔室开放模型(表14)。
表14 对小鼠一次静脉内给药产生的2.5(E)mg1的关键药动学参数总结
疾病模型实施例2.2.L疾病模型中抗-IL-18抗体的作用实施例2.2.L.1抗-muIL-18mAbs对LPS-诱导的IFNg产生的抑制作用LPS-诱导的IFNγ产生取决于IL-18表达(Ghayur，T.，等，1997.Nature 386619-623.)。利用LPS-诱导的IFNγ产生试验来测定93-10C体内抑制IL-18-依赖性LPS-诱导的IFNγ产生的效力。对小鼠iv施用单一剂量的93-10C(50微克)。30分钟之后，用LPS(20毫克/千克)攻击小鼠，4小时之后取血。通过ELISA测定血清IFNγ滴度。如表15所示，93-10C将LPS-诱导的IFNγ产生抑制70％。
表15 93-10C体内抑制LPS-诱导的IFNg产生
实施例2.2.L.2角叉藻聚糖-诱导的爪水肿的抑制嗜中性白细胞集中在炎症位点中涉及IL-18。角叉藻聚糖-诱导的爪垫水肿是单核细胞和嗜中性白细胞-依赖性炎症模型。通过中和IL-18的生物活性，这个模型的水肿能显著被抑制(Leung，B.P.，等(2001)J.Immunol.1672879-2886)。用1C5(400微克)(Hyashibara Laboratories，日本)或93-10C(100微克)(Medicaland Biological Laboratories(MBL)Co.Watertown MA.)或对照抗体在后爪垫对小鼠给药(ip)，然后用角叉藻聚糖注射(sc)。从24小时至96小时每天测量角叉藻聚糖-诱导的水肿。攻击之后，从24小时至96小时，1C5和93-10C显著抑制角叉藻聚糖-诱导的水肿(～50％抑制作用)(表16)。除了阻断嗜中性白细胞渗滤，93-10C还阻断这种模型中炎症位点的TNF表达(Leung，B.P.，等(2001)J.Immunol.1672879-2886)。
表16角叉藻聚糖-诱导的爪水肿的体内抑制
实施例2.2.L.3胶原-诱导的关节炎类风湿性关节炎(RA)特征在于关节的慢性炎症，和骨和关节软骨的损失。虽然认为RA是自身免疫疾�。腔姑挥屑ㄉ婕暗淖陨砜乖⑶壹膊〉木凡∫蜓Щ共磺宄�。胶原-诱导的关节炎(CIA)是广泛使用的RA模型并且具有与人基本类似的病理组织学特征(Bendele，A.，等(1999)Toxicol Pathol.27134-142；Trentham，D.E.等(1977)J.Exp.Med.146857-868)。在这个模型中，用弗氏完全佐剂中II型胶原(CII)免疫易受遗传影响的小鼠或大鼠。得到的多关节炎特征在于软骨破坏，骨吸收，滑膜炎，和关节周炎症(Bendele，A.，等(1999)Toxicol Pathol.27134-142)。DBA/1背景的IL-18 KO小鼠表现比野生型小鼠降低的发生率和CIA严重度(Wei，X.Q.，等(2000)J.Immunol.166517-521)。
为了找到内源IL-18在CIA的发病机理中的作用，用中和小鼠IL-18的兔多克隆IgG(BA77)处理小鼠。从致敏时起给药14天时，BA77推迟疾病发作并且导致疾病严重程度的显著减轻。BA77还显著抑制IgG2a抗-胶原抗体的产生。这些结果与对于rIL-18KO小鼠报道的那些类似，并且证实和早期CIA中重要促炎症细胞因子一样的rIL-18的作用。
来自IL-18 KO小鼠和抗-IL-18IgG处理的野生型小鼠的数据表明，在CII-I诱导的最初的T细胞激活中，IL-18起着重要的促炎症作用。为了更好地理解IL-18在CIA启动期间的作用，用CII免疫小鼠，并且在疾病发作之前开始用大鼠IgG或93-10C处理，这大概要14天。与对照大鼠IgG相比，用93-10C治疗导致疾病发作和严重度的显著延迟(表17)。这些数据表明IL-18是有效的因子，不仅是在T细胞引发中，而且还在CII-特异性T细胞激活之后促进arthritogenic响应中。
表17 抗-IL-18mAb 93-10C延迟发病并且减轻CIA严重性
实施例2.2.L.4脓毒性关节炎IL-18在脓毒性关节炎的小鼠模型的发病机理中是重要因子。一般不认为这是RA的模型，但是同样有一些炎性成分和与RA相关的病理。在这个模型中，向膝关节注射活B组链球菌(GBS)诱发疾病。跟着发生的关节炎的严重度与IL-10和IL-6的全身和局部水平有关，而与TNF无关(Tissi L.，等(1999)Infect.Immunol.674545-50)。用血清型IV(GBS)注射后12小时这样早就在关节中测定了显著IL-18水平，接着在5天之后IL-18产生达到峰值(处理的1C5中～550pg/ml，对IgG对照物中～30pg/ml)。注射后5天在血清中测得提高的IL-18水平(处理的1C5中～180pg/ml，对IgG对照物中～20pg/ml)。
在施用GBS之前1小时注射1C5时，从第二天至第十天关节损伤频率有显著抑制作用(关节指数处理的1C5中1.0，对IgG对照物中2.5)。另外，1C5处理还导致关节中细胞因子包括IL-6和IL-1β的水平显著减小(没有给出数据)。
实施例2.2.L.5SLE大多研究的狼疮模型涉及小鼠品系(MRL/lpr和NZB/NZW F1)，该小鼠品系自发发生狼疮样症状，伴有严重肾小球肾炎，自身抗体产生(抗-DNA，抗RNP等)，脾大，淋巴结�。鸵欢ǔ潭裙亟谘缀徒峤谛月龉苎�。通常在3-5月龄时观察到肾涉及，发展快速，6-10个月是致命的。充分研究两个小鼠品系，弄明白了临床疾病。
选择NZB/NZW F1(B/W)小鼠模型(The Jackson Laboratory，Maine，USA)作为评价外源IL-18对狼疮样疾病进程的影响的最相关模型。通常在7-9月龄发现B/W小鼠开始疾病进程，12-14个月作为肾衰竭结果是致命的。为了研究狼疮发病机理中IL-18的作用，在7月龄开始每天用r-muIL-18或赋形剂对照物治疗B/W小鼠。通过测定蛋白尿程度评价肾功能。与PBS赋形剂治疗组相比，每天用50微克/千克IL-18治疗B/W小鼠导致促进严重蛋白尿的开始。IL-18治疗的B/W小鼠还显示加速死亡。这些观察与上面对于MRL/lpr小鼠描述的那些相吻合，并且划线于自身免疫基本中IL-18的促炎作用。
为了研究SLE小鼠模型中IL-18阻断的治疗效果，建立了B/W小鼠诱导-保持处理方案，它概括了用于狼疮肾炎的临床治疗法。在该项研究中，严重肾炎的B/W小鼠接受5周环磷酰胺给药(诱导期)，接着是长期1C5或小鼠IgG对照(125-2H)处理(保持期)。
结果证明，与对照物IgG1 125-2H相比，继续130天保持处理，1C5显著延长了BW小鼠的存活期。125-2H是小鼠IgG1 mAb，它不识别muIL-18(P＜0.05，)。除了延长存活期，延迟了严重蛋白尿的开始，降低了1C5处理的BW小鼠中的IgG2a和IgG1抗-dsDNA。1C5处理对抗-dsDNA的减少是瞬时的，不是统计学意义的。检测抗1C5抗体(小鼠抗-小鼠抗体[MAMA])，根据存活率的迅速降低和在抗dsDNA滴度和蛋白尿减少中作用的丧失所证明的，130天之后效能丧失。结论是，尽管抗体的存在响应1C5，1C5阻断IL-18延长存活期，延迟严重蛋白尿的发生，并且减小B/W小鼠抗-dsDNA滴度。这些数据证明IL-18在促进炎症响应中的作用导致肾功能缺损，最后死亡。
实施例2.2.L.6多发性硬化研究了IL-18对试验性变应性脑脊髓炎(EAE；MS鼠模型)的贡献。认为复发-缓解EAE是人类疾病的适当模型，因为有相似的疾病过程，临床征兆，和CNS病理学。在这些研究中，对IL-18KO小鼠和WTC57/B16诱导疾病。
IL-18KO小鼠表现出与WT小鼠相比疾病症状发生稍微延迟，在后来的时间点，疾病发展严重程度显著减小(表18)。在免疫后0-14天，用BA77(抗-小鼠IL-18IgG(250毫克，2X/wk)处理WT小鼠，在后来的时间点延迟疾病病症的发生并且显著限制疾病的严重程度(表18)。在后来的时间点，即使在停止治疗之后，还能观察到抗-IL-18IgG的保护作用。
表18抗-IL-18Ab处理的小鼠和IL-18敲除小鼠发生严重度减小的EAE疾病
实施例2.2.L.7肝损伤刀豆球蛋白A(Con A)-诱导的肝炎/肝损伤是T-细胞-介导肝病的动物模型。Con A对肝内T-细胞的激活导致局部产生炎性传递质介体(例如IFNγ和Fas配基)。Fas-Fas配基相互作用导致IL-18的产生，其进一步诱导IFNγ，Fas配基和TNF产生。因此，确立阳性反馈圈，其导致肝损伤和将死细胞过量产生肝酶例如ALT和AST。在静脉内施用150微克Con A之前1小时，注射(ip)1C5或93-10C mAbs。ConA注射后24小时对小鼠取血，并且测定肝酶(ALT&AST)的血清滴度。1C5和93-10C都阻断LPS-诱导的肝酶提高，但是在低剂量时93-10C也有效(表19)。
表19 93-10C对ConA-诱导的肝炎的体内抑制
实施例2.2.L.8脓毒症IL-18已经显示是内毒素休克的重要的传递质。IL-18可能是内毒素诱导的肺，肝和多器官衰竭的决定性介体(Neeta，M.G.，等(2000)J.Immunol.1642644-2649)。IL-18的这种作用可能以其调节细胞毒性介体产生的能力以及其激活先天免疫应答的能力和对局部炎症部位补充嗜中性白细胞的能力为基础。另外，LPS攻击诱导IFNγ，TNF和IL-1血清水平升高，这些细胞因子对LPS-诱导的死亡率有贡献。用LPS攻击的IL-18敲除小鼠LPS-诱导IFNγ不足，并且比WT小鼠产生少得多的TNF和IL-1(Takeda，K.，等(1998)Immunity 8383-390)。
如下进行LPS诱导死亡率实验。第0天对动物称重并且确定合适的给药剂量。在T＝-1小时，用500微升0.9％盐水中抗-IL-18抗体或对照抗体对动物腹膜内(IP)注射。在T＝0，用100微升0.9％盐水中20毫克/千克脂多糖(LPS)(大肠杆菌血清型0111B4 SigmaCat#L-4130 lo#71K4110)对动物静脉内注射。4小时后，通过心脏穿刺对动物采血。通过muIFNy ELISA(R&D Systems)测定血清muIFNγ滴度。
