专利名称：合成的hcv包膜蛋白和它们用于接种的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于肝炎病毒学领域。本发明涉及合理设计的合成E2蛋白质的氨基酸序列，所述E2蛋白质包含在来源于全世界的77种不同HCV 1b分离株的E2中发现的最保守氨基酸的共有序列。更具体地，本发明涉及包含合成的E2蛋白质的疫苗。
背景技术：
丙型肝炎病毒(HCV)是单链正RNA病毒，其已经被分类为黄病毒科属成员(Bartenschlager和Lohmann，2000 J Gen.Virology；81 Pt 71631-48)。它的基因组由高度保守的5’非编码区，接着是单个的大约10,000个核苷酸的可读框组成，所述可读框被翻译成3010-3033个氨基酸的多蛋白前体。随后通过宿主和HCV编码的蛋白酶的酶切割(Hijikata等，1991PNAS USA 88，5547-51；Lin等，1994 J.Virology 68，5063-73；Lin等，1994 J.Virology 68，8147-57 Grakoui等，1993 PNAS USA 90，10583-7；Grakoui等，1993 J Virology 67，2832-43)产生至少10种不同的多肽，其可以分成结构核心和包膜蛋白以及非结构蛋白质解旋酶，蛋白酶，依赖于RNA的RNA聚合酶。由此构成HCV病毒体(Miyamura和Matsuura，1993 Trends Microbiology 1(6)229-31；Bartenschlager和Lohmann，2000 J.Gen.Virology；81 Pt 71631-48)。由于它产生导致慢性肝病和有时肝细胞癌(Hoofnagel，1997 Hepatology 26(3 Suppl 1)15S-20S)的严酷感染的能力，HCV是主要的公共卫生忧虑。目前，抗病毒疗法是不足的，因此开发改善的疗法和有效的HCV疫苗是高度优先的(关于综述参见Rosen和Gretch，1999 Mol Med Today 5(9)393-9)。
包括HCV疫苗的有效抗HCV药物的开发受HCV作为一组至少6种来源于基因型1-6的不同蛋白质存在的事实阻碍(Simmonds等，1993 J.ofGen.Virology 74，2391-9)。感染HCV的个体可能包含来源于一种显性基因型的不同HCV准种的谱系，这增加了另外的复杂度(Forns等，1999Trends Microbiology 7(10)402-10)。HCV的这种内在的超突变可能性是由HCV RNA聚合酶的低保真度导致(NS5B；Bartenschlager和Lohmann，2000 J.Gen.Virology；81 Pt 71631-48)。因此，某些大概本质上是亲水的和表面表达的HCV肽基序是免疫原性但高度易变的，可以逃脱免疫监视。符合这些性质的一个基序已经被定义为(coin)高变区I(HVR 1)并组成在包膜蛋白E2的N’-末端处27个氨基酸的一段序列。HVR1包含许多T和B细胞表位(Weiner等，1992 PNAS USA89(8)3468-72；Scarselli等，1995 J Virology 69(7)4407-12；Zibert等，1995 Virology 208，653-61)并且针对该区域的抗体已经显示抑制HCV与人成纤维细胞的结合和感染(Zibert等，1995 Virology 208，653-61；Shimizu等，1996 Virology 223(2)409-12)，在结合中和(NOB)测定中部分消除E2 CHO与MOLT-4细胞的结合(Rosa等，1996 PNAS USA 93，1759-63)，在免疫沉淀测定中捕捉HCV(Esumi等，1996 J Virol Methods 59(1-2)91-8)和改善至少部分，在黑猩猩中的HCV感染性(Farci等，1994 PNAS USA 91(16)7792-6；Farci等，1996 PNAS USA 93，15394-9；Shimuzu等，1996 Virology 223(2)409-12)。
