专利名称：用于识别改变内在膜蛋白表面表达的试剂的高通量测定系统和方法
技术领域：
本发明涉及用于识别改变哺乳动物细胞中如心脏离子通道这样的内在膜蛋白的表面表达水平的试剂的高通量测定系统和方法。本发明还涉及使用由这种方法识别的试剂的治疗方法。
背景技术：
A.测定人乙醚舞蹈样运动紊乱的相关基因(human-Ether-a-go-goRelated Gene)(hERG)是产生心脏再极化电流IKr的孔状钾通道亚基，并且由6个跨膜片段(S1-S6)和细胞质的氨基末端和羧基末端构成。已经将hERG与先天的和药物诱导的长QT综合征联系起来，这是一种严重的并且可能致命的心脏病。
hERG的突变产生功能缺损的通道和/或运输缺陷型通道，它们都减小IKr电流。在不同的长QT家族中由突变产生的大多数分子已经被识别。这表明hERG在心脏生理中扮演着重要角色。
大多数与长QT综合征(药物诱导的)相关的药物是hERG阻断剂。参见Vandenberg et al.，Trends Pharmacol.Sci.22240-246(2001)。由于在1996年将非镇静的抗组胺特非那定(Seldane)的心脏毒性与hERG阻断联系起来(参见Roy et al.，Crculation94817-823(1996))，包括抗心律失常药、抗生素、抗精神病药物以及抗组胺在内的具有不同结构的多种药物都显示出是有效的hERG阻断剂。
因此，hERG成为用于新的治疗药物的心脏安全测试的一个重要靶标。美国食品与药品管理局现在要求为新的治疗化合物寻求批准的制药公司要对这些药物进行筛选用以确认是否有潜在的hERG阻断作用。
目前，hERG心脏安全测试涉及电生理并且包括在稳定过表达hERG的HEK 293细胞中记录hERG电流的膜片钳(patch clamp)。然而，这种测定费用昂贵、耗时，并且需要相当的技能。因此，这项工作通常在药物研发过程的较晚阶段进行。不幸的是，在这时发现一种新的治疗化合物是有效的hERG阻断剂这将可能损害该化合物被批准并应用于治疗的前景。因此，制药企业对于更廉价、更快速并且可以在药物研发过程的早期使用的hERG阻断剂的测定相当感兴趣。
膜片钳测定的局限性导致了用于临床前筛选潜在的hERG作用药物的替代方法的出现。已经描述了几种方法，但是受限于如灵敏度、通量能力和/或假阳性率(参见Xu et al.，Drug Discovery Today61278-1287(2001))。
例如，一种类型的测定方法使用膜电位敏感性荧光染料，如DiBAC4或FMP。由于这些测定是测量膜电位的改变而没有hERG活性，因此假阳性的风险(即，改变膜电位但不阻断hERG的药物)很大。一个该测定方法的最新评估(Tang et al.，J. Biomol.Sceen.6325-331(2001))表明将假阳性和假阴性降到最小程度有很大问题。另外，灵敏度降低了约100倍。而且，用膜电位测定方法与膜片钳测量的hERG阻断剂效应的排序是不同的，这限制了不用提供作为其效应的有用信息而对潜在的hERG通道阻断剂识别的荧光测定法的使用。最后，在该测试方法中染料/药物的相互作用也引起了问题。
建议作为一种用于hERG相互作用的潜在的高通量临床前筛选方法的第二种测试方法，它是结合到用于hERG转染细胞的膜上的[3H]-多非利特(参见Finlayson et al.，Eur.J. Pharm 430147-148(2001))。这种结合测定是非功能性的，并且依赖于药物与[3H]-多非利特竞争结合于hERG通道的能力。但是，在早期试验中，通过膜片钳方法识别的hERG阻断剂的排序不能被[3H]-多非利特结合测定印证。同时，对于用作结合底物的纯化的细胞膜和放射性标记的多非利特的需要限制了这种测定方法的使用。
建议的第三种测定方法涉及测量表达hERG细胞的铷(Rb)的流量(参见Terstappen，Anal.Biochem.272149-155(1999))。这些细胞用Rb通道装载，并用高水平的钾激活，从而测定释放到培养基中的Rb。然而，通过这种方法得到的效应的排序与膜片钳数据不对应(参见Tang et al.，J. Biomol.Sceen.，6325-331(2001)。另外，通量受到限制并且灵敏度降低了10倍。
因此，仍然需要识别包括如hERG这样的心脏离子通道的内在膜蛋白阻断剂的测定系统。
B.心律失常药心房扑动和/或心房颤动(AF)是临床上最常见的心律失常，并且其流行主要在年长人群中增长。现在，AF每年影响超过1百万美国人，占所有心血管疾病的5％以上，并且每年在美国引起超过80,000起中风。而AF极少是致命性的心律失常，它主要导致顽固性疾病并且可能导致并发症，如充血性心力衰竭或血栓栓塞的发生。目前可以使用的I类和III类抗心律失常药物减少了AF再次出现的机率，但是由于包括心室致心律失常作用在内的各种潜在的副作用，其使用受到了限制。因为目前的治疗是不充分的并且具有副作用，因此显然需要开发新的治疗方法。
心室纤颤(VF)是与急性心肌梗塞、缺血性冠状动脉疾病和充血性心力衰竭相关的最常见的原因。同AF一样，目前的治疗也是不充分的并且需要开发新的治疗方法。
尽管现在在市场上有各种抗心律失常药物，但是具有满意疗效和高安全系数的药物还没有出现。例如，根据Vaughan-Williams分类体系的I类抗心律失常药物(“Classification of antiarrhythmicdrug”，Cardiac Arrhythmias，edited byE.Sandoe，E，Flensted-Jensen，K.Olesen；Sweden，Astra，Sodettalje，pp 449-472(1981))，其选择性抑制动作电位的上行支的最大速率(Vmax)，由于它们缩短了心脏动作电位的波长因而不能充分抑制心室纤颤，因此容易复发。另外，它们还有安全问题，即这些药物引起心肌收缩的衰减，并且具有由于搏动传导抑制而诱发心律失常的倾向。由于I类拮抗剂比对照安慰剂具有更高的死亡率，因此进行中的CAST(冠状动脉抑制测试)研究被中止。分别属于II类和IV类的β-肾上腺素受体阻断剂和钙通道(ICa)拮抗剂具有缺陷，由于在某些有心血管疾病的病人中它们有心脏抑制作用，因此它们的作用局限于特定类型的心律失常或不适于推荐。然而，它们的安全性比I类抗心律失常药物高。
III类抗心律失常药物引起动作电位时程(APD)的选择性延长，并且不对最大的上行支速率(Vmax)造成强烈抑制。因此，它们延长了提高不应可能的心肌动作电位的保留长度，从而阻止复发。可用的该类药物屈指可数。如甲磺胺心定和胺碘酮的实例已经显示出具有令人感兴趣的III类的性能(Singh B.N.，Vaughan Williams E.M.，“A third class of anti-arrhythmic actioneffects on atrial andventricular intracellular potentials and other pharmacological actions oncardiac muscle of MJ 1999and AH 3747”，Br.J.Pharmacol 39675-689(1970)，和Singh B.N.，Vaughan Williams E.M.，“The effectof amiodarone，a new anti-anginal drug，on cardiac muscle”，Br.J.Pharmacol 39657-667(1970))，但是这些不是选择性III类药物。
