专利名称：高温环境下海水鱼类体表粘液功能蛋白检测方法
技术领域：
本发明属于比较蛋白组学技术，是一种检测高温环境下海水鱼类体表粘液功能蛋 白的方法。
背景技术：
鱼类体表粘液是机体防御外界病原微生物入侵的第一道保护屏障，而体表粘液中 含有的多种具有免疫功能的功能蛋白起着至关重要的作用，因此研究这些活性物质在高温 环境下的变化规律，确定与温度相关的生物指示蛋白，将是一种新的更快捷的耐温选育途径。本发明做出之前，Cristiane等(Analytical Biochemistry 2006)发表的 Optimization of sample preparation from skin mucus of a neotropical fish for two-dimensional substrate gel electrophoresis,曾报道了禾丨J用双向电泳技术可以建立 热带鱼Tambacu的体表粘液蛋白酶图谱，但并没有应用比较蛋白组学的技术确定与某些性 状相关的功會邑蛋白；Frederic Silvestre 等(Science of the Total Environment 2010) 发表的 A proteomic analysis of green and white sturgeon larvae exposed to heat stress and selenium,曾报道了利用双向电泳技术比较分析高温胁迫对鲟鱼幼仔组织蛋 白影响，但并没有将此技术应用于快速检测体表粘液的功能蛋白。综上所述，利用双向电泳 技术检测高温环境下海水鱼类体表粘液功能蛋白的方法，目前国内外尚未见有报道。
发明内容
本发明的目的是建立一套完整的检测高温环境对海水鱼类体表粘液功能蛋白影 响的方法体系，利用双向电泳技术构建出体表粘液蛋白酶图谱，通过图谱分析从中筛选出 与温度胁迫相关的功能蛋白，并结合个体高温耐受力情况，以期找到与温度胁迫相关的标 记蛋白，为后期功能蛋白的研究提供依据，以及今后与传统方法结合进行耐温选育工作奠 定基石出。本发明是按照以下操作技术方案完成的具体步骤是1、收集粘液；2、提取体表 粘液蛋白；3、对蛋白含量进行测定；4、采用双向电泳分离蛋白；5、蛋白图谱分析；6、差异蛋 白点切胶回收；7、质谱分析，确定功能蛋白。1.收集粘液是使用简便的无菌塑料吸管收集粘液。2.提取蛋白利用TCA/丙酮酸法提取海水鱼类体表粘液蛋白。3.蛋白含量测定按照Bradford蛋白浓度测定试剂盒操作说明测定。4.双向电泳分离蛋白(1)等点聚焦电泳(一向)选用pH4-7，17cm的线性胶条，样品最终稀释浓度为 1μ g/μ 1，上样量为 300μ 1 ；等电聚焦程序S1 Stp :300V, 2h ；S2 Stp :1000V, 2h ；S3 Grd 8000V, 2h ；S4 Stp :8000V, 2h ；S5 Grd :10000V, 3h ；S6 Stp :10000,1. 5h ;S7 Stp :500V，12h，
根据等电点不同分离蛋白。
(2)聚丙烯酰胺垂直电泳(二向)再次分离蛋白，其程序起始时2W/块胶，45min 后，将功率改为15W电泳4-5个小时根据重力原理进行分离；当溴酚蓝指示剂到达底部边缘 时停止电泳。(3)染色将PAGE胶放入银染液中银染30min，加入显色液显色2-5min，加10%的 冰醋酸溶液轻摇动终止染色，终反应即得到大菱鲆体表粘液蛋白酶图谱。5.蛋白图谱分析利用Imagemaster 2D Platinum 6. 0图像分析软件进行图像分 析，查找到差异显著的蛋白点。6.差异蛋白点切胶回收切割蛋白胶点，回收蛋白。7.质谱分析，确定功能蛋白进行MALDI-T0F-T0F质谱分析，采用PMF技术和 MASCOT、NCBI网站提供的检索工具进行鉴定；确定与温度相关的功能蛋白。本发明技术有以下特点(1)本发明可快捷的获得高温环境下，鱼类不同个体的体表粘液蛋白图谱，方法简 便，所得结果可直观的检测出体表粘液蛋白在温度胁迫下的变化趋势，可迅速筛选出与其 相关的功能蛋白，确定与温度相关的指示蛋白，从而进行辅助耐温选育研究。