保护用抗-muIL-18mAbs，1C5或93-10C处理的WT小鼠免受LPS-诱导的致死率(表20)(125-2H，和1C5具有相同的失活同位型，但是不结合作为对照物的muIL-18)。另外，据报道，抗-IL-18IgG处理的小鼠在LPS攻击之后具有减小的肺和肝损伤，这与减少的嗜中性白细胞聚集有关(Neeta，M.G.，等(2000)J.Immunol.1642644-2649)。
表20 1C5和93-10CmAbs防止高剂量LPS致死性
实施例2.2.M2.5(E)Fab片段的结晶为了证明本发明的抗体能被结晶，从而能制备含有结晶抗体的制剂和组合物，进行下面的实验。
实施例2.2.M.12.5(E)抗体Fab片段的制备和纯化在SR-286培养基中在CHO细胞中表达2.5(E)人IgG。溶胞之后上清液通过0.5微米过滤器过滤并且加载到在Protein A缓冲剂A(1XPBS)中预平衡的Protein A柱上。然后用Protein A缓冲剂B(0.1M乙酸钠pH 3.5，150 mM NaCI)洗脱IgG。将合并的IgG浓缩至20毫克/毫升，与50％木瓜蛋白酶凝胶浆状物混合，巨烈搅拌下在37℃下温育24小时。然后4℃下抗体/浆液混合物对50mM Tris缓冲剂pH 7.0透析过夜，从缓冲剂去除半胱氨酸。通过用100毫升缓冲剂A(50mM Tris pH 7.0)制备25毫升蛋白质A琼脂糖4 Fast Flow亲和柱(Amersham Pharmacia)。透析的上清液应用到亲和柱上(流速2毫升/分钟)。在流通池中收集2.5(E)Fab级分(在280nm下通过UV吸光度测定)。将含有浓度大于0.3毫克/毫升(在280nm下通过UV吸光度测定)的2.5(E)Fab的级分合并，并且使用Ultrafree-15Biomax 10kDa截留分子量(MWCO)离心过滤装置(Millipore)浓缩至-20毫克/毫升并且在-80℃下冷冻。在下面描述的结晶学实验中使用该浓缩样品。应用SDS-PAGE测定样品纯度。
实施例2.2.M.22.5(E)Fab片段的结晶冷冻2.5(E)Fab贮存液(～20毫克/毫升)在冰上解冻。Fab(2微升)与2微升的由25-30％聚乙二醇(PEG)400，100mM CAPS pH 10.5组成的贮存液混合，并且在大约4℃下在硅化玻璃载玻片下面的贮存液上悬浮。一天之内出现杆状晶体。测得杆状晶体是2.5(E)Fab片段晶体(没有给出数据)。
实施例3IL-18响应基因实施例3.1材料和方法实施例4中，除非另有说明，使用下面的材料和方法。
实施例3.1.A细胞处理和RNA制备实施例3.1.A.1KG-1细胞在四个处理组中，对各试验条件使用大约3.0×107个KG1细胞(ATCC#CCL-246)。首先，有或没有与10毫克/毫升放线菌酮预先温育30分钟情况下，用50ng/mL重组IL18处理细胞。30分钟之后或2小时之后，对细胞收集RNA。其次，有或没有与10毫克/毫升放线菌酮预先温育30分钟情况下，用0，0.5，2.0，10或50ng/mL重组IL18处理细胞。2小时之后，对细胞收集RNA。第三，用0或10ng/mL TNF处理细胞。过夜温育之后，有或没有与10毫克/毫升放线菌酮预先温育30分钟情况下，用0，0.5，2.0，10或50ng/mL重组IL18处理细胞。2小时之后，对细胞收集RNA。在最后的处理组中，有或没有与10毫克/毫升放线菌酮预先温育30分钟情况下，用0或10ng/mLTNF和0或2.0ng/mL重组IL18同时处理细胞。2小时之后，对细胞收集RNA。
使用TRIZOL试剂(Life Technologies，Rockville，MD)制备总RNA。根据生产商说明进行初始阶段分离，并且接着使用一半体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1，Life Technologies，Rockville，MD)进行另外的萃取。根据生产商TRIZOL程序说明进行RNA沉淀和洗涤。在1.0％琼脂糖/甲醛变性凝胶上对大约3微克RNA进行电泳测定性质。
对于需要TNF预先温育的实验，KG-1细胞与2ng/ml TNF温育12小时，然后用2，10或40ng/ml的IL-18刺激。如上所述制备RNA。
实施例3.1.A.2人全血分析2.5mL等份全血装入15毫升圆锥形试管并且用IL18，IL12，IL18+IL12，IL18+IL12+抗-IL18或IL18+1L12，IL18+1L12+对照抗体处理。最终浓度如下IL12-500pg/mL，IL18(YK27-1)～50ng/mL，mIgG～5ug/mL，抗-IL18 1252H～5ug/mL，和抗-IL18 2.5～4ug/mL。37℃下，温和地间歇式地反转下将混合物温育。温育之后，通过加入5毫升1X溶胞缓冲液(在Depc中以110稀释的PharM溶解氯化铵溶解试剂)，利用氯化铵回收红细胞。在冰上5分钟之后，以1200rpm将混合物离心5分钟。将该程序重复一次，得到白色血白细胞沉淀物。接着应用上述Trizol程序分离RNA。对于微量阵列分析，所有的样品体积增加4倍。
实施例3.1.B探针的制备和靶物杂交使用10微克总RNA和用于cDNA合成的SuperScript ChoiceSystem(Gibco BRL，Gaithersburg，MD)来合成双链cDNA。根据Affymetrix(Santa Clara，CA)程序进行合成，需要T7-(dT)24寡聚物引物(GENSET)代替试剂盒提供的寡(dT)或随机引物，并且在温度调节和第一个链合成步骤期间在42℃下温育。得到的cDNA用PhaseLock Gel Light 2毫升试管(Eppendorf AG，Hamburg，DE)清洗，沉淀物悬浮于12微升DEPC-H2O。与BioArray High Yield RNA转录标记试剂盒(Enzo，Farmingdale，NY)联合使用5微升cDNA，通过从T7RNA聚合酶启动子体外转录(IVT)，制备生物素-标记cRNA靶物。使用RNeasy Mini Columns(Qiagen，Hilden，DE)从IVT反应去除游离的核苷酸。然后根据Affymetrix方法将15微克生物素-标记的cRNA片段化。将全部片段化样品与5微升对照物寡核苷酸B2(Affymetrix)，15微升20X Eukaryotic Hybridization Control(Affymetrix)，3微升超声处理的鲑精DNA(10毫克/毫升，Stratagene，La Jolla，CA)，3微升乙酰化BSA(50毫克/毫升，Gibco BRL)，150微升2X MES杂交缓冲液，和水，达到300微升终体积。根据Affymetrix方法，预先用1X MES湿润Genechip HuGeneFLArrays(Affymetrix)。然后将杂交混合物加热并离心，并且将200微升加载到芯片上。芯片在45℃烤箱中自旋16小时。
实施例3.1.C对探针阵列洗涤，染色和扫描从芯片取出杂交混合物并且用非严谨洗涤缓冲液置换。利用EukGE-WS2方案，在GeneChip Fluidics Station 400上，根据生产商说明书(Affymetrix)；用链霉抗生素素蛋白藻红蛋白(SAPE)染色溶液和抗体溶液对芯片染色的方法，将芯片洗涤和染色。所有的需要的缓冲洗涤液和染色剂都根据Affymetrix方法制备。与GeneChipsoftware(Affymetrix)联合使用GeneArray Scanner(Agilent，Palo Alto，CA)来扫描染色阵列。
实施例3.1.D数据分析基因芯片数据从Affymetrix MAS4传给Microsoft Excel，然后上载到Spotfire Decisionsite 7.0。
实施例3.2IL-18调控的基因表达实施例3.2.1单独的IL18直接调控基因在KG1细胞中形成股为了测定IL18直接调控的转录体，在存在和不存在蛋白质合成抑制剂放线菌酮下，使用KG1细胞进行细胞因子滴定试验。表1所示的是在存在和不存在放线菌酮的至少一种条件下已经被调控2倍或更多的67个不同探针组(由于芯片上的冗余性)代表的62个转录体的列表，p值小于0.05(利用斯氏t分析)。这些基因包括各种功能分类，包括转录因子，激酶，和分泌的蛋白质。因为这些基因是受调控的，没有从头合成蛋白质，这些基因直接响应IL18诱导的信号。12个基因编码分泌的蛋白质，并且13个编码表面分子(制备这些可行抗体靶物)。其余编码细胞核和胞质蛋白质(见表21)。
表21.IL18诱导的基因
实施例3.2.2细胞因子暴露历史影响KG-1细胞对IL-18的响应因为在免疫应答中细胞因子一般接着出现，对IL18处理之前与TNF一起温育KG-1细胞的效果进行分析。该项试验还验证了细胞因子暴露历史可以影响它们对接着的细胞因子暴露的响应的假设。在加入IL18之前用2ng TNF将细胞处理12小时并且在4小时之后收获。
IL18调控这些条件下大约125种基因的表达(表2)。获得这组基因使用的过滤条件由于TNF而变化小于50％，由于10ng/mL和40ng/mLIL18而变化两倍或更大。这些基因包括各种各样的功能分类，包括转录因子，激酶，和分泌的蛋白质(表22)。与这里试验的其他条件相反，我们发现干扰素γmRNA和暴露TNF之后IL18诱导的蛋白质。
表22.TNF处理后IL18调控的基因
实施例3.2.3人白细胞对IL18的响应试验了人白细胞(分离的白细胞生成)对单独的IL18或者与IL12联合的IL18的响应。也分析了抗-IL18单克隆抗体抑制转录应答的能力。根据实施例4.1所述处理细胞。分离RNA并且用于探测AffymetrixGenechips(Hugene，FL)。表23给出结果，列出了IL18+IL12诱导的被抗-IL18抗体反转的49个转录物。几种基因与免疫系统有关。这些基因中的很多也由KG-1细胞中的IL18诱导。
