专利名称：用作肺癌标记物的asc的制作方法
用作肺癌标记物的ASC本发明涉及有助于评估与肺有关的癌症或肺癌(=LC)、尤其是评估非小细胞肺 癌(NSCLC)的方法。其公开了作为LC、尤其是NSCLC的标记物的“包含胱天蛋白酶相关募 集域的凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis—associated speck-like protein containing a caspase-associated recruitment domain)，，(ASC)的用途。此夕卜，其尤其涉及通过测量来 源于个体的液体样品中的ASC，评估样品的肺癌的方法。ASC的测量可例如用于肺癌的早期 检测或用于经历手术患者的监测。尽管在检测和治疗中的进步，但癌症依然是主要的公众卫生挑战。在各种类型的 癌症中，LC为西方世界的常见癌症，并且属于癌症相关死亡率的最常见原因。大部分原因 是由于对于该疾病的早期检测的诊断空白。LC在其早期阶段大部分为无症状的。所有肺癌 的大多数在晚期检测到，此时该疾病已变为不能手术治疗的。大多数LC肿瘤可分为小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)。SCLC占所有 肺癌病例的约20-25%。SCLC为攻击性神经内分泌型LC，并具有非常差的预后，即使是在 早期阶段检测到。SCLC几乎不能通过切除来根治。由于该疾病发展的速度，SCLC —般仅使 用两个时期(即限制疾病和广泛疾病)，而不用更复杂的TNM分期系统(见下文)来分类。 约75-80%的LC病例归类到NSCLC类中，包括鳞状细胞癌(癌=CA)、腺CA (包括腺泡CA、 乳头状CA、支气管肺泡肿瘤、实体瘤和混合亚型的亚类)，以及大细胞癌(包括巨细胞瘤、透 明细胞CA、腺鳞CA和未分化CA的亚类)。NSCLC，如果在晚期检测到，也具有非常差的预后。癌症的分期依据程度、进展、细 胞类型和肿瘤等级对疾病分类。其将癌症患者分组，使得可对治疗的预后和选择进行归纳。现今，TNM系统是最为广泛使用的分类系统，该系统基于癌症的解剖学程度。其代 表国际认可的、统一的分期系统。存在三个基本变量T(原发性肿瘤程度)、Ν(区域淋巴结 状态)和M(存在或不存在远端转移)。
Μ标准由UICC (国际抗癌联盟(International Union Against Cancer))，版本，1997 (Sobin，LH.，和 Fleming，I. D.，TNM 80(1997) 1803-4) 公布。原发性肿瘤的手术切除已广泛接受为选择用于早期NSCLC的治疗。随着NSCLC的 进展，更具体为从 IIIa 期(T3N1M0，T1N2M0, T2N2M0, T3N2M0)向 IIIb 期(T4N0M0，T4N1M0, T4N2M0)转变，促使医师方法的明显改变。然而，如果癌症在更早期(Ia-IIIa;优选最早 T3WM0期)间检测到，5年存活率在35%至80%间变化。在Ia期((T1N0M0)；小肿瘤尺寸， 无转移)的检测明显具有最佳的预后，5年成活率高达80%。手术很少(如果有过的话)用于处理Inb-IV期的NSCLC。IV期对应于远端转移， 即疾病传播到肺和区域淋巴结外。在较后期III和IV的5年存活率分别降至低于15%和之间。尤其重要的是，NSCLC的早期诊断转化为好得多的预后。早在Ia(TlNOMO)、 Ib (T2N0M0)、IIa(TmiMO)、lib (T3N0M0)和 IIIa(T3mM0)期确诊的患者，如果治疗适当，在 诊断后具有高达80%的机会存活5年。这相比于当远端转移已经存在时确诊的患者少于
的5年存活率相当可观。
本发明的LC早期评估是指在如以上定义的Ia和IIIa之间肿瘤期评估。优选的是，在Ia和IIIa之间的时期评估LC。大多数肺癌在其变得具有症状时检测到。目前的检测方法包括胸部X射线、螺旋 计算机X线层扫描术、痰细胞学和支气管镜检(bronchioscopy)。然而，关于这些方法对普 查的适用性存在争议。很多用于肺癌的血清肿瘤标记物在临床中使用。cytoceratin 19的可溶性30kDa 片段(CYFRA 21-1)、癌胚抗原(carcinoembryogenic antigen) (CEA)、神经元特异性烯醇 化酶(NSE)和鳞状细胞癌抗原(SCC)是最突出的LC标记物。然而，它们中没有一个满足 筛查工具所需的灵敏度和特异性标准(Thomas，L.，Labor和Diagnose (2000)TH Books Verlagsgese1lschaft, Frankfurt/Main, Germany)。为了具有临床效用(clinical utility)，作为单个标记物的新型诊断标记物应当 与本领域内已知的其他标记物相当，或更好。或者，如果分别地将新型标记物单独使用或与 一种或多种其他标记物组合使用，则其应当导致诊断灵敏度和/或特异性的提高。最好通 过其受试者工作特性(将在下面进行详细地描述)评估检测的诊断灵敏度和/或特异性。全血、血清或血浆是临床常规中最广泛使用的样品来源。可有助于可靠的癌症检 测或提供早期预后信息的早期LC肿瘤标记物的鉴定，可导致产生可大大促进该疾病的诊 断和控制的方法。因此，存在提高LC的体外评估的紧迫临床需要。提高LC的早期确诊尤 其重要，因为对于早期确诊的患者，存活的机会与在疾病的进展期(progressed stage)诊 断的患者相比要高得多。尤其存在对用于LC治疗的可靠监测、用于针对LC筛查个体以及 用于LC治疗后检测肺癌的复发的方法的紧迫需要。最近已对生物化学标记物在肺癌中的临床效用进行了综述。(Duffy，Μ. J.， Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences 38(2001)225-262)。