专利名称：对照组合物及其用于凝结实验的方法
技术领域：
本发明涉及用于校准凝结实验的对照组合物、方法、设备和试剂盒。
背景技术：
已经开发了各种血液和血浆凝结实验来诊断凝结病症、监控患者的抗凝结治疗、筛选患者在手术前的凝结能力以及其它用途。这种实验包括例如凝血酶原时间(PT)、部分组织促凝血酶原激酶时间(PTT)、活化部分组织促凝血酶原激酶时间(APTT)、凝血酶凝血时间(TCT)、活化凝血时间(ACT)、血纤维蛋白原分析以及其它实验。
凝血酶原时间或PT实验是最常用的凝结实验，通常用于监控正在接受使用药物例如Warfarin或Coumadin进行的口服抗凝结治疗的患者。当与组织促凝血酶原激酶混合时，PT通过检测患者的再次钙化的血浆或毛细管血液的凝固能力来评价外源凝血途径因子。对患者的精确监控要求使药物剂量有规律并避免大量流血或再次出现凝血。凝血酶原时间分析通常包括将患者的血样暴露于组织促凝血酶原激酶，然后监控血液或血浆凝胶或凝固所需的时间。组织促凝血酶原激酶可以存在于能与血液混合的液体试剂中，或可以是在已涂有血液的试条上的化学预干燥的形式，或以其它实验形式排列。凝固的发展是组织促凝血酶原激酶反应的开始，开始的时间可以通过光学、电子、粘度变化或其它技术来检测。
PT实验结果的不均一性导致对患者的剂量控制问题。长期以来已经认识到PT的变化是一个严重的问题，世界健康组织(WHO)已经发展了建立PT实验的均一性的标准。国际敏感指数(ISI)是对于不同组织促凝血酶原激酶对口服抗凝结剂的响应的校准因子(L.Poller，“The Prothrombin Time”，WHO 1998)。ISI值取决于单个PT实验对参比制剂例如WHO国际参比制剂(IRP)的校正。对于每组商业PT实验必须测定ISI以提供对实验体系不均一性的补偿。
用不同凝结实验得到的凝血酶原时间可以通过计算比较，称为国际标准化比率(INR)。INR提供对于PT检测中体系与体系之间的变化的补偿，通过用PT时间除以限定正常主体人群的平均正常凝血酶原时间(MNPT)来计算，得到ISI。对于相同的样品，不同类型的PT实验可以产生不同的PT结果，但是对于不同实验的INR值应该是可比的。ISI是INR计算的一部分，以校正PT实验体系的灵敏性方面的差异。ISI得自参考PT值对由20个正常(非抗凝结的)主体与60个稳定的正在进行长期口服给予抗凝结治疗的患者得到的检测的PT值的log校准曲线的斜率。MNPT值通常通过计算在ISI检测中所用的20个正常主体得到的PT检测值的几何平均值而获得。
通过WHO建议的方式对凝结实验的校正是比较复杂且昂贵的程序。每组商业PT实验的校准需要从一组至少80个供体用宽范围的INR得到毛细管血液样品。因为陈旧的血液样品不能在PT实验中使用，所以新鲜血液样品必须从每组新的商业PT实验的供体得到。以此方式获得血液样品是昂贵的，需要获得很多患者同意抽血来评价每组商业PT实验。
曾经有人尝试克服上述困难，使用可从商业得到的“校准”血浆，其得自正常的和抗凝结血液供体库，可以冰冻储存。通常需要5-7个不同水平或种类的校准标准，这取决于待校准的特定实验。但是，许多凝结实验是基于在试条中血液凝结的光学检测，这允许使用“刺手指”血液样品在非临床装置中对各患者进行快速和容易的PT实验。这种凝结实验不能有效地检测单独在血浆中的凝结，所以对作为凝结实验的控制标准的校准血浆的有效性受到限制。
因此需要校准和对照组合物和用于凝结实验的简单价廉的方法，该方法不需要大的血液或血浆供体库，并可以使用光学检测系统。本发明满足这些和其它要求，并通�？朔吮尘凹际踔械牟蛔�。
发明内容
本发明提供了用于校准凝结实验的对照组合物、方法、设备和试剂盒。本发明的对照组合物一般包括能在血浆中聚集的颗�：透评胱�。该组合物可以另外含有血浆。血浆可以含有来自已知的抗凝结人血供体库的柠檬酸盐化校准血浆、来自稀释或消耗库存正常血浆的柠檬酸盐化对照血浆或其它血浆。所述颗�？梢院芯酆衔镏榱＃谄浔砻嫔暇哂卸喔龃绾傻幕牛怯胙写嬖诘牡鞍字式蟹翘囟ǖ慕岷�。钙离子可以是Ca++离子溶液的形式，例如卤化钙溶液或其它可溶性钙盐的溶液。在特定的实施方案中，所述组合物可以含有能在柠檬酸盐化血浆中聚集的颗粒的溶液或悬浮液，能与所述颗粒悬浮液组合的钙离子溶液，和能与所述组合的钙离子溶液和颗粒悬浮液混合的柠檬酸盐化血浆。
本发明的组合物可以进一步含有一种或多种光学对比增强剂以促进血浆凝结的光学检测。光学对比增强剂可以含有一种或多种粒状颜料和/或一种或多种可溶性染料。光学对比增强剂可以溶解和/或悬浮于钙离子的溶液中。所述颗粒或聚合物珠粒还可以含有用于增强对比的染料或颜料。本发明的组合物可以进一步含有血红蛋白以促进在血浆中颗粒的聚集。所述对照组合物的各种组分可以在使用之前分开储存以使其储存期最大化。所述组合物可以另外含有防冻剂以利于所述组合物或其组分的低温储存。
本发明的方法一般包括提供钙离子和能在血浆中聚集的颗粒，使钙离子和颗粒与血浆组合以形成一种对照组合物，将所述对照组合物施用或引入到至少一个凝结实验中。所述方法可以进一步包括监控所述对照组合物的凝结。所述方法可以另外包括测定所述对照组合物的凝结时间与至少一种与对照组合物中所用血浆相关的全血样的凝结时间之间的关系。该方法可以进一步包括测定由凝结实验获得的对照组合物的凝结时间与使用参比实验得到的凝结时间之间的关系。该方法还可以进一步包括测定校准曲线或者确定对凝结实验的校准。在特定的实施方案中，该方法包括提供含钙离子的第一对照组分，提供含能在血浆中聚集的颗粒的第二对照组分，将第一和第二对照组分组合在一起，将血浆加入组合的对照组分中以形成对照组合物，将所述对照组合物施用或引入到至少一个凝结实验样品中，并监控所述对照组合物的凝结。