甲磺胺心定也具有II类(β-肾上腺素阻断)效应，它可以引起心力衰竭，并且在某些敏感病人中不建议使用。
胺碘酮也不是一种选择性III类抗心律失常药物，因为它具有多种电生理作用，并且由于副作用而受到严格限制(Nademanee，K.，“The Amiodarone Odyssey”，J.Am.Coll.Cardiol.201063-1065(1992))。预期这类药物在阻止心室纤颤方面有效。通过定义可知，选择性III类药物被认为是不能引起与I类抗心律失常药物类似的由于动作电位传导的抑制造成的心肌衰竭或引起心律失常。
III类药物通过延长心脏动作电位时程(APD)增加了心肌不应。理论上说，延长心脏动作电位可以通过增强内向电流(即Na+或Ca2+电流，在下文中分别称为INa和ICa)或通过减少外向再极化钾K+电流来实现。该延迟的校正(IK)K+电流是动作电位平台期与整个再极化过程相关的主要的外向电流，而瞬时外向(ITO)和内向校正(IKI)K+电流分别负责再极化的快速引发和中止阶段。
细胞电生理研究发现IK包括两个药理学和动力学不同的K+电流亚类，IKr(快速活化和失活)和IKs(慢速活化和失活)。(Sanguinettiand Jurkiewicz，“Two components of cardiac delayed rectifier K+current.Differential sensitivity to block by Class III anti-arrhythmicagent”，J Gen Physiol 96195-215(1990))。IKr也是人乙醚舞蹈样运动紊乱基因(hERG)的产物。细胞系中hERG cDNA的表达导致产生hERG电流，它们与IKr几乎相同(Curran et al.，“A molecular basisfor cardiac arrhythmiahERG mutations cause long QT syndrome，”Cell 80(5)795-803(1995))。
目前在开发的III类抗心律失常药物，如果不穷举的话主要包括右旋-索他洛尔、多非利特(UK-68，798)、阿莫兰特(H234/09)、E-4031和甲磺氨-N[1’-6-氰基-1，2，3，4-四氢-2-萘基]-3，4-二氢-4-羟螺[2H-1-苯并吡喃-2，4’-哌啶]-6基]，(+)-，一氯化物(MK-499)，它们阻断IKr。尽管胺碘酮是IKs的阻断剂(Balser J.R.Bennett，P.B.，Hondeghern，L.M.and Roden，D.M.“Suppression of time-dependentoutward current in guinea pig ventricular myocytesActions ofquinidine and aminodarone”，Cirt.Res.69519-529(1991))，它也阻断INa和ICa，影响甲状腺功能，也是一种非特异性的肾上腺素阻断剂，作为磷脂酶的抑制剂，并且引起肺纤维化(Nademanee，K.“TheAmiodarone Odessey”.J. Am.Coll.Cardiol.201063-1065(1992))。
已经发现折返激动(折返性)是造成人室上性心律失常的主要机制。折返激动需要在慢传导速率和足够短暂的不应期之间的一个重要平衡，从而保证多种折返电流的引发和保持，用以同时共存并且维持AF。通过延长的APD增加心肌不应，防止和/或中止了折返性心律失常。目前正在开发的III类抗心律失常药物，如果不穷举的话主要是右旋-索他洛尔和多非利特，它们更具选择性地阻断在人心房和心室中发现的IK的快速活化部分IKr。
因为这些IKr阻断剂增加心房和心室中的APD和不应，并且不影响传导本身，因此理论上讲，它们代表治疗如AF和VF这样的心律失常的潜在有用的药物。由于增加慢心律前心律失常的风险，因此这些药物具有缺陷。例如，当使用这些化合物时，可以观察到一种独特类型的多态性心室心动过速，torsade de pointes，它通常与心电图QT间隔的过分延长相关，因此被称为“获得性长QT综合征”(Roden，D.M.“Current status of Class III Antiarrhythmic DrugTherapy”，Am J.Cardiol，7244B-49B(1993))。这种慢心律时的突出作用被称为“逆频率依赖性”，并且与频率独立或频率依赖作用形成对比。(Hondeghem，L. M.，“Development of Class IIIAntiarrhythmic Agents”，J.Cardiovasc.Cardiol.20(Suppl.2)S17-S22)。当右旋-索他洛尔比对照的安慰剂具有更高的死亡率时，这种前心律失常趋势导致SWORD测试的中止。
延迟校正电流的慢速活化部分(IKs)潜在地克服了与心室心律失常相关的一些IKr阻断剂的限制。然而，因为其的慢速活化动力学，IKs在心房再极化中的作用可能是有限的，这是由于心房的APD相对短。因而，尽管IKs阻断剂可能对心室心律失常提供独特的好处，但是认为它们影响上心室心动过速(SVT)的能力是很小的。
大多数目前可用的III类抗心律失常药物的另一个主要的缺陷或局限是在心搏徐缓或慢心律时或期间，它们的作用增加或变得更加明显，并且这导致它们可能造成前心律失常。另一方面，在心动过速或预期和最需要这些药剂或药物的疾病状态时，它们失去了主要的疗效。在快心律时这种疗效的丧失或消失被称作“逆使用依赖性”(Hondeghem and Snyders，“Class III antiarrhythmic agents havea lot of potential but a long way to goReduced effectiveness anddangers of reverse use dependence”，Circulation，81686-690(1990)；Sadanaga et al.，“Clinical evaluation of the use-dependent QRSprolongation and the reverse use-dependent QT prolongation of class IIIanti-arrhythmic agents and their value in predicting efficacy”A mer.Heart Journal 126114-121(1993))，或“逆速率依赖性”(Bretano，“Rate dependence of class III actions in the heart”，Fundam.Clin.Pharmacol.751-59(1993)；Jurkiewicz and Sanguinetti，“Rate-dependent prolongation of cardiac action potentials by amethanesulfonanilide class III anti-arrhythmic agentSpecific block ofrapidly activating delayed rectifier K+current by dofetilide”，Circ.Res.7275-83(1993))。因此，具有使用依赖性或速率依赖性图形的药物与大多数现用的III类抗心律失常药物不同，它们不仅可以提供更高的安全性而且具有更好的疗效。