表23.根据使用Affymetrix Genechips所测定的，从人白细胞样品中IL18+IL12正调节4倍或更多并且由125 2H反转的转录物中选择的其他有效IL18/IL12标记物
实施例3.2.4人全血对IL18的响应试验了全血细胞对单独的IL18或者与IL12联合的IL18的响应。也分析了抗-IL18单克隆抗体抑制转录应答的能力。根据实施例4.1所述处理正常的供体血样。分离RNA，并且用来探测AffymetrixGenechips(HugeneFL)。表24给出结果，它列出IL18+IL12显著调控的并且抗-IL18抗体反转的从两名健康供体分离的全血样中16个转录体。几个基因与免疫系统有关。我们应用定量PCR平行对10名正常供体的这些基因中的三个测定响应。表25对于干扰素γ给出这个人可变性研究的结果；表26给出CXCL9的结果，表27给出CCL8的结果。可变性研究的结果表明，人血液中IL18对这些转录体的调控在人中可能是普遍的。
表24.从两名供体分离的然后用IL18+IL12处理的全血正调节转录体选择的其他IL18/IL12有效标记物
表25.10个人血样中干扰素γ性能。全抗体的抑制作用p＜0.05
表26.10个人血样中MIG/CXCL9性能。全抗体的抑制作用p＜0.05
表27.10个人血样中MCP2/CCL8性能。全抗体的抑制作用p＜0.05
实施例4抗-IL-18HuMAb，2.13(E)mg1的表征实施例4.1人细胞因子特异性应用BIACORE试验，根据生产商说明书(参见实施例2.1.B)，评价2.13(E)mg1对人IL-18的特异性。2.13(E)mg1捕获到生物芯片商，并且测定其与溶液中一组已知人细胞因子结合的能力。如图28所示，2.13(E)mg1结合重组成熟人IL-18。然而，2.13(E)mg1不与人IL-18原结合，也不与试验的其他23种人细胞因子结合，包括IL-1家族成员IL-1α和IL-1β。
表282.13(E)mg1和2.5(E)mg1对细胞因子结合的Biacore分析
c用于结合试验的另外的细胞因子包括IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，L-10，IL-11，IL-12，IL-13，IL-15，L-16，IL-17，IL-21，TNF，LT，LTα1β2，和LTα2β1。2.13(E)mg1与这些细胞因子的任一个都不结合。
半胱氨酸＞丙氨酸突变体BV衍生的重组人IL-18实施例4.2与其他抗体竞争结合人IL-18应用BIACORE试验，根据生产商说明书(参见实施例2.1.B)，评价几种抗-IL-18抗体与2.13(E)mg1竞争结合人IL-18的能力。简要地说，多克隆抗-人或抗-小鼠抗体捕获到生物芯片上。然后，导入抗-IL-18抗体，并且用固定在上述生物芯片上的多克隆抗-人或抗-小鼠(仅对125-2H)抗体(第一固定化抗体)捕获。然后导入重组人IL-18并且由第一固定化抗体捕获。最后，导入第二可溶性抗-IL-18抗体。该试验测定第二可溶性抗-IL-18抗体结合重组IL-18并且与第一抗体竞争的能力。2.13(E)mg1不与2.5(E)mg1或IL-18BP竞争。鼠抗-huIL-18单克隆抗体125-2H与2.13(E)mg1竞争结合人IL-18。
表29结合人IL-18的抗体竞争BIACORE a分析
+指第一和第二抗体同时结合-指第二抗体不能结合捕获的IL-18本发明参考了分子生物学领域公知的全部技术。这些技术包括，但不限于，下面出版物中描述的技术Ausubel，F.M.等编著，Short Protocols In MolecularBiology(第四版1999)John Wiley & Sons，NY.(ISBN 0-471-32938-X)。
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虽然上面描述了很多实施方案和特征，本领域技术人员明白可以对所描述的实施方案和特征进行修饰和改变而不脱离本发明公开内容后面权利要求书定义的本发明。这里提到的各个公开物在此引作参考。
序列表<110>Ghayur，TariqLabkovsky，BorisVoss，JeffreyGreen，LarryBabcook，JohnJia，Xiao-chiWieler，JamesKang，PaulHegberg，Brad<120>IL-18结合蛋白<130>BBC-085US<140>not yet assigned<141>filed concurrently herewith<160>47<210>1<211>193<212>PRT<213>人<400>1Met Ala Ala Glu Pro Val Glu Asp Asn Cys Ile Asn Phe Val Ala Met1 5 10 15Lys Phe Ile Asp Asn Thr Leu Tyr Phe Ile Ala Glu Asp Asp Glu Asn20 25 30Leu Glu Ser Asp Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile35 40 45Arg Asn Leu Asn Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro50 55 60
Leu Phe Glu Asp Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg65 70 75 80Thr Ile Phe Ile Ile Ser Met Tyr Lys Asp Ser Gln Pro Arg Gly Met85 90 95Ala Val Thr Ile Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys100 105 110Glu Asn Lys Ile Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile115 120 125Lys Asp Thr Lys Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Ser Val Pro Gly130 135 140His Asp Asn Lys Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe145 150 155 160Leu Ala Cys Glu Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys165 170 175Glu Asp Glu Leu Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu180 185 190Asp<210>2<211>330<212>PRT<213>人<400>2Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr20 25 30Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser35 40 45Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser50 55 60Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr65 70 75 80Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys85 90 95Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys100 105 110Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro115 120 125Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys130 135 140Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp145 150 155 160Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu165 170 175Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
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100 105 110Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115<210>35<211>109<212>PRT<213>人<400>35Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asn Ser Gly20 25 30Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu35 40 45Ile Tyr Gly Val Ser Ile Arg Ala Thr Asp Ile Pro Asp Arg Phe Ser50 55 60Gly Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu65 70 75 80Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Phe Ser Pro85 90 95Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Val Glu Ile Asn Arg100 105<210>36<211>127
