专利名称：辅酶q-10及其二电子还原体的分析方法和分析系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及辅酶Q-IO及其二电子还原体的分析方法和分析系统。
背景技术：
辅酶Q(辅酶Q :CoQ)是苯醌衍生物，由于广泛存在于生物界，而被命名为泛醌。泛醌被二电子还原后的氢醌为泛醌醇。泛醌，其化合物名称为2，3_ 二甲氧基-5-甲基-6-聚异戊二烯基-1，4-苯醌，自然界中存在异戊二烯单元为n = 1 12的多种同族体，对于人等高等动物为η = 10。在以下的说明中，只要没有特别事先说明，将人等的泛醌表示为辅酶Q-10，同时将人等的泛醌醇表示为辅酶Q-IO的二电子还原体。据说，辅酶Q-IO的二电子还原体具有强抗氧化作用，具有防老化效果，可防止由活性氧引起的细胞损伤等。对于生物体，氧化应激是一种不好的状态，生物体内的氧化和抗氧化的平衡被破坏并倾向于氧化，而辅酶Q-IO及其二电子还原体的比率可以反映该氧化应激的程度，所以认为该比例能够形成氧化应激的良好标识。这样，由于获知辅酶Q-IO及其二电子还原体的举动是非常有用的，所以寻求能准确地分析这些成分的方法。作为分析方法，传统的分析方法有紫外吸收法等，但是这些方法容易受到第三物质的影响，需要繁杂的前处理。近年来，作为灵敏度高且能正确分析的方法，广泛使用高速液体色谱法(以下表示为HPLC)。辅酶Q-IO的检测中，利用275nm的紫外吸收。但是，以往的通过HPLC进行分析的方法要检测血浆中的辅酶Q-10，其灵敏度不充分。因而，提出了将辅酶Q-IO还原为二电子还原体，以还原前后的差作为辅酶Q-10， 进行定量的方法。但是，在该分析方法中需要进行检体的前处理，同时，需要2次向HPLC注入试样。因而，本申请人首先提出了如下方法(参照例如&itosi Yamasita and YorihiroYamamoto ANALYTICALBI0CHEMISTRY250，66-73 (1997))，如图 1 所示，在用反相分离柱(7 > 二社生产的LC-8)1分离出辅酶Q-IO和其二电子还原体之后，使用还原柱(资生堂生产的SHISEIDO CQ) 2或者电量检测电极将辅酶Q-IO还原为二电子还原体，再用电化学检测器3进行测定。另外，图1中，参照符号4表示流动相、参照符号5表示泵、参照符号 6表示试样注入器、参照符号7表示保护柱、参照符号8表示紫外吸收检测器。通过使用上述的分析方法，可以以高灵敏度同时测定辅酶Q-IO和其二电子还原体。得到的色谱图的一例示于图2中。图2中“1”为辅酶Q-IO的波峰，“2”为辅酶Q-IO的二电子还原体的波峰。此时，由于检体中的水溶性抗氧化物质例如维生素C和尿酸等影响测定，因而要进行前处理，用甲醇/己烷对检体进行萃取处理，使水溶性抗氧化物质分配在甲醇相中，使辅酶Q-IO等分配在己烷中。但是，对于上述用甲醇/己烷进行萃取处理的前处理方法，己烷萃取液中的辅酶 Q-IO化学性质不稳定，前处理后在将处理液注入HPLC进行分析之前的这段期间，如图3所示有相当比例的辅酶Q-IO的二电子还原体被氧化，因而检体萃取后需要快速进行分析。由于需要在刚要注入HPLC之前进行萃取操作以便正确进行分析，所以一起处理大量的检体是极困难的。另外，图3中各温度表示己烷萃取液的保管温度。
发明内容