针对与目前III类抗心律失常药物相关的问题而言，需要一种对哺乳动物心律失常的有效治疗。
发明内容
相应地，本发明的一个目的是提供用于识别改变如心脏离子通道这样的内在膜蛋白的表面表达水平的药物的测定和方法。本发明的另一个目的是提供阻止或治疗心律失常的方法。
根据这些和其它的目的，本发明的第一具体实施方式
涉及一种用于识别改变哺乳动物细胞中内在膜蛋白的表面表达水平药物的方法，包括a)制备含有表达目的膜蛋白的第一突变型的哺乳动物细胞的第一培养液，其中该第一突变型在所述细胞表面的表达水平低于野生型；b)加入有效量的候选试剂；c)在活性试剂存在下孵育细胞足够的时间；d)加入有效量的至少一种抗体，该抗体与突变型的至少一个细胞外抗原决定部位结合；以及e)测定结合水平，其中所述结合水平的变化表明该候选试剂改变了所述表面表达的水平。
本发明的第二具体实施方式
涉及一种用于阻止或治疗心律失常的方法，包括向需要的哺乳动物给予有效量的活性试剂，该试剂增加哺乳动物细胞中hERG第一突变型的表面表达水平并且不增加通过如下方法测定的哺乳动物细胞中的hERG第二突变型的表面表达水平，包括a)制备含有表达hERG的第一突变型的哺乳动物细胞的第一培养液，其中它在细胞表面上的表达水平低于hERG的野生型；b)加入有效量的活性试剂；c)在活性试剂存在下孵育细胞足够时间；d)加入有效量的至少一种抗体，该抗体与hERG的该突变型的至少一个细胞外抗原决定部位结合；e)测定该抗体的结合水平；f)制备含有表达hERG的第二突变型的哺乳动物细胞的第二培养液，该突变型与第一突变型不同，并且在哺乳动物细胞表面的表达水平低于hERG的野生型；g)向该第二培养液中加入有效量的活性试剂；h)在活性试剂存在下孵育细胞足够的时间；i)加入有效量的至少一种抗体，该抗体与该第二突变型的至少一个细胞外抗原决定部位结合；以及j)测定该抗体的结合水平。
本发明另外的优点、目的和特性一部分将在后面的描述部分给出，而另一部分通过随后的举例或通过本发明实践的教导对于本领域普通人员将变得显而易见。在所附的权利要求中特别指出的本发明的这些目标和优点可以被认识和实现。
具体实施例方式
I.应用的测定和方法本发明的优选实施方式包括一种用于识别结合如膜离子通道这样的内在膜蛋白，并且由此增加或减少了哺乳动物细胞中的表面表达的试剂的测定系统和方法。在一些特定的优选实施例中，该测定和系统测定了试剂结合到内在膜蛋白突变型的特定位点的能力，并从而改变了其表面表达。这种表面表达的改变可以来自于试剂阻断的在相对于野生型膜蛋白活性位点的突变型上的一个位点和/或通过阻断细胞内运输和/或突变膜蛋白的加工。可选替换的，表面表达的改变可以来自于试剂改善了突变膜蛋白的细胞内运输。
适当的结合测定对于本领域技术人员有很多已知的和可行的形式。根据本发明的一些具体实施方式
，可以在适当的液体培养基中提供一种或多种表达膜蛋白的目的细胞，并且暴露于一种或多种待测化合物，而在另一个具体实施方式
中该细胞可以是固定在表面上的。类似地，根据本发明的其它具体实施方式
，一种或多种待测化合物可以被固定在表面上，并且暴露于含有一种或多种表达目的膜蛋白的细胞的液体培养基中，或者该待测化合物可以包括在合适的液体培养基中并向其中加入一种或多种表达目的膜蛋白的细胞。
在至少一种待测化合物和目的膜蛋白被标记的系统中的结合通�：苋菀准觳�(例如用荧光、放射性、酶、抗体等、或其组合，这对于本领域技术人员是已知的)。在将待测化合物暴露于表达膜蛋白的细胞并洗掉或除去未结合的试剂之后，测量存在的标记部分(即，结合于测试系统的未标记部分)。
各种用于进行结合测试的方法都是本领域已知的，包括但不限于如PCT申请US98/18368中所描述的那些测定系统。各种参考文献提供了用于蛋白结合测定的各种形式的一般描述，包括竞争结合测定和直接结合测定，(参见Stites and Terr，Basic and ClinicalImmunology，7thed.(1991)；Maggio，Enzyme Immunoassay，CRC Press，Boca Raton，FL(1980)；and Tijssen，Practice and TheoLy of EnzymeImmunoassays，in Laboratory Teelmiques in Biochemistry andMolecular Biology，Elsevier Science Publishers，B.V. Amsterdam，(1985))。
本发明特别优选的具体实施方式
涉及这样的测定系统和方法，其识别通过阻断膜蛋白活性和/或阻断其细胞内运输和/或其加工从而增加或减少目的膜蛋白的表面表达的化合物。
因此，根据一些特别优选的具体实施方式
，提供了免疫测定，其中一种或多种表达目的膜蛋白的细胞通常结合到适宜的固体支撑物上(例如微量滴定板的孔、微型卡、或对于本领域技术人员已知的任何其它类似的形式)并与候选试剂结合，从而观察目的膜蛋白的表面表达水平的变化。因此，在这些优选具体实施方式
中，一种或多种测定成分结合到固体表面。
在一些
具体实施例方式
中，一种测定系统可以用于(本领域已知的)检测由于候选试剂结合的膜蛋白表面表达的变化。例如，如果目的膜蛋白是膜离子通道，则可以使用膜片钳来测定检测离子通过膜的流量的变化，从而证明离子通道的表面表达水平的增加。
在另一可选的具体实施方式
中，使用一种间接免疫测定系统，其中在细胞表面上的膜蛋白通过加入一种或多种直接对抗膜蛋白的细胞外抗原决定部位的抗体来检测，如本领域所已知的。
当使用本发明的方法中的固体支撑物时，实际上任何固体表面都是适合的，只要该固体表面与测定试剂相容并能够将该成分结合到表面上而且不过度改变测定成分的反应性。本领域技术人员知道一些成分在固相测定中活性减少，但是只要活性足够进行检测和/或定量，这一般是可以接受的。
合适的固体支撑物包括但不限于材料或细胞可以黏附的任何固体表面，如玻璃珠、平板玻璃、可控孔玻璃、塑性多孔塑性金属、或树脂等。本领域技术人员知道在一些具体实施方式
中，在本发明的方法中使用的固体支撑物可以是由官能团衍生而来的(例如羟基、氨基、羰基、酯和巯基)，该官能团为连接部分(连接子)的结合提供反应部位或直接结合于候选试剂或其它测定成分。
将测定成分结合到固体支撑物上可以是直接的(即，该成分直接与固体表面接触)或间接的(即，试剂和/或成分(如抗体)结合到支撑物上，而其它测定成分结合到该试剂或成分上而不是结合到该固体支撑物上)。在一些具体实施方式