CYFRA 21-1目前被认为是当前已知的肺癌肿瘤标记物中最好的标记物。即使其不 是器官特异性的，但在肺组织中显著存在。CYFRA21-1对肺癌的灵敏度在95%的针对其他 良性肺病的特异性下被描述为在46-61%之间。增加的CYFRA 21_1血清水平还与明显的良 性肝病、肾功能不全和浸润性膀胱癌有关。CYFRA 21-1检测被推荐用于术后的治疗监测。CEA属于胎儿癌性抗原类群，通常在胚胎发生过程中产生。CEA不是器官特异性的 并且主要用于结直肠癌的监测。除了恶性肿瘤外，还有几种良性疾病例如肝硬化、支气管 炎、胰腺炎和自身免疫疾病与增加的CEA血清水平有关。在对于良性肺病95%的特异性下， 其对于肺癌的灵敏度据报导为四-44%。CEA的优选用途是肺癌的治疗监测。NSE为SCLC的肿瘤标记物。通常，发现增加的NSE血清水平与神经外胚层和神经 内分泌瘤有关。还在具有良性肺病和脑病(例如脑膜炎或脑的其他炎性疾病以及对头的跌 打损伤)的患者中发现增加的血清水平。虽然对于SCLC(在95%的特异性下)的灵敏度据 报导为60-87%，但NSE检测NSCLC的性能差(7-25%的灵敏度)。NSE被推荐用于SCLC的 治疗监测。ProGRP为肿瘤标记物，可用于SCLC的检测和监测。还在良性肺/胸膜疾病(例如 特发性肺纤维化或结节病)患者中发现增加的血清水平。虽然proGRP在SCLC(在95%的 特异性下)方面的灵敏度据报导为47-86%，但在NSCLC方面proGRP检测的性能为差的，因 为灵敏度据报道为低于10%。
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SCC最初在子宫颈的鳞状细胞CA中鉴定出。SCC对LC的灵敏度通常为低的 (18-27% )0因此，SCC检测被认为是不适合用于筛查的。然而，由于对鳞状细胞CA有较高 的灵敏度，SCC的优选用途为治疗监测，尽管CYFRA 21-1通常表现得更佳。关于标记物特征和针对提高的肺癌的诊断，公布了使用基于�：呒У姆掷嗨� 法来组合CYFRA 21-1、NSE和C反应蛋白(CRP)(其为一般炎症标记物)的血清水平的方法 (Schneider, J.等，Int. J. Clin. Oncol. 7 (2002) 145-151) 该作者报导了在 95% 的特异性 下的92%的灵敏度。然而，在该研究中，例如CYFRA 21-1作为单个肿瘤标记物的灵敏度据 报导在95%的特异性下为72%，这比在许多其他报导的研究中的显著更高。Duffy、M.J.在 Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences 38 OOOl) 225-262 中报导了 46% 至61%的灵敏度。fikhneider等获得的该异常高的性能引起了一些怀疑且可归因于几个 因素。第一，对照患者群体似乎比患者群体更年轻，即群体年龄不十分匹配，并且患者群体 包括许多晚期的。第二且更重要的是，在训练集的样品上检查算法的性能，所述样品用于确 定�：呒南薅ù�(fuzzy logic qualifier)。因此，这些限定词严格来说是针对该集 “专门定制的”并且不用于独立的验证集。在正常情况下，势必期望用于更大的、独立的且充 分平衡的验证集的相同算法将导致显著降低的总体性能。本发明的任务是调查生物化学标记物是否可被鉴定，该标记物可用于评估LC。令人惊讶地，已发现使用标记物ASC (包含CARD的凋亡相关斑点样蛋白)可至少 部分克服现有技术中当前已知的标记物的一些问题。本发明涉及用于体外评估肺癌的方法，其包括测量样品中ASC的存在和/或浓度， 以及将测量结果，尤其是测定的浓度用于肺癌评估中。在优选实施方案中，所述新型标记物ASC可用于监测以及筛查目的。当用于患者监测时，本发明的诊断方法可有助于在患者的随访中评估肿瘤负荷、 治疗的有效性和肿瘤复发。增加的ASC水平直接与肿瘤负荷相关。在化学治疗后，ASC的 短期(数小时至14天)增加可当作肿瘤细胞死亡的指标。在患者的随访中(从3个月至 10年)，ASC的增加可用作肿瘤复发的指标。在一个优选的实施方案中，本发明的诊断方法用于筛查目的。即，其通过测量ASC 的水平并使所测的水平与是否存在LC关联，用于评估受试者而无需预先诊断LC。本发明还涉及通过生物化学标记物体外评估LC的方法，其包括测量样品中ASC和 LC的一种或多种其他标记物的存在和/或浓度，以及将测量结果，尤其是测定的浓度用于 LC的评估中。优选LC的一种或多种其他标记物选自CYFRA 21_l、CEA、NSE、proGRP和SCC。本发明还涉及将标记物组用于LC的评估中，该标记物组包括ASC和一种或多种另 外的标记物，其中优选的另外标记物选自CYFRA 21-1、CEA、NSE、proGRP和SCC。在一个优选的实施方案中，本发明还涉及包括至少ASC和CYFRA 21_1的标记物组 在LC的评估中的用途。本发明还涉及包括至少ASC和CEA的标记物组在LC的评估中的用途。本发明还涉及包括至少ASC和SCC的标记物组在LC的评估中的用途。本发明还涉及用于进行本发明方法的试剂盒，其包括至少特异地测量ASC所需的 试剂和用于进行该测量的任选的辅助试剂。本发明还提供用于进行本发明方法的试剂盒，其包括至少分别特异地测量ASC和CYFRA 21-1所需的试剂和用于进行该测量的任选的辅助试剂。本发明还提供用于进行本发明方法的试剂盒，其包括至少分别特异地测量ASC和 CEA所需的试剂和用于进行该测量的任选的辅助试剂。本发明还涉及用于进行本发明方法的试剂盒，其包括至少分别对特异地测量ASC 和SCC所需的试剂和用于进行该测量的任选的辅助试剂。