本发明还提供用于储存本发明对照组合物的各组分的设备或装置。所述设备一般包括具有至少两个室的容器，其中一个室装有能在血浆中聚集的颗粒，另一个室装有钙离子的溶液。所述室的结构使得在这两个室中的内容物不能在进行校准实验之前混合。所述室可以通过一个或多个可移动的或易碎的隔断(barrier)来限定，所述隔断可以移动或破裂以使室的内容物在使用之前混合。所述颗�？梢院性谄浔砻嫔暇哂写绾苫诺木酆衔镏榱５娜芤骸８评胱尤芤嚎梢园然迫芤海⒖梢园庋Ф员仍銮考晾缫恢只蚨嘀秩玖虾脱斓鞍鬃魑榱＞奂銮考�。所述容器可以含有额外的室，其装有能与其它两室的内容物混合的血浆。
本发明的试剂盒可以含有一种对照组合物，其包括钙离子的容器、能在血浆中聚集的颗粒的容器、和校准血浆的容器。所述试剂盒可以进一步包括一种或多种凝结实验设备例如PT试条。所述试剂盒可以另外包括用于检测凝结实验设备的凝结时间的读数计。所述试剂盒还可以包括印刷的说明书，关于将对照组合物与校准血浆混合，将对照组合物和血浆施用到凝结实验设备上，和检测凝结时间。钙离子、血液血浆和/或能在血浆中聚集的颗粒的容器可以在单个容器中的各室中实现。
附图简述将通过参考以下附图而更全面地理解本发明，这些附图仅仅用于说明目的。
图1是根据本发明的一个对照组合物设备的实施方案的示意图。
图2是根据本发明的对照组合物设备的另一个实施方案的示意图。
发明详述在进一步描述本发明之前，应该理解的是本发明不限于下述的本发明的特定实施方案，因为在所附权利要求的范围内可以改变特定实施方案。还应该理解的是所用的术语是用于描述特定的实施方案，而不是要限制本发明。而本发明的范围将由所附的权利要求确定。
这里描述了用于校准凝结实验的组合物、方法、设备和试剂盒。本发明使用能在血浆中聚集的颗粒的悬浮液和钙离子的溶液以形成一种基质(matrix)，当该基质与血浆组合时，提供一种对照组合物，它在被施用或引入到凝结实验体系例如试条中时能模拟全血的作用。所述对照组合物的组合颗粒、钙离子溶液和血浆当用于凝结实验中时模拟相应的全血的凝结行为，其中从该全血得到对照组合物的血浆。所述对照组合物因此提供对凝结实验的快速且容易的校准，并可以对凝结实验的商业组进行质量控制。
本发明主要使用PT实验描述，特别是光学可读数的PT试条体系。但是，本发明可以用于对任何类型的血液或血浆凝结实验进行校准和质量控制，包括例如但不限于部分促凝血酶原激酶时间(PTT)、活化部分促凝血酶原激酶时间(APTT)、凝血酶凝血时间(TCT)实验、活化凝血时间(ACT)实验、血纤维蛋白原分析和其它与血液和血浆有关的凝结实验，可以通过光学、电子、粘度或其它检测机理检测凝结。
为了清楚，这里提供定义，但不应该理解为起限制作用。这里所用的技术和科学术语意欲具有与本领域普通技术人员通常理解的相同的含义。
本文所用的术语“平均偏差”及其语法同义词指试验、实验、方法或技术的准确度。“平均偏差”是一组实验数据的平均结果与另一组实验数据的平均结果之间的差异。
本文所用的术语“变量系数”或“CV”及其语法同义词指对检测精确度定量的统计值。术语“％CV”等于(标准偏差/平均值)×100。
本文所用的术语“凝血酶原时间”或“PT”及其语法同义词指在对有过量血液凝固(血栓症)危险的个体的监控治疗中可以使用的血液凝结时间的实验。因为当用不同的PT检测系统检测时，对给定样品的“PT”将不同，所以“PT”值通过用国际标准化比率(INR)单位表示实验结果来标准化。
本文所用的术语“国际标准化比率”或“INR”及其语法同义词指从根据下面的公式从凝血酶原时间PT得到的检测单位INR＝(PT/MNPT)ISI其中MNPT是平均正常凝血酶原时间，ISI是国际灵敏指数。INR补偿体系与体系之间的变化和在PT检测中组织促凝血酶原激酶试剂的灵敏度。虽然预期不同的试剂和仪器系统对于相同样品会产生不同的PT，但是预期不同体系的INR值是可比较的。正常的INR范围是约0.8-约1.2INR单位，治疗水平可以在约2.0-约4.5INR单位之间变化，这取决于对患者的血栓危险和所涉及的不同治疗方法。
本文所用的术语“国际灵敏指数”或“ISI”及其语法同义词指用于将PT转化为INR单位的因子。ISI对于每个用于PT检测的体系是唯一的，必须通过相对于参比体系的校准体系来测定。ISI通过用校准曲线斜率(正交回归，其中x＝待校准的体系的LogPT，y＝参比体系的LogPT)乘以参比体系的ISI来计算。
本文所用的术语“平均正常凝血酶原时间”或“MNPT”及其语法同义词指用于将PT转化为凝血酶原时间比率(PTR)或用ISI因子转化为INR单位的因子。MNPT是几个(通常大于20个)在PT实验体系上检测的正常血浆的凝血时间的几何平均值。MNPT对于每个凝结时间实验体系是唯一的。
本文所用的术语“校准编码”及其语法同义词指在不同的分析体系中使用的唯一的一个数或一组数，以确定对于一组给定的PT实验试剂例如试条的ISI和MNPT的组合。
本文所用的术语“血浆”及其语法同义词指血液的血浆，即在其中悬浮血液细胞的非细胞流体。
本文所用的术语“宿主”、“患者”、“个体”和“主体”及其语法同义词指任何一个或一组哺乳或非哺乳物种，其可以是可以用于本发明的血浆的血浆供体，或可以需要抗凝结治疗，或需要凝结监控。
本文所用的术语“凝结”及其语法同义词指将液体或溶胶转化成软的半固体或固体物质。当创伤或病理状况引起血管损伤时，血液自然地凝结形成隔断。有两种公认的凝结途径外源性或组织促凝血酶原激酶控制的凝结途径以及内源性或凝血酶原/血纤维蛋白原控制的凝结途径。
应该注意的是，如在本说明书中和所附权利要求中所用的单数形式“一”、“一种”和“这种”包括复数，除非另有说明。因此，例如“一种控制混合物”包括一种或多种这种控制混合物，和“凝结实验”包括一个或多个凝结实验等。
组合物本发明的对照组合物包括能在血浆中聚集的颗粒和钙离子，当其与血浆组合时，在被施用或引入到凝结实验体系例如试条中时能模拟全血的作用。特别是，颗�：偷鞍字实木奂约巴庠葱阅嵬揪兜幕罨杂肴嗨频姆绞浇校佣芙心崾笛樘逑档男Ｗ�。所述颗�？梢允切∫旱男问剑呛驮谌芤褐械母评胱涌梢栽谟胙楹现胺直鸫⒋妫⒖梢栽诮档偷奈露认麓⒋嬉员阊映ご⒋嫫�。在本文中，术语“悬浮液”和“溶液”可以互换使用，因为在许多情况下，本发明的组合物可以具有同时存在的溶解和悬浮的组分。