中，该试剂或成分是共价固定的(例如利用半胱氨酸单独的反应巯基基团固定蛋白质成分(参见Bioconjug.Chem.，4528-536(1993))，或非共价、但是特异性地(例如通过固定的抗体或其它特异性结合蛋白(参见Adv.Mater.，3388-391(1991)；Anal.Chem.，6783-87(1995)))，生物素/链霉抗生物素蛋白系统(参见如Biophys.Biochem.Res.Commun.，23076-80(1997))，或金属鳌合Langmuir-Blodgett膜(参见如Langmuir 114048-4055(1995)；Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，35317-320(1996)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 934937-4941(1996)；and J.Struct.Biol.，113117-123(1994))，和金属鳌合自组装单层(参见如Anal.Chem.，68490-497(1996))，用于聚组氨酸融合蛋白的结合。
在一些特别优选的具体实施方式
中，使用本领域普遍公知的标准的直接或间接ELISA、IFA或RIA方法来检测候选试剂与目的膜蛋白的结合。在一些具体实施方式
中，在样品中检测到膜蛋白的表面表达水平增加，而在另一些具体实施方式
中检测到表面表达水平的减少。因此，本发明的方法适合于检测、识别和表征多个要素。
相应地，在本发明方法的一些特别优选的具体实施方式
中，可以使用由用于捕获的单抗或多抗(“捕获抗体”)和用于检测抗体-抗原复合物(例如hERG结合到抗hERG抗体或hERG突变体结合到相应的抗体)结合的二抗(“报道抗体”)构成的夹层结构ELISA(酶联免疫吸收测定)。
在一些优选的ELISA具体实施方式
中，使用碱性磷酸酶结合的方法，而在另外一些优选的具体实施方式
中，使用辣根过氧化物酶结合的方法。此外，还使用抗生物素蛋白/生物素系统，尤其适用于信号增加的测定系统中。在优选具体实施方式
中，适宜使用的酶包括但不限于过氧化物酶、荧光素酶、碱性磷酸酶、葡糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、以及其两种或多种混合物。
因此，在本发明的一个例举的方法中，在阻断缓冲液中将适当稀释的100μl生物素化的抗体(例如直接对抗hERG或其突变体)加入到预涂的抗生物素蛋白的ELISA板的每个孔中(如可从Pierce商购的中性抗生物素蛋白(neutravidin)板)。2小时后，用清洗缓冲液清洗板子(如0.1％的TBS/Tween 20，含有或不含有阻断试剂)。通过加入阻断缓冲液可以抑制进一步的非特异性结合(如根据制造商的推荐加入300μl SuperBlock(Pierce)两次)。接着孵育一段时间以使生物素化的抗体与孔表面结合，之后根据本领域已知的方法清洗板子(如3次)，以除去孔板中任何未结合的抗体。
如标准样品和对照一样，表达目的膜蛋白的细胞样本可以用适当的缓冲液稀释，并加入到ELISA板的孔中。稀释的标准样、对照和样品可以加入到ELISA板的孔中(如100μl/孔)。标准样、对照和样品通常进行双孔检测。通常，在一个密闭保湿的容器或类似物中在5RPM的摇床或其它适当的振动装置上，将孔板孵育例如过夜或持续其它适当长的时间。用本领域已知的清洗缓冲液清洗孔板(如3次左右)。然后可以加入100μl的适当稀释的单抗或多抗报道抗体(优选用涂孔板的抗体预先吸收)，并且在室温下孵育优选过夜(如18-20小时)或其它适当的孵育时间。
可以再次清洗孔板，优选如上所述，并且可以加入在适当的阻断缓冲液中(如在TBS中的BSA阻断剂)适当稀释的如碱性磷酸酶结合的抗兔Ig(可由Pierce商购)这样的100μl酶标记的抗体，并且在摇床或如上所述的类似的搅动下孵育足够的时间(如2小时)。
然后该孔板可以优选用如上所述的方法再次清洗。可以将酶底物加入到孔中并使反应持续进行适当长的时间，最后用本领域已知的适当方法结束反应，并用本领域已知的方法测定孔中溶液的光密度。
因为背景信号通常是扩增测定的限制因素，因此在本发明的一些具体实施方式
中，可以通过采用减少这些测试中的背景信号的方法来进行测定。
除了使用固体支撑物的测定系统之外，本发明的还提供了将测定成分悬浮在溶液中的方法。
根据本发明的第一特别优选的具体实施方式
，提供了一种用于识别试剂的方法，该试剂如肽、蛋白、抗体或化学试剂改变哺乳动物细胞中如hERG这样的内在膜蛋白的表面表达水平。这种方法包括a)制备含有表达目的膜蛋白第一突变型的哺乳动物细胞的第一培养液，其中这种第一突变型在细胞表面的表达水平低于该蛋白的野性型；b)加入有效量的候选试剂；c)在候选试剂存在下孵育细胞足够的时间；d)加入有效量的至少一种抗体，该抗体与突变型的至少一个细胞外抗原决定部位结合；以及e)在将细胞用候选试剂孵育之后，测定抗体对蛋白的细胞外抗原决定部位的结合水平。
相对于对照，在候选试剂存在下结合水平的任何变化，如增加或减少，都表明候选试剂改变了膜蛋白的第一突变型的表面表达水平。
根据本发明的第二特别优选的具体实施方式
，上述方法进一步包括f)制备含有表达目的膜蛋白的第二突变型的哺乳动物细胞的第二培养液，其中该第二突变型与第一突变型不同，并且在所述哺乳动物细胞表面的表达水平低于该膜蛋白的野生型；g)加入有效量的候选试剂；h)在所述候选试剂存在下将所述细胞孵育足够的时间；i)加入有效量的至少一种抗体，该抗体与第二突变型的至少一个细胞外抗原决定部位结合；以及j)测定抗体与细胞外抗原决定部位的结合水平。与候选试剂孵育之后，结合水平的任何变化都表明候选试剂改变了目的膜蛋白的第二突变型的表面表达水平。
根据本发明优选的具体实施方式
，上述步骤(d)包括加入有效量的至少一种一抗和有效量的至少一种二抗。根据该具体实施方式
，该一抗优选结合到目的膜蛋白的第一突变型的至少一个细胞外抗原决定部位上。根据该具体实施方式
，更优选的是二抗结合到一抗上。
根据本发明的其它优选具体实施方式
，上述步骤(i)还包括加入有效量的至少一种一抗和有效量的至少一种二抗。根据这些具体实施方式
，该一抗优选与目的膜蛋白的第二突变型的至少一个细胞外抗原决定部位结合。根据这些具体实施方式
更优选的是二抗与一抗结合。
优选地，二抗偶联到酶上，以有利于检验和测定结合水平。在本发明的方法中，适合使用的酶是本领域技术人员已知的和可以得到的。合适的酶的例子包括但不限于过氧化物酶、荧光素酶、碱性磷酸酶、葡糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、以及其两种或多种混合物。
可以用本领域技术人员已知的和可行的任何方法和技术来测定目的内在膜蛋白的表面表达水平。优选通过荧光、发光、放射性、吸收、或其两种或多种的组合来测定结合水平。
根据本发明的一些特别优选的具体实施方式
，该内在膜蛋白是膜离子通道。适当的膜离子通道的示例性例子包括但不限于钠通道、钾通道、钙通道或氯通道。
根据本发明优选的具体实施方式
，抗体结合的膜蛋白的第一突变型的细胞外抗原决定部位优选与野生型抗原决定部位一样，即与在目的膜蛋白的天然存在形式上发现的细胞外抗原决定部位一样。不希望受到任何操作性或类似理论的限制，这样的安排可以潜在地减少由于蛋白质结构的不同而产生的错误，例如一种或多种蛋白功能性质的改变。