在一个优选的实施方案中，本发明涉及用于体外评估肺癌的方法，其包括在样品 中测量a) ASC和b)肺癌的任选的一种或多种其他标记物的存在和/或浓度，以及c)将测 量结果，尤其是步骤(a)和任选步骤(b)中测定的浓度用于肺癌的评估中。术语“测量”包括样品中ASC的定性或定量测量。在一个优选实施方案中，所述 测量为定性或半定量测量，即确定ASC是否存在或确定ASC的浓度是高于还是低于截断值 (cut-off value) 0如本领域技术人员将理解的，在是_(存在)或否_(不存在)测定中， 通常将测定灵敏度设置以匹配截断值。可以例如根据健康个体组的检测来确定截断值。优 选将截断值设置以产生90 %的特异性，还优选将截断值设置以产生95 %的特异性，或还优 选将截断值设置以产生98%的特异性。出现高于截断值的值可以例如指示肺癌的存在。在 另外的优选实施方案中，所述测量为定量测量。在该实施方案中，ASC的浓度与基本诊断问 题如例如疾病阶段、疾病进展或对治疗的反应相关。“包含胱天蛋白酶相关募集域的凋亡相关斑点样蛋白”(ASC)，也称为“甲基化诱导 性沉默靶标1"(TMSl) (Swiss-PROT :Q9ULZ3)由SEQ ID NO 1中所给的序列表征。ASC具有 21，627Da的理论分子量和pH 6. 29的理论等电点。胱天蛋白酶相关募集域(CARD)介导衔接蛋白例如APAFl (凋亡蛋白酶活化因子1) 与参与凋亡的胱天蛋白酶的原形式(pro-form)(例如CASP 9)之间的相互作用。ASC为包 含CARD的衔接蛋白家族的成员。通过免疫筛选早幼粒细胞的细胞系，Masumoto等分离出编码ASC的cDNA。所述推 导出的195个氨基酸的蛋白包含N端热蛋白样域(PYD)和87个残基的C端CARD。Western 印迹分析显示22-kDa蛋白的表达，并表明ASC可通过增加白血病细胞系对抗癌药物的凋 亡刺激的易感性而具有促凋亡活性(proapoptotic activity) (Masumoto, J，等，J.Biol. Chem. 274(1999)33835-33838)。Conway等的甲基化敏感型限制性PCR和甲基化特异性PCR(MSP)分析表明ASC的 沉默与CpG岛环绕外显子1的超甲基化相关，以及DNMTl (DNA胞嘧啶-5-甲基转移酶-1) 的过表达促进ASC的超甲基化和沉默。乳腺癌细胞系但非正常乳腺组织显示ASC的完全甲 基化并且不表达ASC信息。ASC在乳腺癌细胞系中的表达抑制生长并减少存活集落的数量。 Conway等得出的结论是，ASC起促进依赖胱天蛋白酶的凋亡的作用以及ASC的过表达抑制 乳腺癌细胞的生长(Conway，K. E.，等，Cancer Research 60(2000)6236-6242) McConnell和Vertino表明ASC的诱导表达抑制细胞增殖并诱导DNA片段化，这 可由胱天蛋白酶抑制剂阻断。免疫荧光显微表明凋亡的诱导引起从散布于细胞质的表达向 球状核周聚集的 CARD 依赖性转变(McConnel 1, B. B.和 Vertino，P.M.，Cancer Research 60(2000)6243-6247)。Moriani等不仅在乳腺癌细胞中而且在胃癌中都观测到了 ASC基因 的甲基化。他们提出ASC基因的异常甲基化在乳腺癌和胃癌的进展中的直接作用涉及促凋 亡 ASC 基因的减量调节(Moriani, R.，et al. , Anticancer Research 22(2002)4163-8)。
Conway等检验了初生乳腺组织的TMSl甲基化，并将结果与健康组织中的甲基化 对比(Conway K. Ε·，等，Cancer Research 6(^2000)6236-6242)。Levine 等发现 ASC 沉 默与特定CpG位点的甲基化无关，而与ASC CpG岛的密集甲基化相关。包含专一甲基化的 ASC拷贝的乳腺肿瘤细胞系并不表达ASC，而在部分地甲基化的细胞系中，ASC表达的水平 与存在于细胞群体中甲基化的ASC等位基因的百分比直接相关(Levine，JJ.，等，Oncogene 22(2003)3475-3488)。Virmani等检验了 ASC在肺癌和乳腺癌组织中的甲基化情况。他们发现ASC的异 常甲基化在46%的乳腺癌细胞系和32%的乳腺肿瘤组织中存在。在非恶性乳腺组织中甲 基化很罕见(7% ) (Virmani, A.，等，Int. J. Cancer 106(2003) 198-204)。aiang等描述了作为肿瘤阻抑基因的ASC，该基因在非小细胞肺癌(NSCLC)中常被 启动子的重新甲基化失活。该作者得出的结论是，ASC启动子超甲基化在原发性NSCLC患 者中为常见事件，原发性NSCLC与低存活率相关(aiang，Ζ.，等，Clin Lung Cancer. 8(1) (2006)62-65)。Shiohara等发现ASC的增量调节与炎症和人嗜中性粒细胞的凋亡紧密相关 (Shiohara, M.，等，Blood 98 (2001) 229a)。Masumoto等观察到在上皮细胞和白细胞中大量表达高水平的ASC(Masumoto，J.， 等，Journal of Histochemistry and Cytochemistry 49(2001) 1269-1275)。WO 2006/066915A1和WO 2006/066917A2描述了作为肿瘤标记物指示结直肠癌的 ASC。WO 2005/040806A2公开了 ASC为用于诊断乳腺癌的合适标记物。在WO 2008/063655中描述了通过检测样品中核酸的超甲基化和一个或多个基因 的由此引起的沉默，鉴定转移和尤其是微转移的方法。其中作为基因提到了 ASC。WO 01/29235公开了用于诊断癌症的方法，其包括在如例如血液的样品中 ASC(TMSl)-基因的甲基化水平的确定或TMSl表达概况的测量。