能在血浆中聚集的颗粒包括在颗粒表面上存在的分子或官能团，其能促进血浆中的蛋白质与颗粒的非特定结合，或在颗粒表面上附着特定的官能团，从而能检测校准和控制凝结实验体系中的颗粒聚集。颗粒尺寸可以例如为直径约0.01-约1000微米。更特别的是，颗粒的直径可以为约0.05-约100微米，在一些情况下其直径将为约0.1-约10微米。在一些情况下，颗�？梢院胁煌叽绲目帕５幕旌衔�。
在用于下述校准之前，颗�？梢杂敫评胱尤芤悍挚⒋妫渲锌帕Ｒ栽谒械男∫�、含水缓冲液或其它液体的形式储存。当颗粒作为悬浮液储存时，颗粒可以占悬浮液的约1-约99重量％。在特定的实施方案中，颗粒在悬浮液中的重量百分率可以占悬浮液的约10-约50重量％。颗粒以悬浮形式的使用允许用微移液管对悬浮液进行准确的取样。
本发明的组合物可以含有防冻组分，在其中悬浮颗粒，以便防止颗粒在冷储存过程中发生变化。防冻材料可以包括甘油、乙二醇、丙二醇或它们的溶液、混合物或掺混物。在选择的实施方案中，上述颗�？梢灾苯有≡诜蓝匙榉掷绺视椭�。
所述颗�？梢院芯酆衔镏榱＠缇郾揭蚁�、聚碳酸酯、聚丙烯酸类或其它已经过表面改性而在珠粒表面上引入官能团的聚合物材料。不同聚合物材料的各种所述表面官能化聚合物珠粒、珠粒尺寸和官能度是可以从商业得到的。表面官能化聚合物珠粒的尺寸可以根据本发明的具体实施方案而变化。聚合物珠粒可以例如具有直径为约0.01-约1000微米，或约0.05-约100微米，和在一些情况下如上所述为约0.1-约10微米。
当珠粒暴露于血浆蛋白时，在聚合物珠粒表面上存在的官能团诱导或促进了珠粒的非特定聚集。官能团可以包括带电荷的官能团，其可以包括任何阴离子和/或阳离子性的官能团。阴离子官能团包括例如羧酸根、磺酸根、酚盐基团和磷酸根。阳离子官能团包括例如铵、烷基铵和芳基铵基团。阴离子或阳离子官能团可以通过表面官能化化学反应被引入到聚合物珠粒上。在聚合物珠粒表面上引入带电荷官能团的过程中涉及的技术可以与在用于离子交换色谱的阴离子和阳离子珠粒的制备中所用的公知技术相同或相似，在本发明组合物中可以使用的各种表面官能化聚合物珠粒可以从商业获得。在下述具体实施例中，在对照组合物中使用羧酸盐官能化的聚苯乙烯珠粒。
在颗粒表面上的官能团的相对浓度可以变化。在带电荷官能团的情况下，颗�？梢跃哂斜砻娴味ǎ晕⒌绷�/克计，为约10-约1000，更通常为约50-约500，在特定的实施方案中为约100-250。在颗粒表面上的带电荷基团的“占据面积”可以例如为约5-约100、约10-约50，和在特定实施方案中为约20-约30。
珠粒的聚合物材料可以是离聚性的，使得带电荷官能团是珠粒本身的聚合物材料所固有的。离聚物的例子包括能提供铵官能团的聚赖氨酸(polylysine)和能提供羧酸根官能团的聚丙烯酸。所以，聚合物珠�？梢院薪涣睦刖畚�。
在一些情况下，颗粒可以含有非聚合物颗粒，其已经进行表面改性以引入官能团。所以，合适的碳、二氧化硅、粘土或其它材料的官能化颗�？梢杂糜诒痉⒚鞯淖楹衔镏小？梢酝ü玖煊蚬谋砻婀倌芑Ъ际趸蛲ü美刖畚锢缍嗳鬯鼗蚓郾┧嵬扛部帕６绾傻墓倌芡乓胝庵址蔷酆衔锟帕Ｖ�。
在一些实施方案中，本发明的颗粒被能促进颗粒在血浆中聚集的材料或分子涂覆。在这方面，所述颗�？梢院泄潭ㄔ诳帕１砻嫔系牡鞍字剩湓谘拇嬖谙掠盏伎帕５木奂�。
钙离子溶液可以包括任何水或含水的可溶性Ca++盐，包括例如硫酸钙，卤化钙例如氯化钙、溴化钙或碘化钙。Ca++离子在溶液中的浓度可以根据本发明的具体实施方案和所用的具体钙盐的溶解度而变化。Ca++离子的浓度可以例如是约0.01-约5.0摩尔，更特别地是约0.05-约2.0摩尔。在具体的实施方案中，Ca++离子的浓度可以是约0.1-约1.0摩尔。钙离子溶液通常与所述颗粒分开储存，在如下所述进行本发明方法之前与其混合。
含有在珠粒表面上具有带电荷官能团的聚合物珠粒的对照组合物与可溶性钙盐的溶液一起当与柠檬酸盐化血浆混合时，能提供对常规全血的凝结的有效模拟，这可以用于如下所述的校准凝结实验。一些凝结实验不能容易地检测在未着色的对照组合物中的凝结。因此，在本发明的用于基于光学监控凝结来校准凝结实验的实施方案中，可以加入一种或多种光学对比增强剂来协助对凝结的光学监控。
光学对比增强剂可以包括可悬浮的或可溶性的彩色物质或颜料，可以悬浮或溶解在钙离子溶液中，悬浮或溶解在具有聚合物珠粒或其它颗粒的溶液中，或悬浮或溶解的独立的液体中。光学对比增强剂可以另外或者选择性地含有在钙离子溶液中存在的可溶性染料，和/或在聚合物珠粒中存在的染料，或溶解在其中已经悬浮珠粒的溶液中。染料的颜色可以根据用于表征在待校准的凝结实验中的凝结所用的波长而改变。在常规红色LED光源的情况下，可以使用能吸收红色LED输出的蓝色染料。染料的用量可以根据本发明的具体实施方案和各染料的强度而变化。当染料溶于钙离子溶液中时，染料可以占溶液的例如约0.01-约10重量％。在某些实施方案中，染料可以占约0.1-约1重量％，在特定的实施方案中，染料可以占约0.1-0.5重量％。
所述组合物可以进一步含有颗粒聚集增强剂，其与颗粒本身无关，即与颗粒表面没有关联。血红蛋白在许多实施方案中是理想的聚集增强剂，这是因为血红蛋白倾向于促进珠�：推渌帕Ｔ谘械木奂Ｌ乇鹗牵斓鞍椎拇制分萍撂峁┠馨镏帕＞奂睦嘀ぃ⑻峁┯胙合赴嗨频南赴砻娴绾桑佣俳奂�。聚合物珠粒或其它颗粒与血红蛋白一起模拟“Rouleau效应”，使得随着珠粒的聚集，对照组合物的光学读数在透过率百分比方面增加，在出现凝结时透过率百分比变平缓。
许多血红蛋白可从商业以干燥的或冷冻干燥的红细胞形式获得，并可以用于本发明。当血红蛋白用作在钙离子溶液中的聚集增强剂时，血红蛋白可以占溶液的例如约1-约25重量％，和在特定的实施方案中，为约5-约15重量％。