(2)本发明在收集粘液的方法上做了革新，目前鱼类体表粘液收集方法有两种，一 种是将鱼麻醉后放入装有无菌去离子水的灭菌袋中振荡，但该方法对鱼的伤害性较大，而 且采集的粘液不能长时间保存，蛋白降解较快；第二种是利用灭菌玻璃片刮取粘液，但收集 后分装比较困难，而本发明在收集粘液时用灭菌的塑料吸管，可以快速收集体表粘液，而且 分装简单，并能够将其保存在-80 °C中一年以上。(3)本发明在一向等电聚焦电泳程序中做了改进，由于海水鱼类体表粘液盐离 子比较多，在电泳过程中往往出现脱盐不彻底，造成图片不清晰，蛋白点有拖带现象，为后 期的分析造成困难；本发明中的等电聚焦程序采用延长低压时间，以及线性升至高压后增 加一个直线升压的过程，从而稳定电压，使蛋白点分离完全，聚焦彻底；即si Stp :300V, 2h ；S2 Stp :1000V, 2h ；S3 Grd :8000V, 2h ；S4 Stp :8000V, 2h ；S5 Grd :10000V, 3h ；S6 Stp 10000，1.5h ；S7 Stp :500V，12h，可以将盐离子除净，得到的蛋白点清晰，圆滑，从而更准确 的对差异蛋白点进行定位定量。(4)本发明所检测的功能蛋白——凝集素，其与温度的相关性属于首次确认。
图1 常温条件下大菱鲆体表粘液蛋白酶图谱；图2 高温胁迫下体表粘液蛋白酶图谱；图3 凝集素在不同温度下的蛋白表达差异性比较。
具体实施例方式下面通过实施例结合附图详细叙述本发明的检测方法。首先是TCA/丙酮发提取大菱鲆体表粘液蛋白；再利用粘液蛋白各等电点不同的 原理进行等点聚焦；然后丙烯酰胺配置电泳再次分离蛋白；染色脱色获得不同高温胁迫下 的蛋白图谱；利用Imagemaster 2D Platinum 6. 0图像分析软件进行图像分析，查找到差 异显著的蛋白点；进行MALDI-T0F-T0F质谱分析，采用PMF技术和MASCOT、NCBI网站提供的检索工具进行鉴定；得到与逆境胁迫相关的功能蛋白。具体方法是1.大菱鲆体表粘液收集；2.蛋白质提�。�3.蛋白定量测定；4、双向 电泳分离蛋白；5.蛋白图谱分析；6.差异蛋白点切胶回收；7.质谱分析，确定功能蛋白。1.大菱鲆体表粘液收集使用无菌塑料吸管将体表粘液收集入1. 5ml的离心管 中。2.蛋白质提取取Iml粘液加入4倍体积的10% TCA/丙酮(TCA 丙酮=1 10，含0. 07%巯基 乙醇，-20°C预冷30min)，-20°C静置过夜；4°C下15000 X g离心30min，弃上清；沉淀加入10 倍体积的丙酮溶液(含0. 07%巯基乙醇，-20°C预冷)，4°C下15000\8离心301^11，弃上清； 重复此步骤一次；将沉淀冷冻干燥，将适量裂解液加入干粉中，超声波破碎仪进行复溶。3.蛋白定量测定按照Bradford蛋白浓度测定试剂盒操作说明测定，最后利用0rigin5. 0软件绘制 标准曲线，根据标准曲线和测定的样品的吸光度回归计算蛋白浓度。4、双向电泳分离蛋白(1)等电聚焦电泳(一向)水化液定量样品，最终浓度约为Iyg/μ 1，上样量为 300 μ 1 ；把水化好的蛋白质溶液加入平衡盘中，胶条放入混合液中，浸泡胶条池后，加入矿 物油，泡涨时间为12-16h(25°C )。把胶条放入聚焦盘中；在聚焦盘的电极上各放一小块浸 湿的滤纸片，夹上电极板，加入矿物油，同时排除胶条下的气泡，接通电源，设定聚焦程序进 行聚焦(pH 4-7，17011胶条)51 Stp :300V,2h ；S2 Stp :1000V, 2h ；S3 Grd :8000V, 2h ；S4 Stp :8000V,2h ；S5 Grd :10000V,3h ；S6 Stp :10000,1. 5h ；S7 Stp :500V，12h。(2)聚丙烯酰胺垂直电泳(二向)聚丙烯酰胺配置电泳再次分离蛋白，将平衡的 胶条转移到垂直板电泳槽凝胶上(凝胶配方按常规SDS电泳配方)，加入电泳缓冲液后进行 电泳；程序起始时2W/块胶，45min后，将功率改为15W/块胶；电泳4_5个小时根据重力原 理进行分离，当溴酚蓝指示剂到达底部边缘时即可停止电泳。