后者包括TMSl多肽的测 量，由此低浓度的TMSl由癌症疾病的存在所致。Machida 等，Cancer Research,第 66 卷，12 期，2006 年 6 月(2006-06)，第 6210-6218页，教导了 ASC的超甲基化的联系(association)。因此，ASC超甲基化尤其与 发展的肿瘤期相关。有意思的是，上述资料中无一提出ASC在组织提取物和体液中的确定可评估肺 癌。意想不到的是，在本发明中发现ASC在组织溶胞产物样品和/或体液中的存在和/或 量的确定可评估肺癌。此外，本发明人发现通过测量来自个体的液体样品内的ASC，LC的可 靠测量是可能的，即当将蛋白ASC用作标记物时，在LC的诊断中无需组织和活体解剖样品。 更意想不到的是，发现根据个体体液测到的增加的ASC水平与肺癌有关。对本领域技术人员显而易见的，本发明不应理解为限制于SEQ ID NO 1的全长蛋 白ASC。本发明还包括ASC的生理或人工片段、ASC的二级修饰物以及ASC的等位基因变 体。人工片段优选包括合成或通过重组技术产生的肽，其至少包括一个诊断感兴趣的表位， 该表位由如来源于SEQ ID NO :1中公开的序列的至少6个连续氨基酸组成。这种片段在免 疫测定中可有利地用于产生抗体或用作标准物。更优选所述人工片段包括至少两个感兴趣 的表位，其适于建立夹心免疫测定。
本文所用以下术语每个在该节中具有与其有关的意思。冠词“一”和“一个”在本文中用于指一个或多个(即至少一个)冠词的语法宾语。 例如，“标记物”意指一个标记物或多个标记物。术语“至少”用于表示任选地一个或多个另 外的对象可存在。例如，包括至少(标记物)ASC和CYFRA 21-1的标记物组可任选地包括 一种或多种其他标记物。表述“一个或多个”表示1至50个，优选1至20个，还优选2、3、4、5、6、7、8、9、10、 12或15个。本文中使用的术语“标记物”或“生物化学标记物”是指被用作用于分析患者试样 的靶标的分子。在一个实施方案中，这种分子靶标的实例是蛋白质或多肽。在本发明中用 作标记物的蛋白质或多肽预期包括所述蛋白质的天然存在的变体以及所述蛋白质或所述 变体的片段，尤其是免疫学可检测片段。免疫学可检测片段优选包括所述标记物多肽的至 少6、7、8、10、12、15或20个连续氨基酸。本领域技术人员认识到由细胞释放的或存在于细 胞外基质中的蛋白质可在例如炎症期间被破坏，并且可被降解或被切割成这种片段。某些 标记物以无活性的形式合成，其随后可通过蛋白酶解激活。如本领域技术人员理解的，蛋白 质或其片段还可作为复合体的部分存在。这种复合体在本发明的意义上也可用作标记物。 标记物多肽的变体由相同基因编码，但例如因被选的mRNA或前mRNA加工而可在其等电点 (=PI)或分子量(=MW)或两者上不同。变体的氨基酸序列与相应的标记物序列具有 95%或更多的同一性。此外，或备选地，标记物多肽或其变体可具有翻译后修饰。优选的翻 译后修饰为糖基化、酰基化和/或磷酸化。优选所述标记物ASC通过使用特异性结合剂由样品特异地测量。特异性结合剂为例如ASC的受体、结合ASC的凝集素或抗ASC的抗体。特异性结 合剂对其相应的靶分子具有至少IO7Vmol的亲和力。特异性结合剂优选对其靶分子具有 IO8Vmol或也优选IO9Vmol的亲和力。如本领域技术人员理解的，术语特异性用于表示存 在于样品中的其他生物分子不显著结合特异于ASC的结合剂。优选的是，对除了靶分子外 的生物分子的结合水平分别导致至多仅为10%或更少，仅为5%或更少，仅为2%或更少或 仅为或更少的对靶分子的亲和力的结合亲和力。优选特异性结合剂将满足上述关于亲 和力以及特异性的最低标准。特异性结合剂优选是与ASC反应的抗体。术语抗体是指多克隆抗体、单克隆抗体、 这种抗体的抗原结合片段、单链抗体以及指包含抗体的结合结构域的基因构建体。可使用保持特异性结合剂的上述标准的任何抗体片段。通过现有技术方法，例如， 如 Tijssen(Tijssen, P. , Practice and theory of enzyme immunoassays,11, Elsevier Science Publishers B. V.，Amsterdam，整本书，特别地第43-78页)中描述的方法，产生 抗体。此外，本领域技术人员十分了解基于可用于抗体的特异性分离的免疫吸附剂的方法。 通过此类方法，可提高多克隆抗体的质量，从而增强它们在免疫测定中的性能。(Tijssen， P.，同上，第108至115页)。为了达到本发明中公开的效果，可使用在兔子中产生的多克隆抗体。然而，也很 显然，还可使用来自不同物种例如大鼠或豚鼠的多克隆抗体以及单克隆抗体。因为单克隆 抗体可以以任何需要的量和恒定的性质产生，它们在临床常规测定的开发中代表理想的工 具。在根据本发明方法中抗ASC的单克隆抗体的产生和应用分别代表了其他优选实施方
8案。如本领域技术人员现将认识到的，ASC已被鉴定为可用于肺癌评估的标记物，各种 免疫诊断方法可用于达到可与本发明的效果相当的结果。例如，可使用产生抗体的备选策 略。这种备选策略包括除其他以外，合成肽的使用，该合成肽代表用于免疫的ASC的表位。 或者，可使用也称为DNA疫苗接种的DNA免疫。为了测量，将获自个体的样品在适合于结合剂ASC-复合体形成的条件下与ASC 的特异性结合剂一起温育。这种条件无需详细说明，因为本领域技术人员无需任何发明努 力就可容易地确定这种合适的温育条件。在肺癌的评估中测量和使用结合剂ASC-复合体 的量。本领域技术人员理解的是，存在许多测量特异性结合剂ASC-复合体的量的方法， 其全都详细地描述于相关教科书(参见，例如，Tijssen, P.，同上，或Diamandis，Ε. P.，和 Christopoulos, Τ. K.(编辑)，Immunoassay, Academic Press, Boston (1996))中。