本发明的对照组合物还可以含有各种其它组分或成分以促进或提高在血浆中颗粒的聚集。溶解的和/或悬浮的聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)和聚乙二醇(PEG)是可以用于本发明的聚集增强剂的例子。在本发明组合物用于校准其中通过电子方式根据电极之间样品的检测电势来检测凝结时间的凝结实验时，可以在组合物中包含一种或多种电解质改性剂以促进电压的检测。这种电解质改性剂可以包括例如钠或既盐的溶液或其它可溶性电解质。
所述对照组合物还可以包括血浆，其可以是人体“校准血浆”的形式，已经从具有已知凝结能力的常规血供体的凝结库获得。血浆可以被柠檬酸盐化以防止凝固。柠檬酸盐通常以可溶性柠檬酸盐的形式存在，在血液和血浆收集管中提供，将其从收集管转移到血浆中。柠檬酸盐用于螯合在血浆中的钙离子以防止凝固。当本发明的组合物用于非人体主体的凝结实验时，血浆可以从相应的主体物种的成员获得。
本发明的对照组合物在特定的实施方案中还可以包含一种或多种凝固因子例如组织促凝血酶原激酶、血纤维蛋白原、FVII、FVIIa等，它们可用于活化血浆中的外源性凝结机制。但是，通�？悸堑氖鞘褂帽痉⒚髯楹衔锏哪崾笛榻桃蜃樱佣痉⒚髯楹衔镏胁恍枰桃蜃�。
通用方法本发明方法包括提供一种包含钙离子和能在血浆中聚集的颗粒的组合物，将所述对照组合物与血浆组合，并将组合的颗粒、钙离子溶液和血浆引入待校准的凝结实验中。更具体地说，本发明的方法包括提供能在血浆中聚集的颗粒，提供钙离子的溶液，将所述颗�：透评胱尤芤鹤楹希尤胱楹系目帕：透评胱尤芤褐幸孕纬梢恢侄哉兆楹衔铮龆哉兆楹衔锸┯没蛞氲侥崾笛橹校⒓嗫厮龆哉兆楹衔锏哪�。该方法还可以进一步包括测定所述对照组合物的凝结时间与全血的凝结时间之间的关系，其中从该全血得到在对照组合物中的血浆。该方法可以另外包括测定由凝结实验获得的对照组合物的凝结时间与使用参比实验得到的凝结时间之间的关系。该方法还可以进一步包括测定校准曲线或对凝结实验进行校准确定。所述方法可以进一步包括将所述对照组合物施用到多个凝结实验中，监控在每个凝结实验中对照组合物的凝结，和评价每个凝结实验的质量控制。
提供能在血浆中聚集的颗粒可以包括提供颗粒的悬浮液。所述颗�？梢园ㄔ谄浔砻嫔暇哂写绾傻幕蚱渌囟ü倌芡诺木酆衔镏榱�。所述颗�？梢孕≡诜蓝臣晾绺视突蛏鲜銎渌禾逯�。所述颗�？梢员蛔派蚝幸恢秩玖弦源俳岬墓庋Ъ觳�。颗粒在防冻剂中的悬浮液可以冰冻储存。聚合物珠粒或其它所提供的颗粒的量通常根据待校准的校准实验的类型而变化。所提供的颗粒悬浮液的量或体积可以是体积为例如约5-约500微升、约10-100微升或约25-50微升的珠粒悬浮液。如此获得的珠粒悬浮液可以在使用之前储存在冰箱中。
提供钙离子溶液可以包括提供任何水或含水的可溶性Ca++盐的溶液，包括硫酸钙，或卤化钙例如氯化钙、溴化钙或碘化钙，或上述的那些。提供钙离子溶液可以进一步包括在溶液中提供一种或多种光学对比增强剂和/或颗粒聚集增强剂，例如溶解的染料和/或上述血红蛋白。钙离子溶液的量通常根据待校准的校准实验的类型而变化。钙离子溶液的量可以是体积为约5-约500微升、约10-100微升或约20-40微升的1.0摩尔原料溶液体积。如此获得的钙离子溶液可以在使用之前储存在冰箱中。
如果在冰箱中储存，则所述颗�：透评胱尤芤河Ω迷诨旌现按锏交肪澄露�。温度调节应该在如下所述加入血浆或将血浆与分开储存的颗�：透评胱尤芤夯旌现昂芏痰氖奔淠诮�。组合或混合可以如下进行将适宜量的颗粒悬浮液和钙离子溶液用移液管转移到普通的容器中，然后旋转、摇动或搅拌该容器以进行混合。颗粒和钙离子溶液的储存及其后续的混合还可以用双室容器设备进行，如在下面所述。
接着，将血浆加入组合的颗粒和钙离子溶液中以形成对照组合物。血浆可以含有柠檬酸盐化校准血浆，得自血液供体库，例如根据WHO程序，20个正常人和60个抗凝结患者。血浆还可以含有柠檬酸盐化人体校准或控制血浆，例如可从Precision Biologics Inc.DadeBehring，Instrumentation Laboratory，Pacific Hemostasis，Inc.Haematologic Technologies，Inc.，Bio Rad Inc.或其它商业来源获得的那些。向组合的颗�：透评胱蛹尤胙牧靠梢允抢缣寤�5-约500微升，或在特定实施方案中体积为约10-约250微升，或在一些实施方案中体积为约50-约200微升。可以使血浆在加入组合的颗�：透评胱尤芤褐按锏绞椅禄蚧肪澄露取�
在颗�：透评胱尤芤旱幕旌嫌虢婧蠹尤肫渲兄涞氖奔淇梢晕�10秒至约1小时，在某些实施方案中可以为约30秒至约30分钟，或约1-约10分钟。
在将血浆加入颗�：透评胱尤芤阂孕纬啥哉兆楹衔镏螅龆哉兆楹衔镆牖蚴┯玫酱Ｗ嫉哪崾笛橹校崾笛榘峄蚰桃蜃永缱橹倌冈っ�、血纤维蛋白原、FVII、FVIIa等，它们能活化在对照组合物中存在的血浆中的外源性凝结机制，将其暴露于对照组合物。凝结实验可以包括凝血酶原时间(PT)实验、部分组织促凝血酶原激酶时间(PTT)、活化部分组织促凝血酶原激酶时间(APTT)、凝血酶凝血时间(TCT)、活化凝血时间(ACT)、血纤维蛋白原分析，或其它与上述血液和/或血浆有关的凝结实验。凝结实验可以设计通过光学、电子、粘度或通过其它技术检测凝结。可以使用本发明组合物和方法的例示的凝结实验体系包括在美国专利3620676、3640267、4088448、4426451、4849340、4868129、5110727、5230566、5472603、5522255、5526111、5700695、5710622、5736404、5789664、6084660、6046051、6060323和6066504，以及欧洲专利申请EP 0 803 288和EP 0 974 840所述的那些，将其公开内容引入本文作为参考。