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Asp Ile Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly1 5 10 15Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Gly20 25 30Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Pro35 40 45Pro Gln Phe Leu Ile Gln Glu Leu Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro50 55 60Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile65 70 75 80Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ser85 90 95Leu Gln Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Gln Ile Lys100 105 110Arg<210>38<211>119<212>PRT<213>人<400>38Glx Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Tyr
20 25 30Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Arg Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Lys Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Glu Gly Gly Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly100 105 110Thr Thr Val Thr Val Ser Ser115<210>39<211>109<212>PRT<213>人<400>39Glu Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asn Val Ser Ser Ser20 25 30Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Asn Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser50 55 60Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu65 70 75 80Pro Glu Asp Phe Glu Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Gly Ser Ser Leu85 90 95Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg100 105<210>40<211>120<212>PRT<213>人<400>40Glx Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln1 5 10 15Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Arg Ser Gly20 25 30Asp His Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu35 40 45Trp Ile Gly His Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser50 55 60Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Ile Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr85 90 95Cys Ala Arg Asp Tyr Gly Gly Asn Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln100 105 110Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120<210>41<211>114<212>PRT<213>人<400>41Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly1 5 10 15Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser20 25 30Asp Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln35 40 45Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Leu Ser Tyr Arg Ala Ser Gly Val50 55 60Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn65 70 75 80Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln85 90 95
Arg Ile Glu Phe Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile100 105 110Lys Arg<210>42<211>7<212>PRT<213>人工<220>
<223>抗-IL-18抗体CDR序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)<223>Xaa是Ser，Asn，His，Arg，或Tyr<220>
<221>misc_feature<222>(2)<223>Xaa是Tyr，Gly，Arg，Ser，或Cys<220>
<221>misc_feature<222>(3)<223>Xaa是Trp，Gly，Tyr，Asp，Ser，Val，或Ile<220>
<221>misc_feature<222>(4)<223>Xaa是Ile，His，Trp，Tyr，Met，Leu，或Asp<220>
<221>misc_feature<222>(5)
<223>Xaa是Gly，Tyr，Ser，Asn，或His<220>
<221>misc_feature<222>(6)<223>Xaa是Trp，或不存在<220>
<221>misc_feature<222>(7)<223>Xaa是Thr，Ser，Gly，或不存在<400>42Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa1 5<210>43<211>17<212>PRT<213>人工<220>
<223>抗-IL-18抗体CDR序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)<223>Xaa是Phe，Tyr，His，Ser，或Val<220>
<221>misc_feature<222>(2)<223>Xaa是Ile，或Phe<220>
<221>misc_feature
<222>(3)<223>Xaa是Tyr，Ser，或Trp<220>
<221>misc_feature<222>(4)<223>Xaa是Pro，Tyr，或Ser<220>
<221>misc_feature<222>(5)<223>Xaa是Gly，Ser，Arg，或Asp<220>
<221>misc_feature<222>(6)<223>Xaa是Asp，或Gly<220>
<221>misc_feature<222>(7)<223>Xaa是Ser，Thr，Gly，或Arg<220>
<221>misc_feature<222>(8)<223>Xaa是Glu，Thr，Ile，或Asn<220>
<221>misc_feature<222>(9)<223>Xaa是Thr，Tyr，Asn，Ile，Lys，或His<220>
<221>misc_feature<222>(10)<223>Xaa是Arg，Tyr，或Ser
<220>
<221>misc_feature<222>(11)<223>Xaa是Tyr，Asn，或Ser<220>
<221>misc_feature<222>(12)<223>Xaa是Ser，Pro，Ala，或Val<220>
<221>misc_feature<222>(13)<223>Xaa是Pro，Ser，或Asp<220>
<221>misc_feature<222>(14)<223>Xaa是Thr，Leu，或Ser<220>
<221>misc_feature<222>(15)<223>Xaa是Phe，Lys，或Val<220>
<221>misc_feature<222>(16)<223>Xaa是Gln，Ser，或Lys<220>
<221>misc_feature<222>(17)<223>Xaa是Gly，或不存在
<400>43Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa1 5 10 15Xaa<210>44<211>18<212>PRT<213>人工<220>