优选在夹心类型测定形式中检测ASC。在这种测定中，将第一特异性结合剂用于将 ASC捕获在一侧，并且将经标记可被直接或间接检测的第二特异性结合剂用于另一侧。在优选实施方案中，样品中ASC的测量通过使用夹心免疫测定进行，其中使用链 霉抗生物素包被的微量滴定板。在该夹心测定中，生物素化抗ASC多克隆抗体用作捕获抗 体，地高辛化(digoxigenylated)抗ASC多克隆抗体用作第二特异性结合配偶体。形成的 该夹心复合体最后通过抗-地高辛配基辣根过氧化物酶缀合物和合适的过氧化物酶底物 可视化。如上所述，可测量来源于个体样品的液体样品的ASC。在LC的诊断中，无需组织和 活体解剖样品来提供(apply)标记物ASC。在优选实施方案中，用血清作为液体样品材料实施本发明方法。在另外的优选实施方案中，用血浆作为液体样品材料实施本发明方法。在另外的优选实施方案中，用全血作为液体样品材料实施本发明方法。在另外的优选实施方案中，用乳头抽吸液作为液体样品材料实施本发明方法。在本发明的情况下，“肺癌的标记物”为以下任何标记物，其在LC的评估中如果与 标记物ASC组合则可增加相关信息。如果通过将所述标记物包括在已包括标记物ASC的标 记物组合中，分别可提高对LC评估的灵敏度(在给定特异性下)，或特异性(在给定灵敏度 下)，则该信息被认为是相关的或具有相加值(additive value) 0优选灵敏度或特异性的 提高在ρ = . 05、. 02、. 01或更低的显著水平下分别为统计学显著的。优选的是，LC的一种 或多种其他标记物选自CYFRA 21-l、CEA、NSE、proGRP和SCC。本文中使用的术语“样品”是指为了体外评估目的而获得的生物样品。在本发明方 法中，样品或患者样品优选可包括任何体液或组织提取物。优选的检测样品包括血、血清、 血浆、痰和支气管灌洗物(bronchial lavage)。优选的样品为全血、血清、血浆、支气管灌洗 物或痰，血浆或血清是最优选的。术语“评估肺癌”用于表示本发明方法(单独地或与其他标记物或变量，例如由 UICC所提出的标准(参见上文)一起)例如帮助医师确立或确认LC的不存在或存在，或在 预后、复发的检测(术后患者的随访)、筛查和/或治疗、特别化学治疗的监测方面帮助医 师。如本领域技术人员将理解的，任何这种评估是在体外进行的。之后弃去患者样品。患者样品只用于本发明的体外诊断方法，并且不将患者样品的材料转移回患者体内。通常， 样品为液体样品，例如全血、血清或血浆。在优选实施方案中，本发明涉及用于通过生物化学标记物体外评估LC的方法，其 包括测量样品中ASC的浓度和将测定的浓度用于LC的评估。本发明的发明人意想不到地能够在显著百分比的来源于LC患者的样品中检测标 记物蛋白ASC。更意想不到的是，他们已能够证明ASC在获自个体的这种样品中的存在和/ 或浓度可用于肺癌的评估中。用于诊断的理想情形将是其中单个事件或过程可在例如感染性疾病中引起相应 疾病的情形。在所有其他情况下，正确的诊断可能非常困难，尤其当疾病的病因学未完全弄 清楚时，如对于LC的情况就是如此。如本领域技术人员所理解的，没有生物化学标记物对 于给定的多因子疾病例如LC的诊断既具有100%的特异性同时又具有100%的灵敏度。相 反，生物化学标记物，例如CYFRA 21-1、CEA、NSE、proGRP、SCC或如本文中所示的ASC，可用 于以某种可能性或预测值来评估例如疾病的存在、不存在或严重度。因此在常规临床诊断 中，通常在潜在的疾病的诊断、治疗和控制中同时考虑各种临床症状和生物学标记物。可单独地测定生物化学标记物或在本发明的优选实施方案中使用基于芯片或珠 粒的阵列技术同时测量它们。然后例如使用各标记物的各别的截断值(CUt-OfT)独立地解 释生物标记物的浓度，或将它们组合用于解释。在另外的优选实施方案中，在以下方法中进行本发明的LC评估，所述方法包括测 量样品中a) ASCjnb) —种或多种其他肺癌标记物的存在和/或浓度，以及c)将测量结果， 例如分别在步骤(a)和步骤(b)中测定的浓度用于肺癌的评估。在LC的评估中，标记物ASC在一个或多个下列方面中具有优势筛查；诊断辅助； 预后；治疗例如化学治疗、放射治疗和免疫治疗的监测。筛查筛查定义为就疾病的指标例如肺癌的存在鉴定个体(例如处于风险中的个体)的 检测的系统性应用。优选筛查群体由已知处于比肺癌的平均风险更高的风险中的个体(如 吸烟者、曾吸烟者(ex-smoker)和暴露于铀、石英或石棉的工人)组成。在一个优选的实施 方案中，将痰用作肺癌筛查的样品。对于许多疾�。分忻挥械ブ稚锘П昙俏锘嶙苁锹闵覆槟康乃璧牧槊� 度和特异性标准。这对于肺癌似乎也是如此。势必期望必须将包括多种标记物的标记物组 用于LC筛查。本发明中确立的数据表明标记物ASC将构成适用于筛查目的的标记物组的 整体中的部分(integral part)。本发明因而涉及ASC作为LC标记物组(即包括APEX和 一种或多种另外的用于LC筛查目的的标记物的标记物组)的一种标记物的用途。优选另 外的标记物选自 CYFRA 21-1、CEA、NSE、proGRP 和 SCC。诊断辅助标记物可以有助于特定器官中良性和恶性疾病的鉴别诊断(differential diagnosis)，有助于区分不同的组织学类型的肿瘤或在手术前建立基线标记物值。当今，用于检测肺癌的重要方法是放射学和/或计算机断层(CT)扫描。可通过这 些方法显现小瘤(small nodule)，即可疑组织的小区域。然而，许多此类小瘤_90 %以上 (通过CT)-代表良性组织变化，只有少数小瘤代表癌性组织。标记物ASC的使用可有助于良性和恶性小瘤的区分。在优选的实施方案中，将标记物ASC用于免疫组织学方法中，以便确立或确认不 同组织学类型的LC。