本发明总的目的是提供可以解决上述现有技术的问题的辅酶Q-IO及其二电子还原体的分析方法和分析系统。本发明的更具体的目的是实现可以正确地对检体中的辅酶Q-IO及其二电子还原体的含量进行定量的分析方法和分析系统。为了实现该目的，本申请人进行了刻苦研究，结果发现使用异丙醇代替甲醇/己烷作为前处理中使用的萃取溶剂是更加适宜的，基于该认识完成以下发明。本发明涉及的辅酶Q-IO及其二电子还原体的分析方法，其特征在于，检体含有该辅酶Q-IO及其二电子还原体的至少之一，作为前处理，用水溶性有机溶剂萃取该检体，并将萃取液作为分析试样进行分析。此处，如前所述，辅酶Q-IO是指泛醌，辅酶Q-IO的二电子还原体是指泛醌醇。水溶性有机溶剂优选异丙醇，但是并不限于此，可以使用具有和异丙醇同等极性的溶剂，可以使用例如通过混合甲醇、乙醇、丁醇和正丙醇而调整了极性的混合溶剂等。另外，对前处理后的分析试样进行分析的方法，并不限于以下所说明的本发明的分析方法，也可以采用上述以往的分析方法等适宜的方法。根据本发明的上述构成，通过抑制在分析之前这段期间分析试样的的成分的变化，可以正确地进行分析。并且，不需要在萃取检体后立刻进行分析。此时，在分析上述萃取液之前这段期间，如果在该萃取液的熔点至室温范围内的温度、更优选在4°C前后的温度保管该萃取液，则可以更确实地抑制成分的变化，所以是优选的。此处，萃取液的熔点和用于萃取的水溶性有机溶剂的熔点实质上相同。此时，如果通过柱切换法浓缩该分析试样(萃取液)进行预处理，则即使在分析试样中辅酶Q-IO及其二电子还原体的浓度低的情况下，也可以正确地且以高灵敏度进行分析，所以是优选的。此时，如果将由含有该辅酶Q-IO及其二电子还原体两者的检体得到的萃取液作为分析试样，柱分离该辅酶Q-IO及其二电子还原体，进而进行还原处理，然后通过检测器进行检测，则不需要像以往那样向HPLC中2次注入分析试样，可以有效地进行分析，所以是优选的。另外，为了适宜地实现上述本发明的分析方法，本发明涉及的辅酶Q-IO及其二电子还原体的分析系统是在辅酶Q-IO及其二电子还原体的分析方法中使用的分析系统，其特征在于，其具有输液机构，其包括同时输送第1流动相和分析试样的第1系列以及仅输送第2流动相的第2系列；切换机构，其对该输液机构2个系列的流动相的输液路径进行切换；浓缩柱，其在接受该第1系列的流动相并浓缩该分析试样后，接受该第2流动相；分离柱，其接受从该浓缩柱送出的液体并进行分离；还原柱，其接受从该分离柱送出的液体并进行还原；电化学检测器，其对从该还原柱送出的液体进行检测处理。此时，如果还具有紫外吸收检测器作为检测器，则可以同时分析检体中的胆固醇等用电化学检测不能以高灵敏度检出的成分，所以是优选的。
本发明的其他目的、特征及优点，在参照附图的同时阅读以下的详细说明会更清林疋。图1是表示辅酶Q-IO及其二电子还原体的以往分析系统的简要构成的图；图2是用图1的分析系统得到的色谱图的一例；图3A是针对辅酶Q-IO的二电子还原体，表示保管图1分析系统的供试试样时成分随时间变化的曲线图；图:3B是针对辅酶Q-10，表示保管图1分析系统的供试试样时成分随时间变化的曲线图；图4是用于说明辅酶Q-IO及其二电子还原体的分析方法中的前处理工序的图；图5A是针对辅酶Q-IO及其二电子还原体的量，表示本实施例涉及的分析方法中对前处理后的萃取液进行保管时成分随时间变化的曲线图；图5B是针对辅酶Q-IO的摩尔分率，表示本实施例涉及的分析方法中对前处理后的萃取液保管时成分随时间变化的曲线图；图6是表示辅酶Q-IO及其二电子还原体的分析系统的简要构成图；图7是作为检体使用血浆时用图6的分析系统得到的光谱图的一例；图8是作为检体使用唾液时用图6的分析系统得到的光谱图的一例。