根据本发明其它优选的具体实施方式
，抗体结合的膜蛋白的第二突变型的细胞外抗原决定部位优选与野生型抗原决定部位一样。
根据本发明特别优选的具体实施方式
，在膜蛋白的第一和/或第二突变型上的该细胞外抗原决定部位含有一个标记物。适当的标记物是本领域技术人员已知的并且可以得到的。本发明方法中使用的一个特别优选的标记物是血凝素(HA)标记物。该标记物可以插入到膜蛋白的第一和/或第二突变型的细胞外结构域中、或者可以取代其一部分细胞外结构域。
根据本发明的方法，膜蛋白的第一和第二突变型优选与膜蛋白的野生型的氨基酸序列至少有一个氨基酸残基不同。而且，第一和第二突变型优选彼此的氨基酸序列至少也有一个氨基酸残基不同。
根据一些优选的具体实施方式
，膜蛋白的第一突变型可以是运输缺陷型突变体，并且其在哺乳动物细胞表面上的表达水平低于相应的野生型。根据其它优选的具体实施方式
，第二突变型可以是运输缺陷型突变体，而根据另外的优选具体实施方式
，第一和第二突变型可以都是运输缺陷型突变体。
根据本发明的某些特别优选的具体实施方式
，目的膜蛋白是心脏离子通道，更优选的是钾离子通道。这些离子通道对于本领域技术人员是已知的。这样的钾离子通道的一个例子是hERG。
本发明的方法中使用的适当的hERG第一突变型是本领域技术人员已知的。根据本发明的优选具体实施方式
，当在细胞表面表达时，这样的突变型应具有功能，但在细胞表面的表达水平应低于任意的野生型，更优选的是由于运输缺陷。适当的突变型的示例性例子包括但不限于G601S(其识别于长QT综合征家族中)和N470D。G601S是运输缺陷型，其产生很小的但动力学没有改变的电流的部分缺失性(hypomorphic)通道(参见Furatani et al.，Circulation 992290-2294(1999))而N470D是减效的错义突变体。增加如G601S和N470D这样突变体的表面表达的试剂也结合于hERG离子传导通路中的高亲和性位点，从而成为有效的hERG阻断剂。
出于举例说明的目的但不受此限制，在本发明优选的具体实施方式
中，在位于跨膜结构域S1和S2之间的连接部分上基因工程化如hERG-G601S这样的离子通道的突变型以表达如HA标记物这样的细胞外标记物(这样的标记物优选不改变通道的功能性质)。将稳定表达该标记物的突变体(如hERG-G601S-HA)的如HEK 293细胞的细胞铺于如96孔微量滴定板这样的适当的容器中，并且用一种或多种候选试剂孵育足够的时间，如过夜。然后细胞优选用如甲醛进行固定，但是优选不进行渗透并且加入识别HA标记物的抗体。使用优选结合到如辣根过氧化物酶这样的酶上的二抗与结合到固定细胞表面上的抗HA抗体结合。接着可以用如化学发光的反应混合物这些任何适当的方法得到细胞表面信号，并且在例如微量滴定板光度计中测定表达水平。对照细胞通常用水和/或其它用于与候选试剂结合的任意液态载体如DMSO孵育。增加第一突变型的表面表达的试剂是潜在的hERG(或类似的这种离子通道)的阻断剂。
在本发明的方法中使用的hERG的适当的第二突变型也是本领域技术人员已知的。根据本发明优选的具体实施方式
，表达在表面上的这种突变型的水平低于任意的野生型，更优选的是由于运输缺陷，但是当表达于细胞表面上时应当不具有功能。适当的hERG突变型的示例形例子包括但不限于G601S/F656C和N470D/F656C。不增加如G601S/F656C和N470D/F656C这样的突变体的表面表达的试剂是潜在的hERG阻断剂。
同样，出于举例说明的目的且不限于此的是，在本发明的优选具体实施方式
中，在跨膜结构域S1和S2之间的连接部分中基因工程化如hERG-G601S/F656C这样的离子通道的第二突变型，用以表达如HA标记物这样的细胞外标记物(同样，这样的标记物优选应当不改变通道的功能性质)。将稳定表达该标记的突变体(如hERG-G601S/F656C-HA)的(如HEK293细胞这样的)细胞铺于(如96孔微量滴定板这样的)适当的容器中，并且与候选试剂孵育足够的时间，优选为增加第一突变型的表面表达的候选试剂。将细胞优选接着进行固定并不进行渗透，并且加入识别HA标记物的一抗。将优选结合到酶上的二抗然后用于与结合到固定细胞表面的抗HA抗体结合。接着可以用如化学发光反应混合物这样的任意适当的方法得到细胞表面信号，并且在如微量滴定板光度计中测定表达水平。对照细胞通常用水和/或任意用于与候选试剂结合的液态载体，如DMSO进行孵育。那些不增加第二突变型的表面表达水平的试剂可能是有效的hERG阻断剂。增加第一突变型的表面表达水平而不增加第二突变型的表面表达水平的试剂更有可能是有效的hERG阻断剂。
根据上述方法的更特别优选的具体实施方式
，hERG表面表达通过从培养箱中移出微量滴定板并除去浸泡细胞的培养液来进行测量。用PBS(100μl)将孔漂洗三次接着用多聚甲醛(如4％在PBS中、pH为7.2、100μl)固定细胞，再用PBS漂洗。优选阻断在细胞表面上的非特异性结合位点，例如用在PBS中的1％羊血清(“阻断缓冲液”)孵育细胞。在除去阻断缓冲液之后，将细胞在阻断缓冲液中与例如鼠抗HA这样的一抗孵育。然后去除一抗，清洗细胞(如用阻断缓冲液清洗3次)。加入如在阻断缓冲液中的辣根过氧化物酶结合的抗鼠羊抗体这样的二抗。然后除去二抗，并且优选对细胞进行清洗。
根据该
具体实施例方式
，用任何适当的技术可以开发出化学发光信号，如SuperSignal ELISA Femto Maximum Sensitivity Substrate(Pierce Chemical Co.)。加入适量的试剂，如微量滴定板每孔50μl，并且用GloRunner luminometer(Turner Designs)获得数据。
可选地加入荧光反应用以监测每孔的细胞数量。
II.治疗组合物和方法本发明优选的具体实施方式
还是通过向需要其的哺乳动物(如需要其的人)给予有效量的用上述测定方法识别的试剂来阻止或治疗心律失常的方法。优选地，该阻止或治疗心律失常的发明的方法是通过向需要其的哺乳动物如需要其的人给予增加hERG的第一突变型的表面表达水平的有效量的试剂，如G601S或N470D。更优选地，该试剂不增加如G610S/F656C或N470D/F656C这样的hERG的第二突变型的表达水平。
本发明的优选具体实施方式
还包括用于在哺乳动物如人体内阻止或治疗心律失常的组合物，包括有效量的这样的试剂以及药学可接受的载体。
适用于本发明的治疗方法和组合物的特别优选的试剂的示例性例子是伐诺司林(也称作GBR-12909)。伐诺司林，其制造和/或其一些药物用途描述于美国专利第4,202,896号、第4,476,129号和第4,874,765号以及欧洲专利第243,903号和PCT国际专利申请第WO91/01732号。