(3)染色a.固定凝胶取下后，用去离子水清洗胶面，然后加入固定液振荡至少 30min ；b.漂洗；弃去固定液后，凝胶用漂洗液清洗一次。弃去漂洗液，加入新鲜漂洗液， 振荡15min ；c.水化凝胶用去离子水清洗一次，弃去去离子水，再次加入去离子水水化 15-30min ；d.敏化用敏化液浸泡凝胶2. 5min ；去除背景；e.水洗凝胶用去离子水洗3 遍，每次20sec ；f.银染用银染液覆盖凝胶，轻微振荡30min ；g.水洗重复第5步；h.显 色加入新鲜配置的显色液，显色2-lOmin，注意观察染色状况，显色时间视蛋白量而定； i.洗胶迅速用去离子水漂洗凝胶20sec;j.终止迅速加入终止液，终止显色反应；k.水 洗一次。5.蛋白图谱分析染色完毕后，用凝胶图像扫描仪Imagekarmer采集图像(如图 1，图2所示)。使用Imagemaster 2D Platinum 6. 0对双向凝胶电泳图谱进行分析，分析内 容包括图像密度校正、找点、背景扣除、设置参比胶及图谱间的点匹配、标准化和差异点筛 �。〕�6个具有显著差异的蛋白点。6.差异蛋白点切胶回收切去蛋白胶点，回收蛋白。7.质谱分析，确定功能蛋白进行MALDI-T0F-T0F质谱分析，采用PMF技术和 MASC0T.NCBI网站提供的检索工具进行鉴定，确定与海水温度相关的功能蛋白，最终得到与温度相关的功能蛋白——凝集素，其与温度的相关性如图3所示。 经过后期重复性实验验证，证实了凝集素与海水温度的相关性，即凝集素其表达 含量猛烈增加时的海水温度为大菱鲆的致死温度点，因此，凝集素将可作为一种与海水温 度相关的指示蛋白，应用于海水鱼类在海水温度改变时机体处于致死温度临界点时的检 测，从而可进行辅助耐温选育的研究。
权利要求
1. 一种高温环境下海水鱼类体表粘液功能蛋白检测方法，它的方法步骤是收集粘 液；提取体表粘液蛋白；对蛋白含量进行测定；双向电泳分离蛋白；蛋白图谱分析；差异蛋 白点切胶回收；质谱分析，确定功能蛋白；其特征在于所述的收集粘液是使用简便的无菌塑料吸管收集粘液；所述的双向电泳分离蛋白其等电聚焦程序为:S1 Stp :300V, 2h ；S2 Stp :1000V, 2h ； S3 Grd :8000V, 2h ；S4 Stp :8000V, 2h ；S5 Grd :10000V, 3h ；S6 Stp : 10000，1. 5h ;S7 Stp 500V,12h ；所述的质谱分析进行MALDI-T0F-T0F质谱分析，采用PMF技术和MASC0T、NCBI网站提 供的检索工具进行鉴定，确定功能蛋白一一凝集素以及其与温度的相关性。
全文摘要
一种高温环境下海水鱼类体表粘液功能蛋白检测方法，首先收集鱼类体表粘液，其次粗提体表粘液蛋白；再利用双向电泳技术得到体表粘液蛋白图谱；之后再利用Imagemaster 2D Platinum 6.0图像分析软件进行图像分析，查找到差异显著的蛋白点；进行MALDI-TOF-TOF质谱分析，采用PMF技术和MASCOT、NCBI网站提供的检索工具进行鉴定，得到与高温胁迫相关的功能蛋白。本发明中采用简便的无菌塑料吸管收集粘液，快速、简便，并可快速分装，在-80℃下可保存一年以上；本发明中双向电泳等点聚焦电泳程序可将盐离子除净，得到的蛋白点清晰，圆滑，可以更加准确的对体表粘液功能蛋白定位定量。本发明适用于海水鱼类体表粘液蛋白在高温环境下的差异性表达、功能蛋白确定等检测技术。
文档编号G01N27/447GK102135524SQ20101060737
公开日2011年7月27日 申请日期2010年12月15日 优先权日2010年12月15日
发明者王新安, 马爱军, 黄智慧 申请人:中国水产科学研究院黄海水产研究所
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