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专利名称：融合有v5标签重组蛋白的elisa定量检测试剂盒和方法
技术领域：
本发明属于生物医药领域，具体是涉及一种融合有V5标签重组蛋白的ELISA定量检测试剂盒和方法。
背景技术：
目前，在重组蛋白的表达中，为了便于重组蛋白的鉴定分析，常常在蛋白中融合一个“蛋白标签，，，如6XHis tag、V5 tag,GFP tag,GST tag,flag tag、c_myc tag 等。在常见的真核表达载体中，常用的标签有6XHis tag、V5tag和GFP tag。与6X组氨酸标签相比，V5 tags在真核蛋白的鉴定分析中具有更好的特异性，由于只有14个氨基酸，V5标签的插入几乎对重组蛋白的结构没有影响。标签多肽的使用使本领域的技术人员可以应用商品化的标签抗体快速地鉴定出外源蛋白的表达情况。到目前为止，标签蛋白及其抗体大多使用在对目的蛋白的定性分析中，很少用于对目的蛋白的定量分析。本发明建立了一种对溶液中融合有V5标签重组蛋白的通用、快速、简便、准确的定量方法，并且提供了应用本检测方法测定目的蛋白的一套试剂系统；与较多使用的“双抗夹心法”相比，“竞争法”只用一种商业化抗便可完成对目的蛋白的定量分析。

发明内容
本发明的目的之一是提供一种融合有V5标签重组蛋白的ELISA定量检测试剂盒。实现上述目的的技术方案如下一种融有V5标签蛋白的ELISA定量检测试剂盒，其包括有(A)包被有V5多肽的微孔板，每个微孔包被100 μ L的V5多肽，V5多肽的浓度为 0. 015μ g/mL-2y g/mL ；(B)lmg/mL的抗-V5多肽单克隆抗体的工作浓度的稀释比例为1 500-64000， 用量为每微孔100 μ L。本发明的另一目的是提供一种融有V5标签的蛋白的ELISA检测方法。实现上述目的的技术方案如下一种融有V5标签的蛋白的检测方法，包括以下步骤(1)用待测样品对抗-V5多肽单克隆抗体进行稀释，得混合液，抗-V5多肽单克隆抗体(lmg/mL)的稀释比例为1 500-64000 ；混合液4°C孵育过夜；(2)在包被有V5多肽的微孔板中每孔加入100 μ L上述混合液，37°C孵育0. 8-1. 2 小时；所述微孔板每孔包被V5多肽100 μ L，V5多肽的浓度范围为0. 015 μ g/mL-2 μ g/mL ；(3)清洗，每孔加入羊抗鼠IgG-HRP抗体，37°C孵育；清洗后加入TMB底物溶液显色；(4)于各反应孔中加入终止液反应，在酶标仪450nm波长下检测OD值。优选地，所述V5多肽的浓度为0. 125 μ g/mL-0. 5 μ g/mL,最优选为0. 25 μ g/mL ；所述抗-V5多肽单克隆抗体的工作浓度为0. 25-1 μ g/mL，最优选的工作浓度为0. 5 μ g/mL。本发明的有益效果如下(1)与“双抗夹心法”相比，仅使用V5多肽标准品及其商品化抗体便可实现对液体中目的蛋白的精确定量，无须使用目的蛋白的特异性抗体；(2)原材料使用少，该方法中商品化多肽及其抗体的使用量较低，如V5多肽包被浓度为0. 25 μ g/mL, V5单抗的使用浓度为0. 5 μ g/mL,对于重组蛋白的定量分析，使用 2. 5μ g的多肽抗体，便可对约80个样品进行定量分析，试剂盒组装成本低；(3)分析了细胞上清中其它蛋白成分(FBQ对该检测方法准确性的影响，发现不同倍数稀释的FBS对标准曲线的建立无影响，重组蛋白所在溶剂中的FBS对V5多肽与其抗体的免疫结合无影响，同时也说明应用V5标签进行免疫反应的特异性较好，这一实验证明该方法对V5融合蛋白定量分析的准确性和可靠性；(5)可以分析溶液中低至0. 15ng/mL的目的蛋白，可以用于定量分析微量表达的融合蛋白；该试剂盒的检测范围是0. 1 2. Ong/mL，线性范围足以检测细胞表达上清中目的蛋白的含量。


图1 “棋盘滴定”法确定最佳的抗原抗体用量；图2血清对标准曲线干扰的分析；图3不同样品稀释倍数下的ELISA标准曲线；图4 ELISA标准曲线。