伐诺司林的药学可接受的盐也可以用于本发明的方法中。可用于本发明的方法中的伐诺司林的药学可接受的盐包括但不限于由无毒性的无机酸或有机酸生成的伐诺司林的盐类。例如，药学可接受的盐包括但不限于如下的盐类由无机酸衍生的盐类，如盐酸、氢溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸、硝酸和类似物；由有机酸衍生的盐类，如乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、扑酸、马来酸、羟基马来酸、苯乙酸、安息香酸、水杨酸、对氨基苯磺酸、2-乙酸基-安息香酸、富马酸、甲苯磺酸、甲磺酸、乙烷二磺酸、草酸、羟乙磺酸、三氟乙酸和类似物；以及由氨基酸衍生的盐，如谷氨酸或天冬氨酸。参见美国专利第6,187,802号和WO91/01732。
在本发明的方法中，有用的伐诺司林的药学可接受的盐类可以通过常规的化学方法由伐诺司林合成。通常，通过离子交换层析法或在适当的溶剂或溶剂各种组合中通过将游离的碱与化学计量的或超量的形成盐所需的无机酸或有机酸进行反应来制备该盐。
当给予哺乳动物如人时，只要它们提供所需要的药物学反应和适宜于本发明方法中其它适当的用途时，如呈现可接受的毒理学特征，在使用条件下相对稳定等，伐诺司林的药学可接受的代谢物可以用于本发明的方法中。可以应用于本发明方法中的适宜的代谢物的示例性例子包括但不限于如下1-[2-(二苯基甲氧基)乙基]-4-(3-苯丙基)哌嗪(其也称作GBR 12935并且是伐诺司林在人体中主要的代谢物)和药学可接受的盐、类似物和其衍生物。
当给予哺乳动物如人时，只要它们具有所需的药物学反应，和适宜于本发明方法的其它适当的用途如呈现可以接受的毒理学特性，在使用条件下相对稳定等，伐诺司林的药学可接受的衍生物也可以用于本发明的方法中。用于本发明方法中的适宜的衍生物的示例性例子包括但不限于如下GBR13069和GBR12783，它们分别与伐诺司林和GBR12935的结构类似，除了3-苯丙基部分已经被3-苯丙烯-2-基部分取代。
其它适宜的衍生物包括伐诺司林的酚衍生物，即其中伐诺司林的未取代的苯基基团被一个或多个羟基以及其甲氧基同系物基团取代的伐诺司林的衍生物。(参见Rice et al.，“Oxygenated analoguesof 1-(2-(diphenylmethoxy)ethyl)-and 1-(2-(bis(4-fluorophenyl)methoxy)ethyl)-4-(3-phenylpropyl)piperazines(GBR 12935andGBR 12909)as Potential Extended-Action Cocaine-Abuse TherapeuticAgents，”J.Med.Chem.42(23)5029-5042(2001)；和Dutta et al.，“Positional Importance of the Nitrogen Atom in Novel PiperidineAnalogs of GBR 12909Affnity and Selectivity for the DopamineTransporter，”Med.Chem.Res.3(4)209-222(1993))。
可以用于本发明方法中的适宜的衍生物的另外的例子包括4-[2-双(卤苯基)甲氧基]-乙基]-α-(取代苯基)-1-哌嗪烷醇衍生物。参见如美国专利第4,476,129号。
当用于本方法时，可以用任何能够将药物活性试剂引入所需要的作用部位的方法，包括但不限于口腔、舌下、鼻、口、局部、直肠和胃肠外给药的方法，来给予伐诺司林、或药学上可接受的盐、衍生物或其代谢物。化合物的输送也可以利用皮下植入物或透皮贴剂这样的可控释放的剂型。
对于口服给药，含有伐诺司林、或药学上可接受的盐、衍生物或其代谢物的适宜组合物可以制成片剂、糖衣丸、胶囊、糖浆和水性或油性混悬剂的形式。用于制备这些组合物的惰性成分是本领域已知的。例如片剂可以通过将活性化合物在如马铃薯淀粉或微晶纤维素这样的崩解剂、和如硬脂酸镁或滑石粉这样的润滑剂存在下与如乳糖或磷酸钙这样的惰性稀释液混合来制备，然后用已知的方法将该混合物制成片剂。
片剂也可以用本领域已知的方法制成伐诺司林、或药学上可接受的盐、衍生物或其代谢物的持续释放剂型。如果需要，该片剂可以通过已知的方法提供肠衣，例如通过使用醋酸邻苯二甲酸纤维素。适当的粘合剂或成粒剂包括但不限于明胶、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮或糊精。滑石、胶态硅酸、硬脂酸甘油以及硬脂酸钙和硬脂酸镁或类似物可以用作抗粘剂及滑动剂。
片剂也可以通过湿法造粒及随后的压制法制备。含有伐诺司林、或药学上可接受的盐、衍生物或其代谢产物的混合物与至少一种稀释剂，以及可选的一部分崩解剂与粘合剂水、乙醇或水-乙醇溶液在适当的装置中一起成粒，然后将颗粒干燥。之后，向干燥的颗粒中混入其它的防腐剂、表面活性剂、分散剂、崩解剂、滑动剂和抗粘添加剂，并且将该混合物压制成片剂或胶囊。
片剂也可以通过将含有活性成分的混合物与所需的添加剂直接压制在一起来制备。如果需要该片剂可以通过加入制药工业中通常使用的如蔗糖、纤维素衍生物(甲基-或乙基纤维素或羧甲基纤维素钠)、聚乙烯吡咯烷酮、磷酸钙、碳酸钙、食品染料、香味剂、氧化铁色素和类似物的保护剂、调味剂和染色剂变为糖衣丸。
为了制备胶囊或囊片，将伐诺司林、或其药学上可接受的盐、衍生物或代谢物，以及所需的添加剂的混合物填充到如硬质或软质明胶的胶囊中。用已知的方法配制胶囊和/或囊片的内容物，从而得到持续释放的活性化合物。
液态口服剂型的伐诺司林、或其药学上可接受的盐、衍生物或代谢物，可以是酏剂、混悬剂和/或糖浆，其中将该化合物与无毒的悬浮剂混合。液态口服剂型也可以包括一种或多种甜味剂、调味剂、防腐剂和/或其混合物。
对于直肠给药，含有伐诺司林、或其药学上可接受的盐、衍生物或代谢物的合适的组合物可以制成栓剂形式。除了活性成分外，该栓剂可以含有药物生产中常用的栓剂物质，如可可豆油、甘油明胶或高分子量的聚乙二醇。
为了胃肠外给药，伐诺司林、或其药学上可接受的盐、衍生物或代谢物的合适的组合物可以制成注射液或混悬剂形式。对于活性成分可以溶于水性或非水性等渗灭菌注射液或混悬液中，如乙二醇醚、或可选地在如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸盐、单油酸盐或单硬脂酸盐这样的增溶剂存在下制备注射液或混悬剂。这些溶液或混悬剂可以由上文提到的在用于口服给药剂型中使用的含有一种或多种载体或稀释剂的灭菌粉末或颗粒制备。肠胃外给药可以通过静脉内、皮内、肌肉内或皮下注射。
含有伐诺司林、或其药学上可接受的盐、衍生物或代谢物的组合物也可以经鼻给药，例如通过喷雾、气溶胶、雾化溶液和/或粉末的形式。也可以使用本领域已知的计量的剂量系统。
伐诺司林、或其药学上可接受的盐、衍生物或代谢物的药物组合物也可以以这种给药方式将已知的药物形式给予口腔(例如舌下)，如缓慢溶解的片剂、口嚼剂、药片、糖锭剂、锭剂、凝胶、软膏、嗽口水、洗剂和/或粉剂。
用于局部给药的含有伐诺司林、或其药学上可接受的盐、衍生物或代谢物的组合物可以包括一种基质，其中药物活性化合物被分散到该基质中从而保持与皮肤接触以便透皮给予该化合物。合适的透皮组合物可以通过将伐诺司林、或其药学上可接受的盐、衍生物或代谢物与局部用载体如矿物油、矿脂和/或蜡，例如石蜡或蜂蜡，以及潜在的透皮促进剂，如二甲基亚砜或丙二醇一起混合来制备。另外一种可替换的方法是，可以将伐诺司林、或其药学上可接受的盐、衍生物或代谢物分散到药学可接受的乳剂或油膏基底中。包含在局部用剂型中的伐诺司林、或其药学上可接受的盐、衍生物或代谢物的量应当是在皮上使用的局部用配方的时间段内递送的有效治疗量。