<223>抗-IL-18抗体CDR序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)<223>Xaa是Val，Asp，Glu，Ser，或Cys<220>
<221>misc_feature<222>(2)<223>Xaa是Gly，Arg，Asp，Ser，Lys，Leu，Tyr，或Ala<220>
<221>misc_feature<222>(3)<223>Xaa是Ser，Gly，Tyr，或Arg<220>
<221>misc_feature<222>(4)<223>Xaa是Gly，Ser，Tyr，Asn，Thr，或Asp<220>
<221>misc_feature<222>(5)<223>Xaa是Trp，Ser，Ala，Gly，Tyr，或Thr<220>
<221>misc_feature<222>(6)<223>Xaa是Tyr，Gly，Ser，Phe，Trp，或Asn<220>
<221>misc_feature<222>(7)<223>Xaa是Pro，Ser，Phe，Tyr，Val，Gly，Trp，或Val<220>
<221>misc_feature<222>(8)<223>Xaa是Tyr，Phe，Asp，Pro，Met，Ile，或Asn<220>
<221>misc_feature<222>(9)<223>Xaa是Thr，Trp，Asp，Leu，Tyr，Glu，Pro，Phe，或Gly<220>
<221>misc_feature<222>(10)<223>Xaa是Phe，Asp，Tyr，His，Val，Tyr，或不存在<220>
<221>misc_feature<222>(11)<223>Xaa是Asp，Tyr，Phe，Leu，或不存在<220>
<221>misc_feature<222>(12)
<223>Xaa是Ile，Asp，Tyr，或不存在<220>
<221>misc_feature<222>(13)<223>Xaa是Tyr，或不存在<220>
<221>misc_feature<222>(14)<223>Xaa是Tyr，或不存在<220>
<221>misc_feature<222>(15)<223>Xaa是Gly，或不存在<220>
<221>misc_feature<222>(16)<223>Xaa是Met，或不存在<220>
<221>misc_feature<222>(17)<223>Xaa是Asp，或不存在<220>
<221>misc_feature<222>(18)<223>Xaa是Val，或不存在<400>44Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa1 5 10 15
Xaa Xaa<210>45<211>17<212>PRT<213>人工<220>
<223>抗-IL-18抗体CDR序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)<223>Xaa是Arg，或Lys<220>
<221>misc_feature<222>(2)<223>Xaa是Ala，Gly，或Ser<220>
<221>misc_feature<222>(3)<223>Xaa是Ser<220>
<221>misc_feature<222>(4)<223>Xaa是Glu，Arg，Gln，或His<220>
<221>misc_feature<222>(5)<223>Xaa是Ser，Ile，Thr，或Asn
<220>
<221>misc_feature<222>(6)<223>Xaa是Ile，Val，Leu，或Phe<220>
<221>misc_feature<222>(7)<223>Xaa是Ser，Gly，Leu，Asn，或Arg<220>
<221>misc_feature<222>(8)<223>Xaa是Ser，Gly，Tyr，Arg，Asn，His，或Asp<220>
<221>misc_feature<222>(9)<223>Xaa是Asn，Gly，Tyr，Arg，或Ser<220>
<221>misc_feature<222>(10)<223>Xaa是Leu，Tyr，Ser，或Asp<220>
<221>misc_feature<222>(11)<223>Xaa是Ala，Leu，Asn，Val，Gly，或Asp<220>
<221>misc_feature<222>(12)<223>Xaa是Ala，Asn，Glu，Lys，Gly，或不存在<220>
<221>misc_feature
<222>(13)<223>Xaa是Lys，Thr，Asn，或不存在<220>
<221>misc_feature<222>(14)<223>Xaa是Asn，Tyr，Thr，或不存在<220>
<221>misc_feature<222>(15)<223>Xaa是Tyr，Leu，或不存在<220>
<221>misc_feature<222>(16)<223>Xaa是Leu，Cys，Tyr，或不存在<220>
<221>misc_feature<222>(17)<223>Xaa是Ala，Asp，或不存在<400>45Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa1 5 10 15Xaa<210>46<211>7<212>PRT<213>人工<220>
<223>抗-IL-18抗体CDR序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)<223>Xaa是Thr，Gly，Ser，Trp，或Glu<220>
<221>misc_feature<222>(2)<223>Xaa是Ala，Val，Thr，Ile，或Leu<220>
<221>misc_feature<222>(3)<223>Xaa是Ser，或Phe<220>
<221>misc_feature<222>(4)<223>Xaa是Thr，Ile，Asn，Ser，Arg，或Tyr<220>
<221>misc_feature<222>(5)<223>Xaa是Arg，或Leu<220>
<221>misc_feature<222>(6)<223>Xaa是Ala，Gln，Glu，或Phe<220>
<221>misc_feature<222>(7)<223>Xaa是Thr，或Ser
<400>46Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa1 5<210>47<211>10<212>PRT<213>人工<220>
<223>抗-IL-18抗体CDR序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)<223>Xaa是Gln，或Met<220>
<221>misc_feature<222>(2)<223>Xaa是Gln，His，或Tyr<220>
<221>misc_feature<222>(3)<223>Xaa是Tyr，Asn，Gly，Ser，或Arg<220>
<221>misc_feature<222>(4)<223>Xaa是Asn，His，Tyr，Asp，Gly，Val，Leu，或Ile<220>
<221>misc_feature<222>(5)<223>Xaa是Asn，Gly，Ile，Tyr，Ser，Gln，Phe，或Glu
<220>
<221>misc_feature<222>(6)<223>Xaa是Trp，Ser，Thr，Leu，Ile，或Phe<220>
<221>misc_feature<222>(7)<223>Xaa是Pro，Leu，Thr，Asp，或Ile<220>
<221>misc_feature<222>(8)<223>Xaa是Ser，Leu，Pro，Cys，Trp，Ile，或Phe<220>
<221>misc_feature<222>(9)<223>Xaa是Ile，Thr，Ser，或不存在<220>
<221>misc_feature<222>(10)<223>Xaa是Thr，或不存在<400>47Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa1 5 10
权利要求
1.一种包括能结合人IL-18的抗原结合结构域的结合蛋白，所述抗原结合结构域包括至少一个包括选自下面的氨基酸序列的CDRCDR-H1.X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7(SEQ ID NO42)，其中X1是S，N，H，R，或Y；X2是Y，G，R，S，或C；X3是W，G，Y，D，S，V，或I；X4是I，H，W，Y，M，L，或D；X5是G，Y，S，N，或H；X6是W，或者不存在；和X7是T，S，G，或者不存在；CDR-H2.X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17(SEQ ID NO43)，其中；X1是F，Y，H，S，或V；X2是I，或F；X3是Y，S，或W；X4是P，Y，或S；X5是G，S，R，或D；X6是D，或G；X7是S，T，G，或R；X8是E，T，I，或N；X9是T，Y，N，I，K，或H；X10是R，Y，或S；X11是Y，N，或S；X12是S，P，A，或V；X13是P，S，或D；X14是T，L，或S；X15是F，K，或V；X16是Q，S，或K；和X17是G，或者不存在；CDR-H3.X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18(SEQ ID