许多努力致力于研究作为候选疫苗的HVR1，例如，Goto等(2001Hepatology Research 19270-283)用合成的HVR1肽免疫黑猩猩并获得保护。Carlos等(2000，Vaccine Weekly，July 26，17页)报导设计一种合成的构建体，其结合许多通常在病毒高变区中发现的突变。该肽构建体包括在病毒的HVR1和HVR2中发现的物质。
另外认为涉及HCV中和的重要区域存在于HVR1之外，因为包含E1/E2的保护性疫苗产生具有对于HVR1的极低结合效价的超免疫血清(Choo等，1994 PNAS USA 901294-1298)。然而Choo的疫苗仅对于HCV的同源毒株是保护性的。
已经进行数次尝试将E2蛋白质用于免疫。Bukh等在WO 200121807中公开了编码缺少HVR1的HCV的核酸分子和它的免疫用途。Zucchelli等，(2001 Hepatology 33692-703)公开了某种HVR1肽模拟物(模拟表位(mimotopes))，其与E2蛋白质的胞外域融合，能够诱导强烈的体液反应。
因此似乎E2包膜蛋白总体上代表中和HCV感染的可行的靶位点。因此，开发作为适于异种HCV亚型的预防以及治疗疫苗的适当E2抗原是极其重要的。
发明概述本发明涉及合成的E2蛋白质的氨基酸和推断的核酸序列，所述合成的E2蛋白质(“E2多数(majority)”)包含在77种不同HCV 1b分离株的E2中发现的最保守氨基酸的共有序列。本发明还涉及缺少HVR1的截短的E2蛋白质(“E2多数w/o”)的氨基酸和推断的核苷酸序列以及E2多数蛋白质的氨基酸和推断的核苷酸序列，其中用R9模拟表位(Puntoriero等，The EMBO Journal 17卷，No.13，3521-3533页，1998)替代HVR1(“E2多数R9”)。本发明还涉及与公开序列具有至少98％同源性的本发明E2多数蛋白质的变体。
本发明另外涉及来源于本文公开序列的蛋白质。
这些蛋白质可以通过将编码本发明的E2蛋白质的核酸序列插入表达载体和在宿主细胞中表达重组蛋白质的重组方法生产。
本发明的一个方面涉及这些蛋白质作为疫苗的应用。
本发明的另一方面涉及包含编码本发明E2蛋白质的核酸序列的表达载体作为基于核酸的疫苗的应用。
本发明另外涉及包含本发明的蛋白质的药物组合物，其用于预防或治疗个体中的丙型肝炎。
本发明的蛋白质还可用于检测生物样品中HCV特异的抗体。因此可以在HCV感染的治疗期间作为诊断工具来鉴定和监视HCV感染，疾病进展和治疗剂的功效。
本发明的另一方面是用于检测生物样品中HCV特异的抗体的试剂盒，其中所述试剂盒实质上包含纯化和分离的本发明的蛋白质。
本发明的另一方面涉及对于本发明E2蛋白质的抗体和该抗体在被动免疫疗法或预防中的应用。
附图简述
图1.E2多数，E2多数R9和E2多数-w/o的氨基酸序列。在推定的糖基化位点下面划线。
图2.蛋白质印迹照片，其显示不同HCV血清基因型与各种E2蛋白质的反应性。在非还原条件下在SDS-PAGE凝胶上跑纯化的杆状病毒生产的HCV E2蛋白质(泳道1-4)，哺乳动物中国仓鼠卵巢(CHO)细胞生产的E2(泳道5)，和非相关的阴性对照蛋白质硫氧还蛋白(泳道6)，并用代表HCV基因型1a，1b，2a/2c，3a，4，5和6的不同的人血清探测。对照包括下列各项抗组氨酸单克隆抗体(α-His mAb)，ABXTL68人抗E2mAb，作为阳性对照，抗HCV阴性(α-HCV-ve)和抗乙型肝炎核心阳性(α-HBC+ve)血清被包括作为阴性对照。
图3.蛋白质印迹照片，其显示不同HCV血清基因型与各种E2蛋白质的反应性。在非还原条件下在SDS-PAGE凝胶上跑纯化的杆状病毒生产的天然E2和E2多数蛋白质(泳道1和2)，和非相关的阴性对照蛋白质硫氧还蛋白(泳道3)，并用代表HCV基因型1b，2a/2c，3a，和4的不同的人血清探测。ABXTL68人抗E2 mAb，作为阳性对照。