伐诺司林、或其药学上可接受的盐、衍生物或代谢物也可以通过外源的连续灌输如通过静脉内灌输或通过置于体内的化合物源来给药。内源包括植入的伐诺司林、或其药学上可接受的盐、衍生物或代谢物的储库，为了例如通过渗透能够连续释放的灌输，该植入物可以是(a)该化合物的药学上可接受的油的形式如混悬剂或溶液这样的液体，例如以非常少量的水溶性衍生物如十二烷酸盐的形式灌输，或(b)用于灌输化合物的植入载体形式的固体，例如合成树脂或蜡质材料。该载体可以是含有所有化合物的单体或一系列的几个个体，其每一个含有部分待递送的化合物。在内源中存在的伐诺司林、或其药学上可接受的盐、衍生物或代谢物的量应当是保证在长时间内递送有效治疗量的量。
另外，伐诺司林、或其药学上可接受的盐、衍生物或代谢物的注射液可以含有各种添加剂如防腐剂，如苯甲醇、4-羟基安息香酸甲基或丙基酯、苯扎氯铵、硼酸苯汞及类似物；以及抗氧化剂，如抗坏血酸、生育酚、焦硫酸钠和可选的络合物形成试剂，如用于结合痕量金属的乙二胺四乙酸盐，以及用于调节pH值的缓冲液和可选的局部麻醉剂，如利多卡因。含有伐诺司林、或其药学上可接受的盐、衍生物或代谢物的注射液在装入安瓿前要过滤，而注入后要灭菌。
用于本发明的这样的治疗方法的其它试剂包括任意已知的hERG阻断剂，如阿司咪唑、特非那丁、E-4031、西沙必利、氯喹和类似物。
实施例实施例1-用阿司咪唑援救hERG-G601S表面表达将稳定表达hERG-G601S-HA的HEK-293细胞置于带有透明底的BIOCOAT聚-D-赖氨酸细胞培养皿(cellware)的96孔黑色平板中(BD Discovery Labware)。将细胞铺于(8×104细胞/孔)含有10％FBS加上青霉素-链霉素和遗传霉素(geneticin)(G418；0.5mg/ml)的DMEM/F12的完全培养液中，加药前在37℃/5％CO2下孵育8小时。制备药物(阿司咪唑、去甲阿司咪唑、非索非那定)的储液(200μM、1mM和5mM)。就加入前在含有10％FBS的DMEM/F 12中制备工作稀释液(200nM、1μM和5μM)。载体由在含有10％FBS的DMEM/F12中的0.1％DMSO构成。除去浸泡细胞的培养液，并且用含有药物或载体的对照培养液(100μl/孔)替代。对于每一种药物每个浓度有3个测试孔和3个对照孔。在表面表达的测试开始之前，将孔板在37℃/5％CO2下孵育过夜(约16小时)。
在室温下，在工作台上进行表面表达测定。将细胞用100μl的PBS清洗3次，随后用新制备的冰冷的溶于PBS的4％多聚甲醛(pH为7.2、100μl、20min)固定。去除固定液，并用100μl的PBS清洗细胞。通过在PBS中与1％的羊血清(阻断缓冲液、100μl持续30min)孵育阻断了细胞表面上的非特异性结合位点。除去阻断缓冲液并用在阻断缓冲液中稀释的鼠抗HA(1∶500稀释、100μl，Roche)孵育细胞3小时。移去一抗之后，用1％的羊血清PBS溶液(100μl和10min/洗)清洗细胞3次。将HRP-结合的羊抗鼠抗体(1∶2000；Jackson Labs)用阻断缓冲液稀释并且与细胞孵育1小时(100ul/孔)。在孵育后，将细胞用100μl的1％羊血清PBS溶液清洗(10min)，然后用100μl的PBS(10min/洗)清洗3次。
用SuperSignal ELISA Femto Maximum Sensitivity Substrate(Pierce Chemical Co.)测定化学发光信号。从孔中除去PBS并且用每孔100μl的检测试剂取代。用GloRunner luminometer(TurnerDesigns)立即捕获信号。
得到的数据显示药物援救hERG-G601S-HA表面表达的能力与其阻断hERG的能力直接相关。因此，阿司咪唑比更弱的阻断剂去甲阿司咪唑更多地增加了表面表达。类似地，根本不阻断hERG的非索非那定不增加hERG-G601S-HA的表面表达。
实施例2-去除在hERG中结合位点的药物去除用阿司咪唑的救援将在35mm培养皿中的HEK-293细胞用编码hERG-G601S-HA或hERG-G601S/F656C-HA的cDNA短暂转染。在转染24小时之后在一些平板中加入阿司咪唑(1μM)，而另一些平板中加入载体对照(DMSO)，将这些平板孵育过夜。
在孵育后，将细胞用多聚甲醛固定，并且如上所述加工用于表面表达的HA标记物(除了成比例的增大试剂体积)。用TD20/20光度计(Turner Biosystems)测量化学发光信号。
得到的数据显示阿司咪唑不能援救双突变体hERG-G601S/F656C的表达，但是确实可以援救hERG-G601S的表达，表明它是一个有效的hERG阻断剂。
现在已经完全描述了本发明，对于本领域普通技术人员很容易理解本发明的方法可以用于更宽泛和等同范围内的病症、剂型和其它参数而不背离本发明的保护范围或其任何具体实施方式
。
在本文中所引用的所有专利和出版物以引用的方式将其全部内容合并于本文中。任何出版物的引用是因其披露先于本申请提交日，并不应当认为承认这些出版物是本发明的现有技术或本发明不享有凭借已有发明的公开所具有的更早的申请日。
权利要求
1.一种识别改变哺乳动物细胞中内在膜蛋白的表面表达水平的试剂的方法，所述方法包括a)制备含有表达所述膜蛋白的哺乳动物细胞的第一培养液；b)向含有哺乳动物细胞的所述第一培养液中加入有效量的候选试剂；c)在存在所述候选试剂的情况下将所述细胞孵育足够的时间；d)向所述含有哺乳动物细胞的第一培养液中加入有效量的至少一种抗体，所述抗体与所述膜蛋白的至少一个细胞外抗原决定部位结合；以及e)在用所述候选试剂孵育后，测定所述至少一种抗体对所述细胞外抗原决定部位的结合水平，其中所述结合水平相对于对照的变化表明所述候选试剂改变了所述膜蛋白的表面表达水平。
2.根据权利要求40的方法，进一步包括如下步骤f)制备含有表达所述膜蛋白的第二突变型的哺乳动物细胞的第二培养液，所述第二突变型与所述第一突变型不同，并且在所述哺乳动物细胞表面的表达水平低于所述膜蛋白的野生型；g)向所述含有哺乳动物细胞的第二培养液中加入有效量的所述候选试剂；h)在存在所述候选试剂的情况下，将所述细胞孵育足够的时间；i)向所述含有哺乳动物细胞的第二培养液中加入有效量的至少一种抗体，所述抗体结合于所述膜蛋白的第二突变型的至少一个细胞外抗原决定部位；以及j)在用所述候选试剂孵育后，测定所述至少一个抗体与所述膜蛋白的所述第二突变型的细胞外抗原决定部位的结合水平，其中所述结合水平相对于对照的变化表明所述候选试剂改变了所述膜蛋白的第二突变型的表面表达水平。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤(d)包括加入有效量的至少一种一抗和有效量的至少一种二抗，其中，所述一抗结合于所述膜蛋白的第一突变型的至少一个细胞外抗原决定部位，而所述二抗结合于所述一抗。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述结合水平是通过荧光、发光、放射性、吸光度或它们两种或多种的结合测定的。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述内在膜蛋白是一种膜离子通道。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述膜离子通道是钠通道、钾通道、钙通道或氯通道。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述至少一个细胞外抗原决定部位包括野生型抗原决定部位。