具体实施例方式本发明中所用到的包被缓冲液、清洗液、酶标反应板、封闭液、TMB底物、羊抗鼠 IgG-HRP抗体等是本领域中ELISA法公知的试剂。可购买也可以自己配制。实施例1一、方法与步骤1.应用“棋盘滴定”法确定抗原与抗体使用浓度(1)将已精确定量的干粉状态的V5多肽(GKPIPNPLLGLDST，Sigma公司产品)稀释为％ig/mL，再用包被液(包被缓冲液)将浓度为％ig/mL的V5多肽液稀释为2 μ g/mL, 1 μ g/mL,0. 5 μ g/mL,0. 25 μ g/mL,0. 125 μ g/mL,0. 062 μ g/mL,0. 03 μ g/mL,0. 015 μ g/mL, 共8个浓度梯度，每孔100 μ L横向加于酶标反应板中，4°C包被过夜；(2)倾去包被缓冲液，用清洗液清洗3次，加入100 μ L含5% BSA的PBST溶液(封闭液)，37°C封闭1小时；C3)倾去封闭液，用清洗液再次清洗2次；将Anti_V5 monoclonal antibody(抗V5 多肽单克隆抗体，浓度为lmg/mL，Sigma公司产品)用PBST稀释为1/500，1/1000，1/2000， 1/4000,1/8000,1/16000,1/32000,1/64000，共8个浓度，每孔100 μ L纵向加于酶标反应板中，37°C孵育1小时；(4)清洗液洗涤三次，每孔加入羊抗鼠IgG-HRP抗体100 μ L，37°C孵育1小时；(5)清洗液洗涤三次，于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液100 μ L，室温孵育10 20分钟；(6)终止反应，于各反应孔中加入2mo 1/L H2S0450 μ L (终止液)；在酶标仪450nm 波长下检测吸光度OD值，打印结果；(7)选择各行OD 450为1. 0左右时V5多肽与anti-V5 antibody的稀释倍数做竞争ELISA，取半数抑制(IC50)最低的V5多肽与anti-V5 antibody的稀释倍数为其最佳工作参数。2.对分泌蛋白的定量分析步骤建立(1) “竞争ELISA”标准曲线的建立用倍比稀释的标准样品(V5多肽)绘制竞争ELISA的可测量的线性范围；同时分析FBS是否影响定量结果，做了以下分析a.分析“棋盘滴定”数据，根据技术人员的积累的经验，确定一个最佳的抗原(V5 多肽，最佳值为 0. 25 μ g/mL)和最适的抗体浓度(Anti-V5monoclonal antibody, 0. 5 μ g/ mL)。适量稀释％ig/mL的V5多肽至0. 25 μ g/mL,按每孔100 μ L滴加于酶标板中，4°C包被过夜；同时用含有不同含量的对照溶剂(即含有10% FBS的细胞培养基或蛋白透析液，用 PBS 稀释为1/25，1/50，1/100，1/200，1/400)对 ant i-V5monoclonal antibody 进行 2000 倍稀释，分别用以上溶液稀释V5多肽标准品，至浓度为(16ng/mL、8ng/mL、4ng/mL、2ng/mL、 lng/mL、0. 5ng/mL、0. 25ng/mL、0. 125ng/mL)，形成 V5-anti-V5antibody、混禾口液。一个浓度的对照溶剂对应两个重复的标准品，4°C预孵育过夜(方法如图1所示)；b.清洗液(PBST)清洗3次，100 μ L封闭液37°C封闭1小时；c.充分清洗后，将a.中“V5-anti_V5 antibody混和液”按每孔100 μ L加于酶标反应板中，37°C孵育1小时；d.清洗液清洗三次，每孔加入羊抗鼠IgG-HRP抗体100 μ L，37°C孵育1小时；清洗三次后，加入TMB底物溶液100 μ L，显色；e.于各反应孔中加入2mo 1/L (终止液)50 μ L终止反应，在酶标仪450nm 波长下检测OD值，记录结果。