因为作为单个标记物的ASC可能优于其他LC标记物，如CEA或NSE，所以预期ASC 可用作诊断辅助，特别通过在手术前建立基线值。本发明因此还涉及将ASC用于在LC的手 术之前建立基线值的用途。预后预后指标可定义为以一定的可能性预测疾病结果的癌症患者和其肿瘤的临床、病 理学或生物化学特性。它们的主要用途是帮助合理地计划患者管理，即分别避免对侵袭性 疾病的治疗不足和对怠惰性疾病(indolent disease)的治疗过度。Molina，R.等，Tumor Biol. 0003)24 :209-218 评估了 CEA、CA 125,CYFRA 21_1、SSC 和 NSE 在 NSCLC 中的预后值 (prognostic value) 0在他们的研究中，标记物NSE、CEA和LDH (乳酸脱氢酶)的异常血清 水平似乎预示较短的存活时间。由于单独ASC就显著促进LC患者与健康对照的鉴别，因此必须期望其将有助于评 估患有LC的患者的预后。术前ASC的水平最可能与一种或多种其他LC标记物和/或T匪 分期系统组合。在一个优选实施方案中，ASC用于LC患者的预后。化学治疗的监测Merle, P. Int. J. of Biological Markers (2004) 19 :310-315 已在用诱导化 疗法治疗的患有局部晚期NSCLC的患者中评估了 CYFRA 21_1血清水平的变化。他们得出 CYFRA 21-1血清水平的早期监测可为III期NSCLC患者中的肿瘤反应和存活的有用的预后 工具。此外，报告已描述了 CEA在监测LC患者的治疗中的用途(Fukasawa，Τ.等，Cancer & Chemotherapy (1986) 13 :1862-1867)。大多数此类研究为回顾的、非随机化的并且包括小 数量的患者。如在使用CYFRA 21-1的研究的情况下，CEA研究表明a)在接受化学治疗时 CEA水平降低的患者，通常具有比其CEA水平未能降低的患者更好的结果，以及(b)对于几 乎所有的患者，CEA水平的增加与疾病的进展相关。预期ASC将是分别与CYFRA 21-1或CEA至少一样好的用于化学治疗监测的标记 物。本发明因此还涉及ASC在监测处于化学治疗中的LC患者中的用途。随访大部分经历目的在于完全清除癌性组织的手术切除的LC患者，日后发生复发性 或转移性疾病(Wagner，H.，Chest (2000) 117 :110-118 ；Buccheri，G.等，Ann. Thorac. Surg. (2003)75 :973-980) 0大部分此类复发在术后首个2_3年内发生。由于如果检测得太迟，复 发性/转移性疾病常常是致命的，因此相当多的研究集中在处于早期以及由此潜在可治疗 阶段的LC复发上。因此，许多LC患者经历通常包括使用CEA的定期监测的术后监测程序。已显示手 术切除后一年使用CEA的系列监测，在大约97%的特异性下以大约的灵敏度检测到早 期术后复发/转移性疾�。踔猎谝伤浦⒆椿蛱逭鞑淮嬖诘那榭鱿�(BuCCheri，G.等，Arm. Thorac. Surg. (2003) 75 :973-980)。因此，术后LC患者的随访是合适的生物化学标记物的 最重要的应用领域之一。由于ASC在被调查的LC患者中的灵敏度高，所以ASC单独或与一 种或多种其他标记物组合将极大地有助于LC患者、尤其是术后LC患者的随访。包括ASC和一种或多种其他LC标记物的标记物组在LC患者的随访中的用途代表了本发明的另外的 优选实施方案。本发明在优选实施方案中涉及ASC分别在LC诊断领域或LC评估中的用途。在另外的优选实施方案中，本发明涉及作为用于肺癌的标记分子的ASC与一种或 多种用于肺癌的标记分子联合在评估来源于个体的液体样品的肺癌的用途。优选选择的可 与ASC的测量组合的其他LC标记物是CYFRA 21-1, CEA、NSE、proGRP和/或SCC。用于评 估LC的另外的优选标记物组包括ASC和至少一种选自CYFRA 21-1和CEA的其他标记分子。如本领域技术人员理解的是，存在许多使用两种或更多种标记物的测量以改进调 查中的诊断问题的方法。在相当简单但通常有效的方法中，如果样品对至少一种被调查的 标记物是阳性的，则假定为阳性结果。这可以例如是当诊断感染性疾病如AIDS时的情况。然而，常常评估标记物的组合。优选将对标记物组的标记物例如ASC和CYFRA 21-1测得的值算术组合，并且使组合的值关联于基本诊断问题。可通过任何合适的现有 技术数学方法来组合标记物值。用于将标记物组合关联于疾病的熟知的数学方法采用如 以下的方法判别分析(discriminant analysis, DA)(即线性-、二次_、正则化-DA)、核 方法(Kernel Method)(即SVM)、非参数法(即k_最近邻分类器(k-Nearest-Neighbor Classifiers))、PLS(偏最小二乘法)、基于树的方法(Tree-Based Methods)(即逻辑回归、 CART (Random Forest Methods) ^Boosting ^ /(Bagging Methods))、 广义线性模型(即逻辑回归)、基于主分量的方法Principal Components based Method) (即SIMCA)、广义加法模型、基于�：呒姆椒�(Fuzzy Logic based Methods)、基于神 经网络禾口遗传算法的方法(Neural Networks and Genetic Algorithms based Methods)。 本领域技术人员在选择合适的方法以评估本发明的标记物组合方面将没有问题。优选用于 使本发明的标记物组合例如与LC的不存在或存在关联的方法，选自DA(即线性-、二次-、 正则化判别分析)、核方法(即SVM)、非参数法(即k-最近邻分类器)、PLS(偏最小二乘 法)、基于树的方法(即逻辑回归、CART、随机森林法、Boosting法)或广义线性模型(即 逻辑回归)。