将对照组合物引入凝结实验可以通常以与用于将全血样品或血浆样品引入凝结实验相同的方式进行。在光学可读数的凝结试条的情况下，例如对照组合物的样品可以通过抽吸或毛细管作用被吸收入试条的这一位置，在该位置使对照组合物暴露于凝固因子，且在该位置放置一个或多个传感器以便从光学上检测对照组合物在试条中的凝结。光学检测可以通过检测光学反射、吸收、透过或其它与试条相关的效应以常规方式进行。
在将血浆加入颗粒和钙离子溶液之后很短的时间内将对照组合物引入凝结实验，因为钙离子溶液和在颗粒上的带电荷的官能团能在血浆与颗�：透评胱尤芤航哟ナ庇行У赜盏荚谘兄榱５木奂�。因此，在将血浆加入组合的颗�：透评胱尤芤褐罂梢栽谠�1秒至约20分钟的时间内将对照组合物引入凝结实验，或在特定的实施方案中，在约5秒至约10分钟内。
在将对照组合物引入凝结实验后，监控柠檬酸盐化血浆的凝结。该监控通过光学、电子、粘度或其它技术进行。如上所述，在组合物内的颗�：凸庋Ф员仍銮考恋木奂梢源庸庋霞觳�。在特定的实施方案中，颗粒与作为聚集增强剂的粗血红蛋白一起，模拟“Rouleau效应”，从而可以光学方式检测颗�：脱斓鞍椎木奂�。
从凝结的监控，凝结实验可以被校准，凝结实验的质量或性能可以被确认或控制。通过不同凝结实验测得的凝结时间由于不同的实验结构而不同，相同凝结实验的不同商业组可以由于在凝结实验中所用的不同的凝结因子样品而不同。在同类PT实验中所用的不同组织促凝血酶原激酶样品的可变性例如可以导致在未正确校准PT实验时不正确的抗凝结剂量。
PT实验标准的WHO国际体系使用国际标准化比率(INR)和国际灵敏度因子(ISI)来校准PT实验。ISI值包括相对于参考组织促凝血酶原激酶制剂例如WHO国际参考制剂(IRP)或具有已知性能的商业标准物例如RECOMBIPLASTIN，校准特定的“局部”组织促凝血酶原激酶萃取物。检测ISI值和校准PT实验的方法是本领域公知的，描述于L.Poller的“The Prothrombin Time”，WHO，1998，将其公开内容引入本文作为参考。简单地说，当从供体库(通常20个正常人和60个接受抗凝结剂治疗的患者)用局部组织促凝血酶原激酶进行PT检测时得到的正交回归线的斜率相对于用组织促凝血酶原激酶标准物得到的PT，以双对数方式绘图，提供PT实验的响应的测量手段。局部组织促凝血酶原激酶的正交回归校准斜率参数b1与已被校准的参比组织促凝血酶原激酶，用于根据下面的关系式计算ISIISI局部＝(b1×ISI参比)正交回归线参数b1得自关系式y＝a1+b1x，其中a1和b1分别是正交回归线的截距和斜率。a1值如下所示，a1＝y-b1x其中x和y是x和y的算术平均值。b1值如下所示，b1=m+n2-1]]>其中n是PT的数目，m=Σ(x-x‾)2-Σ(y-y‾)22Σ(x-x‾)(y-y‾)=12r[sysx-sxsy]]]>sx和sy是x和y值的标准偏差，r是相关系数。
考虑到在各PT实验中存在的偏差，PT值通过用国际标准化比率(INR)单位表示实验结果来标准化。INR是根据下面的方程检测凝血酶原时间PT得到的检测单位INR＝(PT/MNPT)ISI其中MNPT是如上所述的平均正常凝血酶原时间，ISI是如上所述的国际灵敏度指数。平均正常凝血酶原时间或MNPT是用ISI因子将PT转化成INR单位的因子。MNPT是几个(通常大于20个)在PT实验系统上检测的正常血浆的凝血时间的几何平均值。对于每个PT实验系统，MNPT是唯一的。
本发明组合物的颗�：透评胱尤芤河氪⒋娴睦醋怨┨宓难楹希阅Ｄ庠赑T实验中的供体全血。供体血浆样品和商业校准血浆可以长期冷冻储存，所以本发明的对照组合物当用这种血浆制备能消除由于在每次PT实验的不同商业组必须校准时获取多个全血样品所带来的费用和不便。代替的方法是使冷冻的血浆样品融化，并与颗�：透评胱尤芤夯旌弦蕴峁┠苊看卧谛枰笛樾Ｗ际蹦Ｄ馊亩哉兆楹衔�。
当本发明的对照组合物模拟在PT实验中的全血的作用时，由对照组合物产生的PT可以与向组合物供应血浆的相应全血不同。所以，本发明的方法包括测定对照组合物和与用于对照组合物中的血浆相应或相关的全血之间的关系。该检测包括测定该组合物的ISI，其可以通过相对于从向组合物中提供血浆的相应全血得到的PT检测结果，以双对数形式绘制对照组合物的PT检测结果的正交回归线获得。当正交回归线的斜率是a1时，采用关系式ISIWB＝(1/a1)×ISIC)其中ISIC是对照组合物的ISI，ISIWB是对应于对照组合物中的血浆的全血的ISI。如下面的具体实施例所示，对于一个实施方案的组合物的a1约为0.81。
一旦测定对照组合物和相应的全血之间的关系后，就可以检测由PT实验得到的对照组合物的PT与由参比实验得到的对照组合物的PT之间的关系。用于检测生产者的PT实验的“批次之间”的WHO程序建议用正交回归分析从全血样品的PT相对于从相应的新鲜血浆得到的PT进行全面校准。WHO程序也允许用确认的校准血浆进行校准。
设计用于方便患者家庭应用的PT实验通常基于试条，向其上施用从刺手指得到的新鲜全血，通过读数计以光学方式监控PT。用仅仅用于这种实验的“批次之间”校准的血浆进行准确检测PT很难，这是因为在血浆中缺乏光学可检测的红血细胞。但是，本发明的对照组合物模拟在光学可读数的PT实验中的全血行为，这是由于在对照组合物中表面带电荷的颗粒的聚集可以从光学检测。通过光学对比增强剂，例如在颗粒本身中存在的颜料、粗血红蛋白溶胞产物的存在或上述光学可检测的粒状颜料，在凝结期间由对照组合物提供的光学对比可以改进或设计成所需的性能。
在从PT实验得到的对照组合物的PT与参比实验的PT之间的检测关系可以从对照组合物的PT检测值的正交回归线得到，其通过以双对数形式将检测结果相对于用参比组织促凝血酶原激酶的参比实验测定的PT检测结果得到。参比实验可以例如包括MLA Electra 1400C凝结分析仪或其它参比实验系统。参比组织促凝血酶原激酶可以包括RECOMBIPLASTIN。