NO44)，其中；X1是V，D，E，S，或C；X2是G，R，D，S，K，L，Y，或A；X3是S，G，Y，或R；X4是G，S，Y，N，T，或D；X5是W，S，A，G，Y，或T；X6是Y，G，S，F，W，或N；X7是P，S，F，Y，V，G，W，或V；X8是Y，F，D，P，M，I，或N；X9是T，W，D，L，Y，E，P，F，或G；X10是F，D，Y，H，V，Y，或者不存在；X11是D，Y，F，L，或者不存在；X12是I，D，Y，或者不存在；X13是Y，或者不存在；X14是Y，或者不存在；X15是G，或者不存在；X16是M，或者不存在；X17是D，或者不存在；和X18是V，或者不存；CDR-L1.X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17(SEQ ID NO45)，其中；X1是R，或K；X2是A，G，或S；X3是S；X4是E，R，Q，或H；X5是S，I，T，或N；X6是I，V，L，或F；X7是S，G，L，N，或R；X8和S，G，Y，R，N，H，或D；X9是N，G，Y，R，或S；X10是L，Y，S，或D；X11是A，L，N，V，G，或D；X12是A，N，E，K，G，或者不存在；X13是K，T，N，或者不存在；X14是N，Y，T，或者不存在；X15是Y，L，或者不存在；X16是L，C，Y，或者不存在；和X17是A，D，或者不存在；CDR-L2.X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7(SEQID NO46)，其中X1是T，G，S，W，或E；X2是A，V，T，I，或L；X3是S，或F；X4是T，I，N，S，R，或Y；X5是R，或L；X6是A，Q，E，或F；和X7是T，或S；和CDR-L3.X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10(SEQ ID NO47)，其中X1是Q，或M；X2是Q，H，或Y；X3是Y，N，G，S，或R；X4是N，H，Y，D，G，V，L，或I；X5是N，G，I，Y，S，Q，F，或E；X6是W，S，T，L，I，或F；X7是P，L，T，D，或I；X8是S，L，P，C，W，I，或F；X9是I，T，S，或者不存在；和X10是T，或者不存在。
2.根据权利要求1的结合蛋白，其中所述至少一个CDR包括选自下面的氨基酸序列SEQ ID NO.6的残基31-35；SEQ ID NO.6的残基50-66；SEQ ID NO.6的残基99-110；SEQ ID NO.7的残基24-34；SEQ ID NO.7的残基50-56；SEQ ID NO.7的残基89-98；SEQ ID NO.8的残基31-37；SEQ ID NO.8的残基52-67；SEQ ID NO.8的残基100-110；SEQ ID NO.9的残基24-35；SEQ ID NO.9的残基21-27；SEQ ID NO.9的残基90-98；SEQ ID NO.10的残基31-35；SEQ ID NO.10的残基50-65；SEQ ID NO.10的残基98-107；SEQ ID NO.11的残基24-34；SEQ ID NO.11的残基50-56；SEQ ED NO.11的残基89-97；SEQ ED NO.12的残基31-37；SEQ ID NO.12的残基52-67；SEQ ID NO.12的残基100-108；SEQ ID NO.13的残基24-35；SEQ ID NO.13的残基51-57；SEQ ED NO.13的残基90-98；SEQ ID NO.14的残基31-35；SEQ ID NO.14的残基50-66；SEQ ID NO.14的残基99-111；SEQ ID NO.15的残基24-40；SEQ ID NO.15的残基56-62；SEQ ID NO.15的残基95-103；SEQ ID NO.16的残基31-37；SEQ ID NO.16的残基52-67；SEQ ID NO.16的残基100-109；SEQ ID NO.17的残基24-35；SEQ ID NO.17的残基51-57；SEQ ID NO.17的残基90-98；SEQ ID NO.18的残基31-35；SEQ ID NO.18的残基20-36；SEQ ID NO.18的残基99-108；SEQ ID NO.19的残基24-34；SEQ ID NO.19的残基50-56；SEQ ID NO.19的残基89-97；SEQ ID NO.20的残基31-35；SEQ ID NO.20的残基52-67；SEQ ID NO.2O的残基100-108；SEQ ID NO.21的残基24-35；SEQ ID NO.21的残基51-57；SEQ ID NO.21的残基90-98；SEQ ID NO.22的残基31-35；SEQ ID NO.22的残基50-66；SEQ ID NO.22的残基99-116；SEQ ID NO.23的残基24-39；SEQ ID NO.23的残基55-61；SEQ ID NO.23的残基94-102；SEQ ID NO.24的残基31-37；SEQ ID NO.24的残基52-67；SEQ ID NO.24的残基100-109；SEQ ID NO.25的残基24-35；SEQ ID NO.25的残基51-57；SEQ ID NO.25的残基90-98；SEQ ID N O.26的残基31-37；SEQ ID NO.26的残基52-67；SEQ ID NO.26的残基100-109；SEQ ID NO.27的残基24-35；SEQ ID NO.27的残基51-57；SEQ ID NO.27的残基90-98；SEQ ID NO.28的残基31-37；SEQ ID NO.28的残基52-67；SEQ ID NO.28的残基100-108；SEQ ID NO.29的残基24-35；SEQ ID NO.29的残基51-57；SEQ BD NO.29的残基90-98；SEQ ID NO.30的残基31-37；SEQ ID NO.30的残基52-67；SEQ ID NO.30的残基99-109；SEQ ID NO.31的残基24-35；SEQ ID NO.31的残基51-57；SEQ ID NO.31的残基90-98；SEQ ID NO.32的残基31-37；SEQ ID NO.32的残基52-67；SEQ ID NO.32的残基100-109；SEQ ID NO.33的残基24-35；SEQ ID NO.33的残基51-57；SEQ ID NO.33的残基90-98；SEQ ID NO.34的残基31-37；SEQ ID NO.34的残基52-67；SEQ ID NO.34的残基100-108；SEQ ID NO.35的残基24-35；SEQ ID NO.35的残基51-57；SEQ ID NO.35的残基90-98；SEQ ID NO.36的残基31-35；SEQ ID NO.36的残基50-66；SEQ ID NO.36的残基99-116；SEQ ID NO.37的残基24-39；SEQ ID NO.37的残基55-61；SEQ ID NO.37的残基94-102；SEQ ID NO.38的残基31-35；SEQ ID NO.38的残基50-66；SEQ ID NO.38的残基99-108；SEQ ID NO.39的残基24-35；SEQ ID NO.39的残基51-57；SEQ ID NO.39的残基90-98；SEQ ID NO.40的残基31-37；SEQ ID NO.40的残基52-67；SEQ ID NO.40的残基97-109；SEQ ID NO.41的残基24-40；SEQ ID NO.41的残基56-62；SEQ ID NO.41的残基95-103。
3.根据权利要求2的结合蛋白，其中所述结合蛋白包括至少3个CDRs。
4.根据权利要求2的结合蛋白，其中所述抗原结合结构域包括一个VH。
5.根据权利要求4的结合蛋白，其中所述VH包括选自下面的氨基酸序列SEQ ID NO6；SEQ ID NO8；SEQ ID NO10；SEQ ID NO12；SEQ ID NO14；SEQ ID NO16；SEQ ID NO18；SEQ ID NO20；SEQID NO22；SEQ ID NO24；SEQ ID NO26；SEQ ID NO28；SEQ IDNO30；SEQ ID NO32；SEQ ID NO34；SEQ ID NO36；SEQ ID NO38；和SEQ ID NO40。
6.根据权利要求2的结合蛋白，其中所述抗原结合结构域包括一个VL。
7.根据权利要求6的结合蛋白，其中所述VL包括选自下面的氨基酸序列SEQ ID NO7；SEQ ID NO9；SEQ ID NO11；SEQ ID NO13；SEQID NO15；SEQ ID NO17；SEQ ID NO19；SEQ ID NO21；SEQ IDNO23；SEQ ID NO25；SEQ ID NO27；SET M NO29；SEQ ID NO31；SEQ ID NO33；SEQ ID NO35；SEQ ID NO37；SEQ ID NO39；和SEQ ID NO41。
8.根据权利要求2的结合蛋白，其中所述抗原结合结构域包括一个VH和一个VL。
9.根据权利要求7的结合蛋白，进一步包括一个VH，其中所述VH包括选自下面的氨基酸序列SEQ ID NO6；SEQ ID NO8；SEQ ID NO10；SEQ ID NO12；SEQ ID NO14；SEQ ID NO16；SEQ ID NO18；SEQ ID NO20；SEQ ID NO22；SEQ ID NO24；SEQ ID NO26；SEQ ID NO28；SEQ ID NO30；SEQ ID NO32；SEQ ID NO34；SEQID NO36；SEQ ID NO38；和SEQ ID NO40。
10.根据权利要求8的结合蛋白，其中所述VL包括SEQ ID NO7的氨基酸序列，所述VH包括SEQ ID NO6的氨基酸序列。
11.根据权利要求2的结合蛋白，进一步包括选自IgM恒定区；人IgG1恒定区；人IgG2恒定区；人IgG3恒定区；人IgG4恒定区；人IgE恒定区和人IgA恒定区的重链免疫球蛋白恒定区。