以结合率Β/Β0 )为纵坐标(B是V5多肽不同标准浓度的 0D450,B0是不加V5多肽的0D450)，以不同浓度V5多肽的值为横坐标，绘制标准抑制曲线， 进行相关回归分析，计算出相关系数。(2)竞争性ELISA对分泌蛋白的定量根据上述分析，确定一个最佳的V5抗原和V5抗体的包被浓度，确定一个最佳的样品稀释倍数或稀释范围-25，50，100，200，400倍稀释样品，根据上述操作步骤绘制标准曲线的线性范围确定融合有V5标签重组蛋白的浓度值。Office Excel 2003分析结果。二、结果分析与应用1.最适抗原包被量与最适抗体浓度通过“棋盘滴定”法确定最适的抗原包被量与液相中抗体的稀释倍数。不同浓度包被抗原(V5多肽)与不同稀释倍数抗体的组合所测OD值如表1。取半数抑制(IC50)最低的V5多肽与anti-V5 antibody的稀释倍数为其最佳工作参数，根据表中数据分布，本试验选择0D450 = 1. 815处对应的抗原抗体稀释值作为最佳参数(优选的参数)V5多肽包被浓度为 0. 25 μ g/mL, anti-V5 antibody 稀释倍数为 2000 (浓度为 0. 5 μ g/mL)。表1 “棋盘滴定”法确定最佳的抗原包被量与抗体稀释倍数*
权利要求
1.一种融有V5标签蛋白的ELISA定量检测试剂盒，其特征是，包括有(A)包被有V5多肽的微孔板，每个微孔包被100μ L的V5多肽，V5多肽的浓度为 0. 015μ g/mL-2y g/mL ；(B)lmg/mL的抗-V5多肽单克隆抗体的工作浓度的稀释比例为1 500-64000，用量为每微孔100 μ L。
2.根据权利要求1所述的融有V5标签的蛋白的ELISA定量检测试剂盒，其特征是，所述V5多肽的包被浓度为0. 125 μ g/mL-0. 5 μ g/mL,所述抗-V5多肽单克隆抗体的工作浓度为 0.25-1 μ g/mL。
3.根据权利要求2所述的融有V5标签的蛋白的ELISA定量检测试剂盒，其特征是，所述V5多肽的包被浓度为0. 25 μ g/mL。
4.根据权利要求1-3任一项所述的融有V5标签的蛋白的ELISA定量检测试剂盒，其特征是，所述抗-V5多肽单克隆抗体的工作浓度为0. 5 μ g/mL。
5.一种融有V5标签的蛋白的检测方法，其特征是，包括以下步骤(1)用待测样品对抗-V5多肽单克隆抗体进行稀释，得混合液，lmg/mL的抗-V5多肽单克隆抗体稀释比例为1 500-64000 ；混合液4°C预孵育过夜；(2)在包被有V5多肽的微孔板中每孔加入100μ L上述混合液，37°C孵育0. 8-1. 2小时；所述微孔板每孔包被V5多肽100 μ L，V5多肽的浓度为0. 015 μ g/mL-2 μ g/mL ；(3)清洗，每孔加入羊抗鼠IgG-HRP抗体，37°C孵育；清洗后加入TMB底物溶液显色；(4)于各反应孔中加入终止液反应，在酶标仪450nm波长下检测OD值。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征是，所述V5多肽的包被浓度为0.25 μ g/mLo
7.根据权利要求5所述的检测方法，其特征是，所述抗-V5多肽单克隆抗体的工作浓度为 0. 5 μ g/mL。
全文摘要
本发明公开了一种融合有V5标签重组蛋白的ELISA检测试剂盒和方法，该方法用待测样品对抗-V5单克隆抗体进行稀释，得混合液，抗-V5单克隆抗体的工作浓度为1∶500-64000；在包被有V5多肽的微孔板中每孔加入100μl上述混合液，孵育；所述微孔板每孔包被V5多肽100μL，V5多肽的浓度为0.015μg/mL-2μg/mL 0.25μg/mL；清洗；检测OD值。所述ELISA方法的具有快速、简便、能准确的定量的优点，所述试剂盒检测范围可达0.1～2.0ng。
文档编号G01N33/68GK102445545SQ20111028398
公开日2012年5月9日 申请日期2011年9月22日 优先权日2011年9月22日
发明者徐晓鹏, 李中圣, 王霞, 陈孝明 申请人:广东现代农业集团研究院有限公司