在所述实验检测的对照组合物的PT检测值相对于由参比体系测定的PT检测值得到的正交回归线的斜率提供了校准线或曲线，从其可以确定校准编码，并归属于所述实验。校准编码要求ISI和MNPT值。从上述校准线的斜率确定ISIC，从WHO程序的20个正常个体测定MNPT值，作为在所述PT检测系统上检测的PT时间的几何平均值。
设备本发明还提供用于校准凝结实验体系的设备。参考图1，显示了凝结实验的校准和对照设备10，包括容器12，其具有至少两个室14和16。容器12的结构可以是常规Eppendorf管的形式，或者其结构便于旋转、用移液管将试剂或成分转移入和转移出容器，和/或使用多井形式的容器或对于生物样品容器常见的体系。隔断18可以移动，而不是易碎的。在容器12中可以包括额外的易碎或可移动的隔断20，作为室14和16的盖子。
能在血浆中聚集的颗粒储存在室14和16之一中，而钙离子溶液储存在另一室中。颗�？梢园ū砻婀倌芑木酆衔镏榱＃梢匀缟纤鲈谛∫褐�。钙离子溶液可以包含血红蛋白、溶解的染料和/或其它光学对比或聚集增强剂。在其中装有颗�：透评胱尤芤旱娜萜�12可以在使用之前储存在冰箱内。然后用移液管将适宜量的血浆转移到容器12内的颗�：透评胱尤芤褐校⒂肫浠旌�。然后将组合的颗粒、钙离子溶液和血浆以上述方式引入到凝结实验体系中。当隔断18和20是易碎的时，它们被一次性移液管尖端或其它仪器破碎，使得室14和16的内容物在容器12内一起组合或混合。
在一些实施方案中，容器12可以包括被可移动的或易碎的隔断分开的三个室，其中第三个室设计成含有血浆。在使用过程中，隔断破裂或被移动以使颗粒、钙离子溶液和血浆组合。容器12可以以许多方式设计。在一些实施方案中，容器12可以含有易碎的中空珠粒，在其中储存校准组合物的颗�：透评胱尤芤�。
参考图2，显示另一个凝结实验校准和对照设备22的实施方案，其包括容器24和多个中空的易碎珠粒或安瓿26、28、30。能在血浆中聚集的颗粒、钙离子溶液和血浆在安瓿26、28、30内分开储存。打碎易碎的珠粒使得颗粒、钙离子溶液和血浆混合以提供对照组合物。容器24和珠粒26、28、30可以在使用之前如上所述冷冻储存。
试剂盒还提供用于实施本发明方法的试剂盒。本发明的试剂盒包括一种含有能在血浆中聚集的颗粒的容器，和钙离子的容器。所述容器可以是在上述单个容器中的不同的室或易碎珠粒的形式。试剂盒可以进一步包括一个或多个含校准血浆的容器。试剂盒可以另外或者选择性地包括一个或多个凝结实验设备例如PT试条。所述试剂盒可以包括用于获得血样的设备，例如用于刺手指的小刀、小刀调节器等。在某些实施方案中，试剂盒还包括自动化装置，例如用于在将校准组合物引入凝结实验后在凝结实验中监控凝结的光学读数计。所述试剂盒还可以另外包括关于进行上述校准凝结实验的方法的说明书。这些说明书可以在包装、标签插入物、试剂盒内的容器等上。
应用本发明的校准组合物、方法、设备和试剂盒可以用于校准各种用于监控正在接受抗凝结治疗的患者的凝结实验，用于筛选或诊断各种患者或主体的病症。这些病症包括例如获得性血小板机能缺陷、先天性血小板机能缺陷、先天性蛋白质C或S缺乏、深层大脑内出血；DIC(弥散性血管内凝血)、第II因子缺陷、第V因子缺陷、第VII因子缺陷、第X因子缺陷、溶血性尿毒性综合征(HUS)、流感A、流感B、出血性中风、肝性脑病、肝肾综合征、高血压大脑内出血、特发性血小板减少性紫癜(ITP)；大脑内出血、页脑内出血、胎盘早剥；短暂性缺血发作(TIA)，Wilson病等。
实施例提供以下实施例，从而为本领域普通技术人员提供完整的关于怎样制备和使用本发明的公开和描述，但不用于限制本发明的范围，也不表示以下是发明人进行的所有或仅仅这些实施例。已经努力保证所有数字的准确性，但是应该考虑一些实验误差和偏差。除非另有说明，份数是重量份，分子量是重均分子量，温度由摄氏度表示，压力是大气压或接近大气压。
实施例1对照组合物的制备除非另有说明，所有试剂和组分都从商业来源获得。RSP 9652型Cavro分散器用于微量移液。
a.颗粒悬浮液将甘油(0.947克，Aldrich/Sigma Cat.No.G7893)转移到30毫升小瓶(vial)中，并将25.71克Bangs羧基官能化聚苯乙烯珠粒(Bangs Cat.No.DC02B，深蓝色P，S/V-COOH，0.19uM平均直径)加入管形瓶内的甘油中。组合的甘油和Bangs珠粒在小瓶中旋转，形成深蓝色的珠粒悬浮液，将该悬浮液在室温下储存。
b.着色的氯化钙溶液将血红蛋白(3.3克，Aldrich/Sigma Cat.No.H-3760，干燥的�：煜赴�)转移到50毫升的瓶中，向其中加入30.0毫升蒸馏水，形成血红蛋白原料溶液。组合的血红蛋白和水通过摇动10分钟来混合，从而完全溶解或分散血红蛋白。在混合后，将装有血红蛋白原料溶液的瓶放在冰上。
将FD&C蓝色染料粉末(0.500克，Warner Jenkinson Cat.No.05601)加入单独的15毫升瓶中，与10.0毫升蒸馏水一起形成染料原料溶液。将瓶封盖，并摇动10分钟，使染料溶解在水中，然后将瓶在室温下储存。
在分开的15毫升瓶中，将7.650毫升的1.0M CaCl2溶液(BDH Cat.No.190464K)与2.350毫升蒸馏水混合，形成CaCl2原料溶液。然后在室温下储存该氯化钙溶液。
用移液管从血红蛋白原料溶液中除去泡沫，将27.34毫升血红蛋白原料溶液转移到60毫升瓶中，然后加入3.66毫升CaCl2原料溶液。组合的溶液进行混合，将2.00毫升FD&C染料原料溶液加入瓶中，并在其中混合。然后在冰上储存这种着色的氯化钙溶液。