12.根据权利要求11的结合蛋白，其中所述重链免疫球蛋白恒定区是人IgG1恒定区。
13.根据权利要求12的结合蛋白，其中所述人IgG1恒定区包括选自SEQ IDNO.2，和SEQ IDNO.3的氨基酸序列。
14.根据权利要求2的结合蛋白，进一步包括选自人Igκ恒定区，和人Igλ恒定区的轻链免疫球蛋白恒定区。
15.根据权利要求14的结合蛋白，其中所述轻链免疫球蛋白恒定区是人Igκ恒定区，包括氨基酸序列SEQ IDNO.4的氨基酸序列。
16.根据权利要求14的结合蛋白，其中所述轻链免疫球蛋白恒定区是包括SEQ IDNO.5的氨基酸序列的人Igλ恒定区。
17.根据权利要求2的结合蛋白，其中所述结合蛋白选自免疫球蛋白分子，scFv；单克隆抗体；人抗体；嵌合抗体；人源化抗体；单结构域抗体；Fab片段；Fab′片段；F(ab′)2；Fv；二硫键连接的Fv。
18.根据权利要求17的结合蛋白，其中所述结合蛋白是人抗体。
19.一种能结合人IL-18的结合蛋白，所述结合蛋白包括具有选自SEQ ID NO2和SEQ ID NO3的氨基酸序列的Ig重链恒定区；具有选自SEQ ID NO4，和SEQ ID NO5的氨基酸序列的IG轻链恒定区；具有SEQ ID NO6的氨基酸序列的Ig重链可变区；和具有SEQ ID NO7的氨基酸序列的Ig轻链可变区。
20.一种能结合人IL-18的结合蛋白，所述结合蛋白包括具有SEQ ID NO3的氨基酸序列的Ig重链恒定区；具有SEQ ID NO4的氨基酸序列的IG轻链恒定区；具有SEQ ID NO6的氨基酸序列的Ig重链可变区；和具有SEQ ID NO7的氨基酸序列的Ig轻链可变区。
21.一种中和结合蛋白，其中所述中和结合蛋白包括权利要求1-20任一项的结合蛋白，其中所述中和结合蛋白能中和IL-18。
22.根据权利要求21的中和结合蛋白，其中所述IL-18选自人IL-18原；成熟-人IL-18或截短的-人IL-18。
23.根据权利要求21的中和结合蛋白，其中所述中和结合蛋白减小了IL-18结合其受体的能力。
24.根据权利要求23的中和结合蛋白，其中所述中和结合蛋白减小了人IL-18原；成熟-人IL-18或截短的-人IL-18结合其受体的能力。
25.根据权利要求21的中和结合蛋白，其中所述中和结合蛋白能减小选自下面的IL-18生物活性中的一种或几种Th1调节；Th2调节；Nk调节；嗜中性白细胞调节；单核细胞-巨噬细胞系调节；嗜中性白细胞调节；嗜酸性细胞调节；B-细胞调节；细胞因子调节；趋化因子调节；粘着分子调节；和细胞募集调节。
26.根据权利要求21的中和结合蛋白，其中所述中和结合蛋白具有选自下面的解离常数(KD)最大大约10-7M；最大大约10-8M；最大大约10-9M；最大大约10-10M；最大大约10-11M；最大大约10-12M；和最大大约10-13M。
27.根据权利要求21的中和结合蛋白，其中所述中和结合蛋白具有选自下面的生成速率至少大约102M-1s-1；至少大约103M-1s-1；至少大约104M-1s-1；至少大约105M-1s-1；和至少大约106M-1s-1。
28.根据权利要求21的中和结合蛋白，其中所述中和结合蛋白具有选自下面的离解速率最大大约10-3s-1；最大大约10-4s-1；最大大约10-5s-1；和最大大约10-6s-1。
29.包括权利要求1-20任一项的结合蛋白的标记结合蛋白，其中所述结合蛋白与可检测标记物偶联。
30.权利要求29的标记结合蛋白，其中所述可检测标记物选自放射性标记物，酶，荧光标记物，发光标记物，生物发光标记物，磁性标记物和生物素。
31.权利要求30的标记结合蛋白，其中所述标记物是选自3H，14C，35S，99Y，99Tc，111In，125I，131I，177Lu，166Ho，和153Sm的放射性标记物。
32.包括权利要求1-20任一项的结合蛋白的偶联结合蛋白，其中所述结合蛋白与治疗性或细胞毒性物质偶联。
33.权利要求32的偶联结合蛋白，其中所述治疗性或细胞毒性物质选自抗-代谢物；烷基化试剂；抗生素；生长因子；细胞因子；抗-血管生成药物；抗-有丝分裂物质；蒽环霉素A；毒素；和编程性细胞死亡剂。
34.编码权利要求1-20任一项的结合蛋白氨基酸序列的分离的核酸。
35.包含权利要求34的分离的核酸的载体。
36.权利要求35的载体，其中所述载体选自pcDNA；pTT；pTT3；pEFBOS；pBV；pJV；和pBJ。
37.包含权利要求35或36任一项的载体的宿主细胞。
38.根据权利要求37的宿主细胞，其中所述宿主细胞是原核细胞。
39.根据权利要求38的宿主细胞，其中所述宿主细胞是大肠杆菌。
40.根据权利要求37的宿主细胞，其中所述宿主细胞是真核细胞。
41.根据权利要求40的宿主细胞，其中所述真核细胞选自原生生物细胞，动物细胞，植物细胞和真菌细胞。
42.根据权利要求41的宿主细胞，其中所述真核细胞是选自哺乳动物细胞，鸟类细胞，和昆虫细胞的动物细胞。
43.根据权利要求42的宿主细胞，其中所述动物细胞是CHO细胞。
44.根据权利要求42的宿主细胞，其中所述宿主细胞是COS。
45.根据权利要求41的宿主细胞，其中所述真核细胞是啤酒糖酵母。
46.根据权利要求42的宿主细胞，其中所述动物细胞是昆虫Sf9细胞。
47.结合人IL-18的结合蛋白的制备方法，包括在足以产生结合人IL-18的结合蛋白的条件下在培养基中培养权利要求37-46任一项的宿主细胞。
48.根据权利要求47的方法制备的结合蛋白。
49.包括根据权利要求1-28任一项的结合蛋白的结晶结合蛋白，其中所述结合蛋白以晶体存在。
50.权利要求49的结晶结合蛋白，其中所述晶体是没有载体的药学控制释放晶体。
51.权利要求49的结晶结合蛋白，其中所述结合蛋白具有比所述结合蛋白可溶性配对物更大的体内半存留期。
52.权利要求49的结晶结合蛋白，其中所述结合蛋白保留其生物活性。
53.一种用于释放结合蛋白的组合物，所述组合物含有(a)一种组合物，其中所述组合物含有根据权利要求49-52任一项的结晶结合蛋白，和一种成分；和(b)至少一种聚合物载体。
54.根据权利要求53的组合物，其中所述聚合物载体选自下面的一种或几种聚(丙烯酸)，聚(氰基丙烯酸酯)，聚(氨基酸)，聚(酸酐)，聚(缩肽)，聚(酯)，聚(乳酸)，聚(乳酸-共-羟基乙酸)或PLGA，聚(b-羟基丁酸)，聚(γ-己内酯)，聚(二氧六环酮)；聚(乙二醇)，聚((羟丙基)甲基丙烯酰胺，聚[(有机)磷腈]，聚(原酯)，聚(乙烯醇)，聚(乙烯吡咯烷酮)，马来酸酐-烷基乙烯基醚共聚物，多聚醇，白蛋白，藻酸盐，纤维素和纤维素衍生物，胶原，纤维蛋白，明胶，透明质酸，低聚糖，glycaminoglycans，硫酸多糖，它们的混合物和它们的共聚物。
55.根据权利要求53的组合物，其中所述成分选自白蛋白，蔗糖，海藻糖，乳糖醇，明胶，羟丙基-β-环糊精，甲氧基聚乙二醇和聚乙二醇。
56.对哺乳动物治疗的方法，包括对哺乳动物施用有效量的根据权利要求53的组合物的步骤。
57.一种感兴趣的基因的基因表达的调控方法，包括下面的步骤(a)提供IL-18调节剂；和(b)所述调节剂接触细胞，其中所述感兴趣的基因选自下面Genbank鉴定号确定的基因NM_000389，NM_002198，NM_002163，NM_006144，NM_006515，NM_007185，NM_002288，NM_003661，NM_021958，NM_001335，Hs.382006，NM_020125，NM_007210，NM_021798，NM_013324，M11313，D88152，NM_001103，U37519，NM_000697，J03600，NM_014578，S66793，U47054，L19871，M81181，NM_001188，U15460，NM_014417，Z23115，NM_001713，U45878，U37546，U72649，U49187，J03507，U50360，XM_071866，NM_005623，Z32765，Z11697，XM_071866，U51096，M83667，D87469，L07765，U66468，X14830，L29217，X15880，NM_001851，M27691，M37435，X13589，X16866，X59131，NM_004393，U73328，L19267，U53445，X68277，U48807，NM_001950，U87269，M57730，X52541，J04076，X63741，L07077，M62831，M60830，U53786，NM_001988，NM_000141，M23668，U60062，NM_000141，U49973，U89995，U27326，A28102，M25667，L34357，U19523，L01406，U03486，X68285，Z18859，D49958，D43772，AC000099，M57731，X53800，M91036，D16583，X64877，X58431，M16937，NM_014468，X92814，L19314，M26665，D10995，L41147，M24283，S81914，J03171，J00219，NM_000619，NM_000585，U31628，X04500，M27492，X01057，M26062，Y00081，Y00787，Z31695，X06256，X57206，U20734，NM_014879，D31762，D42038，NM_005551，NM_014846，X06182，NM_005551，X07730，M13955，M57710，S83362，NM_002314，NM_005569，U49957，U89922，X14008，U59914，D14497，X59727，NM_000429，U43944，X72755，NM_021230，NM_005951，X78710，X70991，M32011，S77763，M58603，S76638，M69043，U91616，D86425，L13740，