图4.是通过用各种E2蛋白质免疫稚鼠产生的超免疫血清的结合性能的图示。在(A)中使用包被各种抗原的ELISA平板检验结合。每个框表示用于包被的不同抗原。数据表示为作为血清稀释度的函数的O.D.测量。在(B)中使用蛋白质印迹检验结合，其中在凝胶上跑各种E2制剂并与不同的超免疫血清反应。
图5.是小鼠单克隆抗体与各种E2制剂和作为阴性对照的硫氧还蛋白的结合性能的图示。mAb 18是针对天然E2产生的并且mAb 21是针对E2多数R9产生的。使用蛋白质印迹检验结合，其中在凝胶上跑各种E2制剂并且与不同单克隆抗体反应。印迹左侧的数字表示以KD表示的估计的分子量。
图6.是在移植后第19天在它们的血清中具有阳性HCV RT-PCR信号的HCV-Trimera小鼠的平均病毒负荷和百分比(圆括号中的数字)的图示。线条表示不同的实验组其中移植的肝脏用HCV感染血清和免疫前血清(对照)预先温育的组；和其中移植的肝脏用HCV感染血清和各种抗E2IgG制剂预先温育的组。
现在将参考下列实施例，其是为了举例说明而不是意图限制本发明而提供。
实施例本发明涉及意外的发现即合成的，非天然修饰的E2蛋白质(“E2多数”，“E2多数R9”和“E2多数w/o”)被从感染各种HCV基因型的患者获得的血清和来源于感染各种形式的E2的小鼠的超免疫血清识别。此外，这些合成蛋白质可以引起能够中和动物模型中HCV感染的强烈的免疫应答。这些结果提示合成的E2蛋白质的独特结构可以引起针对各种形式的E2的免疫应答，因此使其成为疫苗的理想候选物。
材料和方法所有常规材料购自Sigma(Israel)。哺乳动物E2 CHO购自AustralBiologicals(CA)。
以下所述的所有表达和纯化方法涉及本发明公开的所有类型的E2(E2多数，E2多数R9和E2多数w/o)以及天然E2。
合成HCV E2 cDNA的产生1.E2-多数R9该构建体是使用2个分开的PCR反应，#1和2，通过循环PCR合成的。在PCR反应#1中，在单个管子中将下列5个有意义和5个反义引物混合在一起引物数据被删除在这第一个PCR中，以25pmol/μl的储存浓度将所有有意义(1-5号)和反义引物(1-5号)混合在一起。取3μl混合引物的等分试样用于PCR，其使用下列程序使用Bio-X-Act DNA聚合酶(Bioline，London，UK)95℃，3分钟，94℃ 30秒，58℃ 30秒，72℃ 1分钟，30次，接着72℃延伸5分钟。
在PCR#1后，取出1μl等分试样用于使用外部旁侧的小寡核苷酸的PCR#2。在该反应中，有意义引物是5’cgc-gga-tcc-cag-acc-acc-gtg-gtt-g 3’，反义引物是5’ccg-gaa-ttc-tta-tca-gtg-gtg-gtg-g 3’。使用的PCR条件与用于PCR#1的相同，除了程序包括20个循环以外。在1％琼脂糖凝胶上进行PCR片段电泳，在UV下用溴化乙锭显现并纯化，随后用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen，Hilden，Germany)克隆。用BamHI和EcoRI限制酶酶切纯化的片段并连接于预先用BamHI和EcoRI消化的杆状病毒表达质粒pAcGP67B(Pharmingen，USA)之中。
2.E2-多数w/o使用下列有意义和反义引物在先前所述包含E2多数R9 cDNA的重组质粒pGP67B上进行PCR删除引物数据PCR条件与上述反应#1相同。将产生的PCR片段凝胶纯化，用BamHI和EcoRI消化并连接于同样消化的pAcGP67B质粒中。
3.E2多数结合使用限制酶消化和循环PCR构建E2多数。
a)用BamHI和AscI限制酶完全消化E2多数R9。在1％琼脂糖凝胶上将消化物电泳并切除和纯化较大的～10kb的片段。
b)如反应#1使用下列具有25链节突出端的19x～50链节的寡核苷酸进行循环PCR反应删除引物数据在1％琼脂糖凝胶上将产生的～400bp片段进行电泳，纯化，用BamHI/AscI消化并再纯化。其后将该片段连接到先前产生的消化的E2多数R9质粒中(上述部分(a))。在转化到大肠杆菌感受态细胞中后，培养细菌克�。掷胫柿NA并进行DNA测序。将与预测DNA序列匹配的克隆进一步培养并提取质粒DNA以产生重组质粒pAcGP67B E2多数。