c.将颗粒悬浮液和着色的氯化钙溶液与血浆组合向每个Eppendorf管中转移37.0微升的颗粒悬浮液和25.0微升的着色的氯化钙溶液，在加入血浆之前使管达到室温。然后向每个管中加入200微升的相应的血浆样品(参见下面的实施例)，并将组合的颗粒悬浮液、氯化钙溶液和血浆旋转约3-10秒。在约30秒的混合期间，将组合的颗粒悬浮液、氯化钙溶液和血浆涂在试条上(如下面的实施例2所述)。
实施例2对照组合物的ISI测定在该实施例中，测定对照组合物和从分离用于对照组合物的血浆得到的相应全血样品之间的关系。在该实施例中描述的PT试条和光学读数计或读数仪描述在欧洲专利申请EP 0 974840中，将其公开内容引入本文作为参考。简单地说，每个试条如下制备先使夹在两个释放衬底之间的双面胶带(Scapa Tapes.Cat.No.RX 675SLT，WindsorCT)通入层合和旋转的冲切转化系统中。以欧洲专利申请EP 0 974840的图10中所示的方式(除了制动连接件)从顶部释放衬底和胶带切下，但不切到底部释放衬底。经过亲水处理的聚酯膜(3M Cat.No.3M9962，St.Paul，MN)层合到暴露的胶带底边上。通过鼓泡喷墨打印机用HP 51612A打印头(Hewlett-Packard，Corvallis OR)将组织促凝血酶原激酶(Ortho Clinical Diagnostics，Raritan NJ)印到聚酯膜的试剂区域上。在未处理的聚酯膜中切下样品部分(AdhesiveResearch Cat.No.AR1235，Glen Rock PA)，然后将其层合到双面胶带的顶部(在从上取下释放层之后)，形成三层的夹心结构。然后将顶部连接件通过冲切过夹心结构的所有三层，并将一条单面胶带(3MCat.No.MSX4841，St.Paul MN)涂在聚酯层的外侧，从而密封制动连接件。这种试条可在商业上从Lifescan Inc.，Milpitas CA以HARMONYTM试条获得，以及相应的用于该试条的光学读数计。
临床位置的非静脉血液样品和对20个正常人和60个接受抗凝结剂治疗的患者的相应的新鲜的柠檬酸盐化血浆样品根据WHO程序(L.Poller，“The Prothrombin Time”，WHO 1998)获得。含有在实施例1中如上所述制备的聚合物珠粒悬浮液和氯化钙溶液的冷冻管被加热到环境温度，将200微升的每个血浆样品移液到相应的管中，并旋转30秒，以制备20-25微升的对应于每个血浆样品的对照组合物。将每个样品的组合的血浆、珠粒和氯化钙溶液在旋转后30秒内涂在试条上，测定在试条上的每个样品的PT时间。将相应的全血样品涂在试条上，并测定其PT。该过程对13个不同的样品位置对11组不同的试条重复进行。
对于每组试条，由全血样品得到的PT的Log值相对于由对照组合物样品得到的PT的Log值绘图，根据下面的方程，用正交回归分析测定对照组合物的ISI值ISIWB=(1/a1)×ISIC)其中ISIC是对照组合物的ISI，ISIWB是与对照组合物中的血浆对应的全血的ISI。ISIWB和ISIC的值如表1所示。对照组合物的a1平均值是约0.8097，并在下面的实施例中用作ISIC的校正因子。
实施例3使用对照组合物和20/60柠檬酸盐化血浆样品确定PT试条的ISI该实施例测定对照组合物的PT值和用于校准PT试条的参考组织促凝血酶原激酶的PT值之间的关系。使用Hemoliance MLA Electra1400C凝结分析仪，用Ortho RECOMBIPLASTIN作为参考物。在实施例2中描述的三个孔道试条使用对照组合物。
从实施例2的20个正常人和60个接受抗凝结剂治疗的患者得到的临床位置的柠檬酸盐化血浆样品在使用之前于-80℃储存。使如实施例1所述制备的血浆样品和含聚合物珠粒悬浮液和氯化钙溶液的冷冻管加热到环境温度。将200微升的每个血浆样品移液到相应的管中，并旋转3-10秒，以制备262微升的对应于每个血浆样品的对照组合物。将每个样品的组合的血浆、珠�：吐然迫芤涸谛�30秒内涂在试条上，测定在试条上的每个样品的PT时间。
Ortho RECOMBIPLASTIN标准物的80个样品的PT用HemolianceMLA Electra 1400C凝结分析仪检测。由Ortho RECOMBIPLASTIN得到的PT的对数值相对于由从这80个样品制得的对照组合物得到的PT的对数值绘图，得到具有斜率ISIC的校准线。由RECOMBIPLASTIN得到的PT的对数值相对于由毛细管血液样品得到的PT的对数值绘图，得到具有斜率ISIWB的线。由对照组合物样品得到的PT的对数值还相对于由毛细管血液样品得到的PT的对数值绘图，得到具有斜率a1的线。该过程对实施例2中所用的相同的11组试条重复进行。每组试条的斜率a1的均一性，以及ISIWB、ISIC、ISIC/a1，以及对于每组试条ISIWB和ISIC/a1之间的百分比差异如表1所示。从表1可见，对照组合物提供了对用于评价试条的相应全血样的很好的近似。
表1
从表1得到的a1的平均值是0.8097(约0.81)，标准偏差为0.03，CV为3.3％。
实施例3使用对照组合物和血浆标准校准剂确定PT试条的ISI该实施例重复测定PT试条与参考组织促凝血酶原激酶之间的关系，只是使用商业校准血浆代替从20个正常供体和60个接受抗凝结剂治疗的供体得到的血浆。使用七个Precision Biologics INR校准血浆(Control Normal和Control Abnormal I-Control AbnormalVI)，样品对照组合物通过以上述方式将血浆样品与组合的颗粒悬浮液和着色的氯化钙溶液混合来制备。由RECOMBIPLASTIN得到的PT的对数值相对于由从Precision Biologics校准血浆制得的对照组合物样品得到的PT的对数值绘图，得到具有斜率ISIC的校准线。使用80个供体的血浆由RECOMBIPLASTIN得到的PT的对数值相对于由相同的毛细管血液样品(20个正常，80个不正常)得到的PT的对数值绘图，得到具有斜率ISIWB的线。由对照组合物样品得到的PT的对数值还相对于由毛细管血液样品得到的PT的对数值绘图，得到具有斜率a1的线。该过程对如上述实施例2制备的试条的10个不同批次或组中的9个三孔道试条中的每个重复进行。每组试条的ISIWB、ISIC、ISIC/a1，以及ISIWB和ISIC/a1之间的百分比差异如表2所示。由商业校准血浆制得的对照组合物提供了对用于评价试条的相应校准血浆标准物的很好的近似。