U44848，U79251，M27288，AF000234，D50640，L20971，L10343，U77735，NM_003579，U17034，AB000584，X63131，D11428，NM_032940，NM_005035，NM_003579，M18255，L01087，D38128，Y10375，D15049，M31166，U59877，NM_003579，U64675，S57153，NM_002903，NG_000013，X75042，M83221，NM_000537，U22314，S59049，U70426，U22377，U38480，L10338，M23178，M69203，NM_005409，D79206，NM_005065，NM_004186，J03764，NM_006802，D89077，NM_003037，M91463，D82326，L05568，U96094，X83301，D21267，L31529，M62800，NM_021014，Z35093，NM_005816，L25444，M95787，NM_005421，L47345，M57732，NM_003205，M96956，U19878，M92357，M59465，X83490，U37518，NM_003294，U19261，U78798，S69790，U53476，L15309，U78722，X57809，U79249，AB000464，X77744，U79248，AI420129，HG2981-HT3127，HG3548-HT3749，HG870-HT870，HG4333-HT4603，HG3111-HT3287，HG4593-HT4998，HG961-HT961，HG1877-HT1917，HG3115-HT3291，HG4115-HT4385，和HG3925-HT4195。
58.根据权利要求57的方法，其中所述调节剂是拮抗剂。
59.根据权利要求57的方法，其中所述调节剂是IL-18。
60.根据权利要求57的方法，其中所述调节剂选自根据权利要求1-28任一项的结合蛋白。
61.含有权利要求1-28任一项的结合蛋白和药学可接受载体的药物组合物。
62.权利要求61的药物组合物，其进一步含有至少一种用于治疗其中IL-18活性是有害的疾病的另外的治疗药物。
63.权利要求62的药物组合物，其中所述另外的药物选自血管生成抑制剂；激酶抑制剂；共同-刺激分子阻断剂；粘着分子阻断剂；抗-细胞因子抗体或者其功能片段；甲氨喋呤；皮质类固醇；环孢菌素；雷帕霉素；FK506；和非甾类抗炎药物。
64.一种减小人IL-18活性的方法，包括使人IL-18接触权利要求1-28任一项的结合蛋白，使得人IL-18活性被减小。
65.一种对患有其中IL-18活性是有害的疾病的人患者减小人IL-18活性的方法，包括对人受治疗者施用权利要求1-28任一项的结合蛋白，使得人受治疗者中的人IL-18活性被减小。
66.一种对患有其中IL-18活性是有害的疾病或病症的受治疗者进行治疗的方法，包括对受治疗者施用权利要求1-28任一项的结合蛋白，完成治疗。
67.权利要求66的方法，其中所述疾病选自类风湿性关节炎，骨关节炎，幼年型慢性关节炎，莱姆关节炎，银屑病关节炎，反应性关节炎，和脓毒性关节炎，脊椎关节病，全身红斑狼疮，局限性回肠炎，溃疡性结肠炎，肠炎，胰岛素依赖性糖尿�。鬃聪傺祝涮从膊。Ｆぱⅲぱ子财げ。浦参锟顾拗鞑。鞴僖浦才乓欤毙曰蚵缘挠肫鞴僖浦蚕喙氐拿庖呒膊。庾戳霾。鲋嘌不バ匝苣蹋琄aw阿司匹林ki′s�。珿rave′s�。霾∽酆险鳎云＠妥酆险鳎琖egener′s肉芽肿�。琀enoch-Schoenlein紫癜，肾微结节性脉管炎，慢性活性肝炎，眼色素层炎，脓毒性休克，中毒休克综合征，脓毒症综合征，恶病质，传染�。杉纳嬉鸬募膊。筇烀庖呷毕葑酆险鳎毙院嵯蚬撬柩祝琀untington′s舞蹈�。两鹕。缋闲猿沾簦蟹纾⒏喂δ苷习鸬母斡不苎云堆裥灾琢觯脑嗨ソ撸募」Ｈ珹ddison′s�。⒎⑿裕琁型多腺缺乏和II型多腺缺乏，Schmidt′s综合征，成人(急性)呼吸抑制综合征，脱发，脱发斑，血清反应阴性关节�。亟诓。琑eiter′s�。Ｆぱ⒐亟诓。Ｑ裥越岢亟诓。ぱ祝戮笠吆蜕趁攀暇喙毓亟诓。棺倒亟诓。鲋嘌膊�/动脉硬化，特应性变态反应，自身免疫大疱�。俺Ｐ蕴祓宕湟缎蕴祓宕嗵祓宕咝訧gA�。陨砻庖呷苎云堆珻oombs阳性溶血性贫血，后天性恶性贫血，少年恶性贫血，肌痛性大脑炎/Royal Free�。哉衬てし裟钪榫。尴赴亟谘祝⒂不窝祝鹨虿幻髯陨砻庖吒窝祝筇煨悦庖呷毕莶∽酆险鳎筇煨悦庖呷毕菹喙丶膊。腋危危胀ǜ魇礁餮拿庖呷毕�(普通各式各样的血丙种球蛋白减少)，膨胀心肌�。圆辉兄ⅲ殉菜ソ撸绮殉菜ソ撸宋湫苑尾。鹨虿幻鞯南宋橹纬裳啦垩祝缀蠹渲史尾。渲示窒扌苑窝祝爰渲史尾∠喙氐牡藿嶙橹膊。敕尾∠喙氐幕旌系藿嶙橹膊。爰渲史尾∠喙氐娜碛不爰渲史尾∠喙氐睦喾缡怨亟谘祝敕尾∠喙氐娜砗彀呃谴敕尾∠喙氐钠し艏⊙�/多肌炎，与肺病相关的Sjogren′s�。敕尾∠喙氐慕┯布棺笛祝峤谛月龉苎酌稚⒎尾。敕尾∠喙氐暮扑爻磷挪。┪镆鸬募渲史尾。湎宋杖悦钢苎祝允人嵝苑窝祝馨拖赴笮苑尾。静『蠹渲史尾。捶绻亟谘祝陨砻庖吒窝祝�1-型自身免疫肝炎(典型自身免疫或狼疮样肝炎)，2-型自身免疫肝炎(抗-LKM抗体肝炎)，自身免疫介导的低血糖，B型胰岛素抗性微黑棘皮症，甲状旁腺机能减退，与器官移植相关的急性免疫疾病，与器官移植相关的慢性免疫疾�。枪亟谘祝⒂不ü苎祝�1型牛皮癣，2型牛皮癣，自发性白细胞减少，自身免疫中性白细胞减少，肾病NOS，肾小球肾炎，肾microscopicvasulitis，莱姆�。绦魏彀呃谴胤⑿阅行圆辉兄⒒騈OS，精液自身免疫性，多发性硬化(所有亚型)，交感神经眼炎，缔结组织疾病继发性高血压，Goodpasture′s综合征，结节性多动脉炎肺动，急性风湿性发烧，类风湿性脊椎炎，Still′s�。碛不琒jogren′s综合征，Takayasu′s病/动脉炎，自身免疫血小板减少，特发性血小板减少，自身免疫甲状腺�。鬃聪倩芸航鬃聪僦鬃陨砻庖呒鬃聪倩芸航�(Hashimoto′s病)，萎缩性自身免疫甲状腺机能亢进，原发性粘液水肿，晶体抗原性葡萄膜炎，原发性结节性脉管炎，白癜风，急性肝�。愿尾。凭愿斡不凭鸬母嗡鹕耍琧holeosatatis，特应性肝�。┪镆鸬母窝祝蔷凭灾拘愿窝祝溆π员涮从拖珺族链球菌(GBS)感染，精神病(例如，抑郁症和精神分裂症)，Th2型和Th1型介导的疾�。毙院吐蕴弁矗桶┲�。
68.一种对患有其中IL-18活性是有害的疾病的患者进行治疗的方法，包括在施用第二种药物之前，同时，或之后对患者施用权利要求1-28任一项的结合蛋白的步骤，其中所述第二种药物选自能结合人IL-12的抗体，或其片段；甲氨喋呤；能结合人TNF的抗体，或其片段；皮质类固醇；环孢菌素；雷帕霉素；FK506；和非甾类抗炎药物。
69.一种中和结合蛋白，其中所述中和结合蛋白能结合成熟-人IL-18，但是不特异性结合人IL-18原，并且其中所述中和结合蛋白选自人抗体；嵌合抗体；人源化抗体和CDR接枝抗体。
70.根据权利要求1的结合蛋白，其中所述结合蛋白能结合成熟-人IL-18，但是不特异性结合人IL-18原。
71.一种中和结合蛋白，其中所述中和结合蛋白能与125-2H抗体竞争结合人IL-18，并且其中所述中和结合蛋白选自人抗体；嵌合抗体；人源化抗体和CDR接枝抗体。
72.根据权利要求1的结合蛋白，其中所述结合蛋白能与125-2H抗体竞争结合人IL-18。
73.一种中和结合蛋白，其中所述中和结合蛋白不能与125-2H抗体竞争结合人IL-18，并且其中所述中和结合蛋白选自人抗体；嵌合抗体；人源化抗体和CDR接枝抗体。
74.根据权利要求1的结合蛋白，其中所述结合蛋白不能与125-2H抗体竞争结合人IL-18。
75.一种中和结合蛋白，其中所述中和结合蛋白不能与选自2.5(E)mg1抗体和IL-18BP的结合蛋白竞争结合人IL-18，并且其中所述中和结合蛋白选自人抗体；嵌合抗体；人源化抗体和CDR接枝抗体。
76.根据权利要求1的结合蛋白，其中所述结合蛋白不能与选自2.5(E)mg1抗体和IL-18BP的结合蛋白竞争结合人IL-18。
77.根据权利要求8的结合蛋白，其中所述VL包括SEQ ID NO9的氨基酸序列，和所述VH包括SEQ ID NO8的氨基酸序列。
78.一种能结合人IL-18的结合蛋白，所述结合蛋白包括具有选自SEQ ID NO2，和SEQ ID NO3的氨基酸序列的Ig重链恒定区；具有选自SEQ ID NO4，和SEQ ID NO5的氨基酸序列的IG轻链恒定区；具有SEQ ID NO8的氨基酸序列的Ig重链可变区；和具有SEQ ID NO9的氨基酸序列的Ig轻链可变区。
79.一种能结合人IL-18的结合蛋白，所述结合蛋白包括具有SEQ ID NO3的氨基酸序列的Ig重链恒定区；具有SEQ ID NO4的氨基酸序列的IG轻链恒定区；具有SEQ ID NO8的氨基酸序列的Ig重链可变区；和具有SEQ ID NO9的氨基酸序列的Ig轻链可变区。
全文摘要
本发明涉及IL－18结合蛋白，特别是结合人白介素－18(hIL－18)的抗体。具体地说，本发明涉及全人抗体的抗体。优选地，抗体具有体外和体内对于hIL－18的高亲和性和/或中和hIL－18的性质。本发明的抗体可以是全长抗体或者其抗原结合部分。还提供了本发明抗体的制备方法和使用方法。本发明的抗体或抗体部分用于对例如患有其中hIL－18活性是有害的疾病的人受治疗者检测hIL－18和用于抑制hIL－18活性。
文档编号G01N33/53GK1902229SQ200480039948
公开日2007年1月24日 申请日期2004年11月12日 优先权日2003年11月12日
发明者T·加于尔, B·拉布科夫斯基, J·W·沃斯, L·格林, J·巴布库克, X·-C·贾, J·韦勒, J·S·康, B·赫德伯格 申请人:艾博特公司
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