具体实施例方式接着，针对本发明涉及的辅酶Q-IO及其二电子还原体的分析方法和分析系统的优选的实施方式(以下称为方式例)参照附图进行说明。在以下说明的第1方式例中，使用人的血浆作为含有辅酶Q-IO及其二电子还原体的检体。另外，在第2方式例中，使用人的唾液作为含有辅酶Q-IO及其二电子还原体的检体。首先，针对第1方式例涉及的辅酶Q-IO及其二电子还原体的分析方法中的前处理，参照图4进行说明。取50 μ 1作为检体的人的血浆(图4中、S-1)，向其中加入950 μ 1异丙醇(图4 中、S-2)，并使其充分混合。接着，在离心机中于4°C的温度下、以12000rpm的旋转速度处理3分钟。由此，辅酶Q-IO及其二电子还原体被从检体萃取到异丙醇相(图4中、S-3)。随后，萃取辅酶Q-IO等而得到的萃取液，通过在4°C前后的温度进行保管(图4中、S-4)，如图5所示即使在至少11小时后辅酶Q-IO的二电子还原体也几乎没有受到氧化，可以防止保管中的分析试样的变质。另外，图5(b)中纵轴的辅酶Q-IO表示辅酶Q-IO 在辅酶Q-IO及其二电子还原体的总量中所占的比率(摩尔比)。根据以上说明的本实施方式涉及的第1方式例的前处理方法，能够在长期稳定的状态保管从检体中萃取辅酶Q-IO及其二电子还原体而得到的分析试样。并且，通过以该萃取液作为分析试样，可以正确地进行分析。另外，正因为如此，例如通过以萃取液作为分析试样放置到温度控制在4°C的自动取样器中，可以连续自动处理大量的检体。另外，4°C这样的温度是以生物体试样作为检体时通常的处理温度，通过将生物体试样保持在该温度，也可以避免其他成分变质。如果在远超过该温度的温度处理生物体试样，则不能避免以辅酶Q-IO的二电子还原体为代表的成分的变质，另一方面，冷冻保管生物体试样时，在分析时需要解冻生物体试样的工序，并且，也不能容易地实现应用了上述自动取样器等的连续自动处理。但是，本发明中所说的4°C前后这样的温度的意思是，只要该温度可以进行上述的生物体试样的处理，该温度包括高于4°C的温度和低于4°C的温度两种情况。即，萃取液的保管温度可以是萃取用的水溶性有机溶剂的熔点至常温的范围的温度。在第1方式例中，由于作为萃取用的水溶性有机溶剂使用异丙醇，因而保管温度的下限值为异丙醇的熔 ；89. 5 O 。接下来，针对以实施了上述前处理、保管了所需时间后的萃取液作为分析试样并用HPLC进行分析的方法，如下进行说明。首先，参照图6针对本实施方式涉及的分析方法中所使用的分析系统进行说明。 本实施方式涉及的分析系统10具有输液机构12、切换机构14、浓缩柱16、分离柱18、还原柱20、电化学检测器22和紫外吸收检测器24。输液机构12由第1和第2两个系列构成，各系列分别具有流动相的贮留容器25a， 25b、输送贮留容器25a，2 内的流动相的泵^a J6b。在第1系列中还具有试样注入器观。在第1系列的贮留容器25a中贮留含有50mM高氯酸钠的甲醇和水的混合溶液 (95%甲醇水溶液)作为流动相。另一方面，在第2系列的贮留容器25b中贮留含有50mM 高氯酸钠的甲醇和异丙醇的混合溶液(90%甲醇溶液)作为流动相。泵26a，26b均可以使用例如资生堂生产的惰性(4 f 一卜)泵3001。该惰性泵 3001是通过脉冲电动机控制的定流量、定压方式的双活塞泵，流量为1 μ 1/min 3000 μ 1/ min、输出压力上限为!35MPa。在第1系列中设置的试样注入器28是用于使第1系列的流动相同时携带分析试样的装置，其可以使用适宜的装置，但是优选使用自动取样器。在使用自动取样器作为试样注入器观时，可以使用例如资生堂生产的自动取样器3023。对于自动取样器3023，其试样注入量为0. 1μ 1 400μ 1 (可以0. 1μ 1单位进行控制)、试样处理数为100 200个，通过电子冷却可以将温度控制在4°C 20°C的范围内。切换机构14是用于切换输液机构12的2个系列的流动相的输液路径的装置。图 6中处于箭头Al的模式(以下称为模式Al)下，第1系列的流动相被输送到浓缩柱16，并且从浓缩柱16送出的已除去辅酶Q-IO等的液体被排出。另一方面，第2系列的流动相绕过浓缩柱16直接被输送到分离柱18。