关于此类统计方法的详细内容见于下列参考文献=Ruczinski, I.，等，J. of Computational and Graphical Statistics,12(2003)475-511 ；Friedman, J. H. , J. of the American Statistical Association 84(1989) 165-175 ；Hastie，Trevor, Tibshirani， Robert， Friedman， Jerome， The Elements of Statistical Learning， Springer Series in Statistics (2001) ；Breiman，L.，Friedman，J. H.，Olshen，R. A.，Stone，C. J. (1984) Classification and regression trees，California :Wadsworth ；Breiman, L，Random Forests，Machine Learning，45(2001) 5-32 ；Pepe，M. S.，The Statistical Evaluation of Medical Tests for Classification and Prediction， Oxford Statistical Science Series 28(2003)；禾口 Duda，R. 0.，Hart，P. E.，Stork，D. G.，Pattern Classification，Wiley Interscience,^ 2 片反(2001)。本发明的优选实施方案是对生物学标记物的潜在组合使用最优化的多变量截止 值，并区分状态A与状态B (例如区分患病的与健康的)。在该类型的分析中，标记物不再是 独立的而是形成标记物组。诊断方法的精确度最能通过其受试者工作特性(ROC)来描述(特别地参见Zweig， Μ. H.，和 Campbell，G.，Clin. Chem. 39(1993)561-577)。ROC 图是由在整个观察到的数据范围内连续改变判定阈产生的所有灵敏度/特异性对的曲线。实验室检测的临床性能取决于其诊断精确度或正确地将受试者分类至临床相关 亚组的能力。诊断精确度衡量检测正确区分被调查受试者的两种不同状况的能力。这种状 况为例如健康和疾病或良性疾病对恶性疾病。在各种情况下，ROC曲线通过在全部的判定阈范围内以灵敏度对1-特异性作图来 描述两种分布之间的重叠。在y轴上为灵敏度或真阳性分数[定义为(真阳性检测结果的 数目)/(真阳性检测结果的数目+假阴性检测结果的数目)]。这也称为在疾病或病症存在 时的阳性。其只根据受侵袭的亚组来计算。在χ轴上为假阳性分数或1-特异性[定义为 (假阳性结果的数目)/(真阴性结果的数目+假阳性结果的数目)]。其是特异性的指数并 且完全根据未受侵袭的亚组来计算。因为通过使用来自两个不同亚组的检测结果完全分别 地计算真阳性分数和假阳性分数，所以ROC曲线不依赖于样品中疾病的患病率。ROC曲线上 的各点代表相应于特定判定阈的灵敏度/1-特异性对。具有完美区分(结果的两种分布中 无重叠)的检测具有通过左上角的ROC曲线，其中真阳性分数为1.0或100% (完美的灵敏 度)，并且假阳性分数为0(完美的特异性)。无区分(两组结果的相同分布)的检测的理 论曲线是从左下角至右上角的45°对角线。大部分曲线落在这两个极端之间。(如果ROC 曲线完全落在45°对角线以下，则这可容易地通过将“阳性”标准从“大于”反转为“小于” 或反之亦然来矫正。)就定性而言，曲线越接近左上角，检测的总体精确度越高。定量实验室检测的诊断精确度的一种优选方法是通过单个数字表示其性能。这样 的总体参数例如为所谓的“总误差”或“曲线下面积=AUCTH最普遍的全局测量是ROC 曲线下面积。按常规，该面积总是> 0.5(如果不是，可反转决策规则来使其>0.5)。值在 1.0(两组的检测值完全分离)至0.5(两组检测值之间无显著分布差异)之间。面积不仅 取决于曲线的特定部分例如离对角线最近的点或在90%特异性下的灵敏度，而且还取决于 整个曲线。这是ROC曲线有多接近于完美曲线(面积=1.0)的定量描述性公式。在优选实施方案中，本发明涉及通过分别测量样品中至少ASC和CYFRA 21_1以及 任选CEA、proGRP、NSE和/或SCC的浓度，然后使测定的浓度与是否存在LC关联来提高对 LC相对于健康对照的诊断精确度的方法，与基于任何单种单独研究的标记物的分类相比， 所述提高导致更多的患者被正确地分类为患有LC或健康对照。在本发明的优选方法中，分别测定至少生物标记物ASC和CYFRA 21-1的浓度，并 且将标记物组合用于评估LC。在本发明的另外的优选方法中，分别测定至少生物标记物ASC和CEA的浓度，并且 将标记物组合用于评估LC。在本发明的另外的优选方法中，分别测定至少生物标记物ASC、CYFRA 21-1和CEA 的浓度，并且将标记物组合用于评估LC。在本发明的另外的优选方法中，分别测定至少生物标记物ASC、CYFRA 21_1和 proGRP的浓度，并且将标记物组合用于评估LC。在本发明的另外的优选方法中，分别测定至少生物标记物ASC、CYFRA 21-1和SCC 的浓度，并且将标记物组合用于评估LC。提供下列实施例和图来帮助理解本发明，其真实范围陈述于所附权利要求中。应 当理解，可对所述的方法中进行改变而不背离本发明的精神。
附图简述