表2
实施例4确定PT试条的校准编码用实施例2的三孔道(channel)试条测定的全血的PT几何平均值用作全血MNPT值。使用在实施例3和4中得到的ISIC值，计算试条各组的校准编码。从WHO全血测定的校准编码(Cal CodeWB)和从对照组合物测定的校准编码(Cal CodeC)分别如表3和4所示。
表3
表4
使用实施例2的20/60柠檬酸盐化血浆样品和实施例3的Precision Biologics校准血浆，在由对照组合物估计的ISI值与WHO全血校准之间的平均偏差小于8％。在各组试条和临床外校准中，对照组合物和其相应的血液之间的关系a1保持相对恒定。由用20/60柠檬酸盐化血浆样品或Precision Biologics校准剂的对照组合物产生的校准编码在±2校准编码范围内。所以，本发明的对照组合物提供了有效确定PT试条的ISI和校准编码的方式。
实施例5对照组合物用于试条定性对照的用途体外诊断设备的标准评价要求对有限的终端使用者进行精确的检测。在该实施例中，用于实施例1的三孔道试条的总的精确性能根据NCCLS(National Committee for Clinical lab Standards)文件EP5-1第19卷No.2(“Evaluation of Precision Performance ofClinical Chemistry Devices；Approved Guideline”)的程序测定，将其公开内容引入本文作为参考。NCCLS建议在进行最少20个操作日的精确度评价实验。在两个独立的研究地点对两组不同的试条进行评价，即在San Francisco的加利福尼亚大学，Department ofHematology/Oncology and Antigcoagulation clinic(UCSF)；和Oregon Health Sciences University Antigcoagulation clinic(OHSU)(Portland，OR)。
由Precision Biologics得到两个水平的柠檬酸盐化血浆，以进行检测。水平“1”对比，INR为约1.0，水平“2”对比，INR为约2.8，它们用于评价精确度。血浆样品冷冻储存。在使用之前，将一份各个控制血浆按照程序融化，每份按照实施例1所述方式在涂到试条上之前与颗粒悬浮液和氯化钙溶液组合。在该实施例中使用实施例2所述的三孔道试条。
在每个研究地点，在同一天评价20个试条，提供“实验内”精确度实验。“实验内”精确度实验的结果如表5所示。
表5UCSF“实验内”精确度 OHSU“实验内”精确度
“日间”精确度也在两个研究地点用80个试条/对比水平在20天内在每个研究地点检测。日间精确度的评价结果如表6所示。
表6UCSF 日间精确度 OHSU 日间精确度
从表5和表6可见，在每个研究地点，使用实验内精确度实验的对照组合物的％CV(偏差系数)是5％或更小。在每个研究地点，对照组合物的日间精确度实验的％CV小于10％。
虽然已参考具体的实施方案描述了本发明，但是本领域技术人员应该理解在不偏离本发明的精神和范围的情况下可以进行改变和替代等同物。此外，可以进行许多改进使特定的条件、材料、物质的组成、工艺、工艺步骤适应本发明的目的、精神和范围。所有这些改进在所附权利要求的范围内。
权利要求
1.一种对照组合物，包含(a)能在血浆中聚集的颗粒；和(b)钙离子。
2.权利要求1的对照组合物，进一步包含至少一种光学对比增强剂。
3.权利要求1或2的对照组合物，进一步包含至少一种聚集增强剂。
4.权利要求1、2或3的对照组合物，其中所述颗粒包括在其表面上具有带电荷的官能团的聚合物珠粒。
5.权利要求1、2、3或4的对照组合物，其中所述钙离子源包括卤化钙。
6.前述权利要求任一项的对照组合物，进一步包含血浆。
7.一种评价凝结实验的方法，包括使用权利要求1-6任一项的对照组合物。
8.一种凝结实验评价设备，包括具有第一和第二室的容器，其中(a)所述第一室包含能在血浆中聚集的颗粒；和(b)所述第二室包含钙离子的溶液；其中所述容器的设计使得允许所述颗�：退龈评胱拥娜芤涸谒鋈萜髂谝黄鹱楹�。
9.权利要求8的凝结实验评价设备，其中所述第一室和第二室包括易碎的中空珠粒。
10.用于校准凝结实验的试剂盒，包括(a)能在血浆中聚集的颗粒；(b)钙离子的溶液；和(c)柠檬酸盐化血浆的样品。
全文摘要
本发明提供了用于校准凝结实验的对照组合物、方法、设备和试剂盒。本发明的对照组合物包括能在血浆中聚集的颗�：透评胱樱逼溆胙旌鲜保苣Ｄ庠谀崾笛橹腥男形�。所述方法包括提供钙离子和能在血浆中聚集的颗粒，使颗�：透评胱佑胙楹弦孕纬梢恢侄哉兆楹衔铮龆哉兆楹衔锸┯玫侥崾笛橹小Ｋ錾璞赴ň哂兄辽倭礁鍪业娜萜鳎渲幸桓鍪易坝心艽俳蛴盏嫉鞍字试谘芯奂目帕＃硪桓鍪易坝懈评胱拥娜芤�。所述试剂盒含有一种对照组合物，其包括钙离子的容器、能在血浆中诱导蛋白质聚集的颗粒的容器、和一个或多个凝结实验设备。
文档编号G01N33/48GK1432814SQ0310276
公开日2003年7月30日 申请日期2003年1月16日 优先权日2002年1月16日
发明者X·Y·郑, B·埃尔普, H·周, C·哈尔特曼恩 申请人:生命扫描有限公司
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