与之相对，处于箭头A2的模式(以下称为模式A2)下，第1系列的流动相被排出体系外不再向浓缩柱 16输液，同时，第2系列的流动相被输送到浓缩柱16，并且携带了被浓缩的分析试样的液体 (以第2流动相为主体的液体)从浓缩柱16被输送到分离柱18。这样，被浓缩的分析试样伴随着第2系列的流动相同时被输送到分离柱18。切换机构14例如由切换阀构成，作为这样的切换阀，可以使用例如资生堂生产的高压切换六方阀3011。高压切换六方阀3011为SUS6 口 2位阀，耐压为35MPa。另外，以该切换机构14中使用的配管为代表，在分析系统10中使用的配管的连接关系由图6可清楚获知，并且，为了防止吸附辅酶Q-IO及其二电子还原体，对于配管材料使用SUS。如已经说明的，浓缩柱16是利用例如填充剂的吸附作用等，用于浓缩分析试样的装置，可以使用例如^《> 二社生产的LC-8。分离柱18是用于分离从浓缩柱16输出的液体的装置，可以使用例如7《> -社生产的LC-8。还原柱20是用于还原从分离柱输出的液体的装置，具体来说，其是以将分析试样中的辅酶Q-IO转换成其二电子还原体为目的的柱。还原柱20例如可以使用资生堂生产的 SHISEIDO CQ0电化学检测器22是可以以电化学方式、高灵敏度地进行检测并用于分析辅酶 Q-IO的二电子还原体的装置，可以使用例如资生堂生产的电化学检测器3005。电化学检测器3005是三极恒电位电解装置的方式，能够以IOmV单位在士 1990mV的范围内数字设定加电压。紫外吸收检测器M是用于根据需要分析在作为分析试样的血浆中所包含的胆固醇等紫外线吸收灵敏度高的成分的装置。紫外线吸收检测器M可以使用例如资生堂生产的UV-VIS检测器3002。UV-VIS检测器3002是双束单一单元方式，波长范围是195nm 700nm。接着，对第1方式例所涉及的分析方法进行说明，该第1方式例使用了以上说明的本实施方式涉及的分析系统10。准备40 μ 1上述的前处理后的萃取液作为分析试样。在该40 μ 1分析试样中含有 20 μ 1的人的血浆。首先，使切换机构14处于模式Α2，用泵26b使贮留在贮留容器25b中的第2系列的流动相(90%甲醇溶液)流入浓缩柱16、分离柱18和还原柱20，使各柱稳定化。此时，根据需要也可以用模式Al向分离柱18和还原柱20输液。该柱的稳定化操作基本上进行1次就可以，随后，即使依次分析多个分析试样时也不需要每次都重复上述稳定化操作。但是，在柱切换法中，切换机构14的切换前后可以稳定地向各柱输送第2系列的流动相，从而以更稳定的状态进行处理。接着，用泵26a将贮留在贮留容器25a中的第1系列的流动相(95%甲醇水溶液) 输送至浓缩柱16，在途中要通过试样注入器观使其同时携带上述的分析试样。此时的流速为400μ1/π η，泵输出压力为IMPa。分析试样中的辅酶Q-IO及其二电子还原体等主要成分保留在浓缩柱16中。其他的液体排出到体系外。接着，向保留有上述主要成分的浓缩柱16中，用泵^b向浓缩柱16输送贮留在贮留容器25b中的第2系列的流动相(90%甲醇溶液)。此时的流速为800μ1/π η，泵输出压力为 10. IMPa0另外，这些操作如上所述那样通过切换机构14进行。在此，使用自动取样器作为试样注入器观，对保持在4°C的温度的分析试样连续地进行自动处理时，在没有向分离柱18以后的柱输送被浓缩的分析试样的期间，更为优选始终通过切换机构14向分离柱18以后的柱输送第2系列的流动相。此时的流速为800 μ 1/ min，泵输出压力为7. 6MPa。由此，同时携带有主要成分被浓缩的分析试样的液体依次被输送到分离柱18、还原柱20，以辅酶Q-IO及其二电子还原体为主体(分析对象成分)的分析试样中的主要成分被分离，进而以辅酶Q-IO为主的可被还原的成分被还原。在还原柱20中被处理的液体依次被输送到电化学检测器22和紫外吸收检测器对，进行检测处理。