图1为显示ASC浓度与肺癌存在的相关性的图。525. lpg/ml的截断值对LC的存 在为显著的。对60个得自LC( “癌症”)患者的样品和60个得自30个明显健康个体和30 个明显健康吸烟者的样品进行ASC测量。图2表示与60个得自30个明显健康个体和30个明显健康吸烟者的对照样品相 比，关于60个得自LC患者样品的评估的受试者工作特性(ROC)的曲线。图3表示与50个得自明显健康个体的对照样品相比，关于365个得自LC患者样 品的评估的受试者工作特性(ROC)的曲线。
实施例实施例1ASC作为肺癌标记物的鉴定用于LC-ESI-MSMS分析的样品制备^ ffi Bio-Rad protein assay (目 5 ^ :500-0006 ；Bio-Rad Laboratories GmbH, Munchen, Germany)，按照制造商手册的说明测定组织样品中可溶蛋白级分的蛋白浓 度。向体积对应于200 μ g的蛋白加入4ml还原缓冲液(9M尿素，2mM DTT，IOOmM KH2PO4,NaOH pH 8. 2)，温育 1 小时。在 Amicon .⑧ Ultra 设备(Millipore GmbH, Schwalbach, Germany) 中将该溶液浓缩至50 μ 1，随后为了烷化，转移至0. 5ml样品缓冲液(9M尿素，4mM碘乙酰 胺，IOOmM KH2PO4, NaOH pH 8.2)中，温育6小时。烷化后，将该溶液在Amicon Ultra设 备中浓缩至50 μ 1，加入0. 5ml 9M尿素IOmM KH2PO4, NaOH pH 8. 2，随后再次将该溶液浓缩 至50μ1。重复该过程两次。随后用4yg胰蛋白酶(蛋白组学等级，Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)在水中将最终的50 μ 1稀释至990 μ 1，消化过夜。LC-ESI-MSMS 分析将该胰蛋白酶消化物(100μ 1)在 Nano-LC 系统(Ultimate，Famos, Switchos ；LC Packings, Idstein,Germany)上通过二维HPLC(MudPIT)分离。用自组装的二维柱(熔融二 氧化硅PicoFrit 75 μ m，New Objective ；RP =ProntoSil 120-5-C18 AQ+, Bischoff ；SCX Partisil 10,Whatman)进行该分离。通过连续渐增的NH4Ac的量(0_1500mM)的洗脱步骤， 产生IlSCX级分。将它们在所述柱的RP部分进一步分离，并使用依靠数据的用ESI-MS离 子阱(LCQ deca XP ；Thermo Electron，Massachusetts，USA ；参数见表 1)的扫描在线分析。 对各样品进行三次运行。使用^^仙计作为基本算法，用非商用的Roche自身的数据管理 系统处理原始数据(参数见表1)。合并根据重复运行的鉴定的肽和蛋白的所得列表。在表1中鉴定和给出的序列的帮助下，鉴定蛋白ASC。ASC作为肺癌标记物的检测对各患者，将来自肿瘤样品的鉴定的蛋白和相应肽的数量与来自相邻正常组织的 相应结果作比较。通过该方法，发现蛋白ASC在肿瘤组织中特异存在或非常丰富，但在健康 对照组织中却检测不到或基本检测不到。在来自患有肺癌的患者的肿瘤组织中强烈过量呈现蛋白ASC。通过数据库搜索方 式LCQ-MS2数据鉴定在肿瘤组织中的蛋白ASC的下列肽序列使用上述方法鉴定下列来源 于ASC的序列。
表1 由ESI-MSMS鉴定的序列
权利要求
1.一种用于体外评估肺癌的方法，所述方法包括(a)在选自体液和/或组织提取物的样品中测量包含胱天蛋白酶相关募集域的凋亡相 关斑点样蛋白(ASC)的浓度，(b)任选测量一种或多种关于肺癌的其他标记物的浓度，和(c)将步骤(a)和任选的步骤(b)的测量结果用于肺癌的评估中，其中ASC的检测指示肺癌。
2.权利要求1的方法，其中所述一种或多种其他标记物选自CYFRA21-1、CEA、NSE、 proGRP 和 SCC。
3.权利要求2的方法，其中所述一种或多种其他标记物为CYFRA21-1。
4.权利要求2的方法，其中所述一种或多种其他标记物为CEA。
5.权利要求2的方法，其中所述一种或多种其他标记物为SCC。
6.包含胱天蛋白酶相关募集域的凋亡相关斑点样蛋白(ASC)在体外在选自体液和/或 组织提取物的样品中评估肺癌的用途，其中ASC的检测指示肺癌。
7.包括包含胱天蛋白酶相关募集域的凋亡相关斑点样蛋白(ASC)和一种或多种关于 肺癌的其他标记物的标记物组在体外在选自组织提取物和体液的样品中评估肺癌的用途， 其中ASC的检测指示肺癌。
8.权利要求7的标记物组的用途，其中所述一种或多种其他标记物选自CYFRA21-1、 CEA、NSE 禾口 SCC。
9.权利要求8的标记物组的用途，其中所述标记物组包括至少ASC和CYFRA21_1。
10.权利要求1-5中任一项的方法或权利要求6-9中任一项的用途，其中所述体液选自 血清、血浆和/或血液。
11.一种用于进行权利要求1-5中任一项的方法的试剂盒，所述试剂盒包括特异测量 至少包含胱天蛋白酶相关募集域的凋亡相关斑点样蛋白(ASC)所需的试剂。
全文摘要
本发明涉及肺癌的评估。其公开了蛋白ASC在肺癌评估中的用途。其还涉及使用来源于个体的液体样品，通过测量所述样品中的ASC，在体外评估肺癌的方法。ASC的测量可例如用于肺癌患者的早期检测或随访。
文档编号G01N33/574GK102138074SQ200980127004
公开日2011年7月27日 申请日期2009年7月1日 优先权日2008年7月3日
发明者H·安德烈斯, J·卡尔, M·塔克, M·罗斯勒, M-L·哈格曼 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司
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