8.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述至少一个细胞外抗原决定部位包括标记物。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述细胞外标记物取代所述内在膜蛋白的至少一部分的细胞外结构域。
10.根据权利要求8所述的方法，其中所述细胞外标记物插入到所述膜蛋白的细胞外结构域中。
11.根据权利要求8所述的方法，其中所述细胞外标记物包括血凝素(HA)标记物。
12.根据权利要求3所述的方法，其中所述一抗和/或所述二抗偶联到一种酶上。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述酶选自由过氧化物酶、荧光素酶、碱性磷酸酶、葡糖氧化酶、β-半乳糖苷酶以及其两种或多种混合物构成的组。
14.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述第一突变型包括一个与所述膜蛋白的野生型氨基酸序列至少有一个氨基酸残基不同的氨基酸序列。
15.根据权利要求2所述的方法，其中所述第二突变型包括一个与所述膜蛋白的野生型氨基酸序列至少有一个氨基酸残基不同的氨基酸序列。
16.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述第一突变型是一运输缺陷型突变体。
17.根据权利要求2所述的方法，其中所述第二突变型是一运输缺陷型突变体。
18.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述膜蛋白是一种钾离子通道。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述钾离子通道是hERG。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述hERG的第一突变型是G601S。
21.根据权利要求19所述的方法，其中所述hERG的第一突变型是N470D。
22.根据权利要求19所述的方法，其中所述hERG的第二突变型是G601S/F656C。
23.根据权利要求19所述的方法，其中所述hERG的第二突变型是N470D/F656C。
24.一种用于阻止或治疗心律失常的方法，包括向需要的哺乳动物给予有效量的活性试剂，其中所述活性试剂当用如下方法测定时提高哺乳细胞中hERG的第一突变型的表面表达水平，而不提高哺乳动物细胞中hERG的第二突变型的表面表达水平a)制备含有表达hERG的所述第一突变型的哺乳动物细胞的第一培养液，其中所述第一突变型以低于hERG野生型的水平表达于所述哺乳动物细胞的表面；b)向所述第一培养液中加入有效量的所述活性试剂；c)在所述活性试剂存在下，将所述细胞孵育足够的时间；和d)向所述含有哺乳动物细胞的第一培养液中加入有效量的至少一种抗体，该抗体与hERG的所述突变型的至少一个细胞外抗原决定部位结合，e)测定所述至少一种抗体与所述细胞外抗原决定部位的结合水平，f)制备含有表达hERG的第二突变型的哺乳动物细胞的第二培养液，其中所述第二突变型与所述第一突变型不同，并且在所述哺乳动物细胞表面的表达水平低于hERG的野生型；g)向所述含有哺乳动物细胞的第二培养液中加入有效量的所述活性试剂；h)在存在所述活性试剂的情况下，将所述细胞孵育足够的时间；i)向含有哺乳动物细胞的所述第二培养液中加入有效量的至少一种抗体，该抗体与hERG的所述第二突变型的至少一个细胞外抗原决定部位结合；以及j)测定所述至少一种抗体对hERG的所述第二突变型的所述细胞外抗原决定部位的结合水平。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述活性试剂是伐诺司林或其药学可接受的盐。
26.根据权利要求24所述的方法，其中步骤d)包括加入有效量的至少一种一抗和有效的量至少一种二抗，其中所述一抗与hERG的所述第一突变型的至少一个细胞外抗原决定部位结合，并且所述二抗与所述一抗结合。
27.根据权利要求24所述的方法，其中所述结合水平是通过荧光、发光、放射性、吸光度或它们两种或多种的结合测定的。
28.根据权利要求24所述的方法，其中所述至少一个细胞外抗原决定部位含有一个标记物。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述细胞外标记物取代了hERG的至少一部分细胞外结构域。
30.根据权利要求28所述的方法，其中所述细胞外标记物插入到hERG的细胞外结构域中。
31.根据权利要求28所述的方法，其中所述细胞外标记物包括血凝素(HA)标记物。
32.根据权利要求26所述的方法，其中所述一抗和/或所述二抗偶联到一种酶上。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述酶选自由过氧化物酶、荧光素酶、碱性磷酸酶、葡糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、以及其两种或多种混合物构成的组。
34.根据权利要求24所述的方法，其中所述第一突变型是一运输缺陷型突变体。
35.根据权利要求24所述的方法，其中hERG的所述第一突变型是G601S。
36.根据权利要求24所述的方法，其中hERG的所述第一突变型是N470D。
37.根据权利要求24所述的方法，其中hERG的所述第二突变型是G601S/F656C。
38.根据权利要求24所述的方法，其中hERG的所述第二突变型是N470D/F656C。
39.根据权利要求24所述的方法，其中步骤i)包括加入有效量的至少一种一抗和有效量的至少一种二抗，其中所述一抗与hERG的所述第二突变型的至少一个细胞外抗原决定部位结合，并且所述二抗与所述一抗结合。
40.根据权利要求1所述的方法，其中所述膜蛋白是一突变型，该突变型在所述细胞表面的表达水平低于所述蛋白的野生型。
全文摘要
本发明披露了用于识别改变哺乳动物细胞中如心脏离子通道这样的内在膜蛋白的表面表达水平的试剂的高通量测定系统和方法。本发明还披露了使用由该方法识别的试剂的治疗方法。
文档编号G01N33/53GK1878553SQ200480026304
公开日2006年12月13日 申请日期2004年7月15日 优先权日2003年7月15日
发明者阿瑟·M·布朗, �？斯隆し瓶硕�, 芭芭拉·A·威布尔 申请人:钱克斯普瑞斯公司
专业数控铣床产品供应商
20年生产经验，实力工厂，精工品质，质量有保障