图7中表示使用人的血浆作为检体通过电化学检测器22得到的光谱图的一例。电化学检测器22的设定加电压为600mV。图7中箭头Ia表示辅酶Q-IO的二电子还原体(泛醌醇)的波峰，箭头加表示辅酶Q-IO (泛醌)的波峰。接着，针对第2方式例涉及的辅酶Q-IO及其二电子还原体的分析方法中的前处理进行说明。由于和上述的第1方式例仅检体不同(第1方式例中为人的血浆)，因而和第1 方式例的说明同样地使用图4进行说明。首先，取40 μ 1作为检体的人的唾液(图4中、S-1)，向其中加入950 μ 1异丙醇 (图4中、S-2)，并使其充分混合。接着，在离心机中于4°C的温度下、以12000rpm的旋转速度处理3分钟。由此，辅酶Q-IO及其二电子还原体被从检体萃取到异丙醇相(图4中、 S-3)。随后，在4°C前后的温度保管通过萃取辅酶Q-IO等而得到的萃取液(图4中、 S-4)。在该第2方式例中也和第1方式例同样可以防止保管中的分析试样的变质。因而， 通过本实施方式涉及的第2方式例，也能够以长期稳定的状态保管从检体中萃取辅酶Q-IO 及其二电子还原体而得到的分析试样。并且，通过以该萃取液作为分析试样，可以正确地进行分析。另外，对于其他条件等，由于和先前说明的第1方式例同样，因而省略其说明。接下来，针对以实施了上述前处理、保管了所需时间后的萃取液作为分析试样并用HPLC进行分析的方法，如下进行说明。本实施方式涉及的第2方式例中的分析方法也基本上和上述的第1方式例中的分析方法相同。因而，针对第2方式例中的分析方法简要地进行说明。另外，用于分析的HPLC和分析系统由于直接使用先前通过图6所说明的HPLC 和分析系统，因而省略其说明。准备40 μ 1上述的前处理后的萃取液作为分析试样。在该40 μ 1分析试样中含有 20 μ 1的人的唾液。首先，使切换机构14处于模式Α2，用泵26b使贮留在贮留容器25b中的第2系列的流动相(90%甲醇溶液)流入浓缩柱16、分离柱18和还原柱20，使各柱稳定化。此时，作为浓缩柱16可以使用直径2. OmmX长度35mm的Capcel Pack C18 AQ S5(商品名)。并且，作为分离柱18可以使用直径2. OmmX长度250mm的Capcel Pack C18 AQS5(商品名)。 进而，作为还原柱20可以使用直径2. OmmX长度20mm的SHISEID0CQ(商品名)。接着，用泵26a将贮留在贮留容器25a中的第1系列的流动相(95%甲醇水溶液)输送至浓缩柱16，在途中要通过试样注入器观使其同时携带上述的分析试样。此时的流速例如为200μ Ι/min。分析试样中的辅酶Q-IO及其二电子还原体等主要成分保留在浓缩柱 16中。其他的液体排出到体系外。接着，向保留有上述主要成分的浓缩柱16中，用泵^b向浓缩柱16输送贮留在贮留容器25b中的第2系列的流动相(90%甲醇溶液)。在此，使用自动取样器作为试样注入器观连续地向分离柱18供给保持在4°C的分析试样。由此，同时携带有主要成分被浓缩的分析试样的液体依次被输送到分离柱18、还原柱20，以辅酶Q-IO及其二电子还原体为主体(分析对象成分)的分析试样中的主要成分被分离，进而以辅酶Q-IO为主的可被还原的成分被还原。此时的流速例如为400μ 1/min。 在还原柱20中被处理的液体依次被输送到电化学检测器22和紫外吸收检测器M，进行检测处理。图8中表示使用人的唾液作为检体通过电化学检测器22得到的光谱图的一例。图 8中箭头3a表示辅酶Q-IO的波峰。根据以上说明的第1和第2方式例涉及的辅酶Q-IO及其二电子还原体的分析方法和分析系统，由于以从检体中萃取辅酶Q-IO及其二电子还原体而得到的萃取液作为分析试样，并对该分析试样浓缩后的物质进行分析，因而可以以高灵敏度正确地进行分析。并且，根据第1和第2方式例涉及的辅酶Q-IO及其二电子还原体的分析方法和分析系统，由于对辅酶Q-IO及其二电子还原体同时进行分析，而且理想地是连续且自动地处理大量的检体，因而可以有效地进行分析。进而，根据第2方式例涉及的辅酶Q-IO及其二电子还原体的分析方法和分析系统，使用唾液作为检体。由于唾液的采取和血液(血浆)的采取不同，是非侵袭式的，因而可以自己采�。梢匀菀椎丶觳獬鎏迥诟窺-IO及其二电子还原体的量。如上所述，根据本发明涉及的辅酶Q-IO及其二电子还原体的分析方法，由于用水溶性有机溶剂萃取含有辅酶Q-IO及其二电子还原体的至少之一的检体作为前处理，并将萃取液作为分析试样进行分析，因而可以正确地进行分析。并且，不需要在采取了检体后立刻进行分析。根据本发明涉及的辅酶Q-IO及其二电子还原体的分析方法，由于通过柱切换法浓缩分析试样，进行预处理，因而即使分析试样的辅酶Q-IO及其二电子还原体的浓度低的情况下，也可以正确且高灵敏度地进行分析。根据本发明涉及的辅酶Q-IO及其二电子还原体的分析方法，由于将由含有该辅酶Q-IO及其二电子还原体两者的检体得到的萃取液作为分析试样，柱分离该辅酶Q-IO及其二电子还原体，进而进行还原处理，然后通过检测器进行检测，因而可以有效地进行分析。另外，根据本发明涉及的辅酶Q-IO及其二电子还原体的分析系统，由于其具有 输液机构，其包括同时输送第1流动相和分析试样的第1系列以及仅输送第2流动相的第 2系列；切换机构，其对输液机构2个系列的流动相的输液路径进行切换；浓缩柱，其在接受第1系列的流动相并浓缩分析试样后，接受第2流动相；分离柱，其接受从浓缩柱送出的液体并进行分离；还原柱，其接受从分离柱送出的液体并进行还原；电化学检测器，其对从还原柱送出的液体进行检测处理。因而可以适宜地实现本发明的分析方法。
权利要求
1.使用分析装置对包含在检体中的辅酶Q-IO及其二电子还原体进行定量的分析方法，其特征在于，作为前处理，将含有该辅酶Q-IO及其二电子还原体两者的检体用水溶性有机溶剂萃�。⒔腿∫鹤魑治鍪匝蟹治觯渲校鏊苄杂谢芗潦且毂迹� 在分析所述萃取液之前的这段期间，在4°C前后的温度保管该萃取液， 所述分析装置是对辅酶Q-IO及其二电子还原体进行分析的分析装置，其具有 输液机构，其包括同时输送第1流动相和分析试样的第1系列以及仅输送第2流动相的第2系列，所述第1流动相是含有甲醇及水的溶液，所述第2流动相是含有甲醇及异丙醇的溶液；切换机构，其对所述输液机构输送的2个系列的流动相的输液路径进行切换； 浓缩柱，其在接受第1系列的流动相并浓缩该分析试样后，接受第2流动相； 分离柱，其接受从所述浓缩柱送出的液体并进行分离； 还原柱，其接受从所述分离柱送出的液体并进行还原； 电化学检测器，其对从所述还原柱送出的液体进行检测处理； 并且还具有SUS的配管。
2.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述分析装置作为检测器还有紫外吸收检测器。
全文摘要
本发明涉及可以正确地对检体中的辅酶Q-10及其二电子还原体的含量进行分析的分析方法和分析系统。作为前处理，将作为检体的人的血浆和异丙醇混合，使辅酶Q-10及其二电子还原体萃取到异丙醇中。分析之前的这段期间在4℃的温度保管萃取液。将萃取液作为分析试样，用具有输液机构、切换机构、浓缩柱、分离柱、还原柱、紫外吸收检测器和电化学检测器的分析系统进行分析。
文档编号G01N30/64GK102183598SQ201110038298
公开日2011年9月14日 申请日期2003年12月3日 优先权日2002年12月3日
发明者三田真史, 山本顺宽 申请人:株式会社资生堂
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