杆状病毒细胞系在补充yeastolate，乳白蛋白水解物，10％胎牛血清，和50μg/ml庆大霉素的Grace昆虫培养基(Biological Industries，BeitHaemek，Israel)(TNM-FH培养基)中维持SF9(草地夜蛾(Spodoptera frugiperda))贴壁细胞。这些细胞只用于涉及转染，终点稀释试验(EPDA)和产生高效价重组病毒的方案。维持作为贴壁或摇床培养物的High-Five细胞(粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)并在无血清培养基(Insect Xpress，Bio Whittaker，MD；Ex-Cell 405 media，JRH Biosciences，Andover UK)中培养。这些细胞用于蛋白质表达研究。所有细胞在27℃下在冷冻培养箱(VELP Scientific)中供养。
重组杆状病毒的产生所有重组杆状病毒是使用线性化的BaculoGold试剂盒(Pharmingen，San Diego)产生的。按照Pharmingen的指导手册进行EPDA和产生高效价重组病毒效价原液(2×108pfu/ml)的病毒扩增程序。
杆状病毒E2多数蛋白质的表达和纯化High-Five细胞的适应和感染在蛋白质表达研究之前，使High-Five细胞适应摇瓶。简单扼要地，将来自摇瓶(Corning Costar，MA)的贴壁细胞(106个细胞/ml)转移至11聚碳酸酯锥形瓶(Corning，MA)中，并在150rpm下在500ml无血清培养基中摇动24小时。其后将烧瓶移出，放置在组织培养橱(hood)中并倾斜5分钟以将细胞团块从非聚集细胞分离。去除纯系的单个细胞，转移至新锥形瓶，以1×106个细胞/ml的密度接种并用E2多数重组杆状病毒组感染，感染复数(MOI)＝3。在感染后3天，收获振荡培养物，在离心后收集上清液，无菌过滤并在4℃或-70℃下保存。
在杆状病毒E2多数感染的High-Five细胞上进行RT-PCR为了证实E2多数蛋白质的表达和纯化是来源于它特异的重组杆状病毒，在一些表达实验期间取出5×106个细胞并用于使用Tri-Reagent BD(Molecular Research Center，OH)的RNA分离。取出等分试样的RNA用于逆转录(RT)，其使用寡-dT(Promega，WI)作引物并用AMV和MLV逆转录酶(Promega，WI)催化。将cDNA用于使用pAcGP67B有意义和反义引物(参见以上)的PCR。PCR程序是94℃3分钟(1次)，94℃ 1分钟，58℃ 1分钟，72℃ 1.5分钟(33个循环)，接着是在72℃下5分钟的最终延伸步骤。将PCR片段凝胶纯化并进行使用pAcGP67B有意义和反义引物(参见以上)的直接DNA测序。
感染杆状病毒E2多数的上清液的浓度使用Vivaflow 50,200(Vivascience，UK)或Pellicon-XL 50(Millipore，MA)再生的纤维素浓缩器装置将各种体积的杆状病毒E2多数的上清液(250ml至71)浓缩～10倍。在4℃下将浓缩物用PBS或天然裂解缓冲液(NLB，pH＝8)透析过夜，所述缓冲液包含50mM NaHPO4，300mM NaCl，10mM咪唑。仅对于针对NLB透析后的物质，加入1/20稀释度的10％Triton-X-100的NLB溶液中。其后将所有透析物质无菌过滤并用于纯化。杆状病毒E2多数上清液的FPLC纯化通过镍(Ni-NTA)琼脂糖柱纯化在Pharmacia C柱中制备4.5-30ml镍-NTA琼脂糖(Qiagen，Hilden)柱。将柱与AKTA探测器(Pharmacia，NJ)连接并用3个柱体积的NLB以3ml/分钟的流速洗涤。将E2多数上清液以1-2ml/分钟的速率加样并用5个柱体积的包含20mM咪唑的NLB以3ml/分钟洗涤。用5个柱体积的包含300mM咪唑的NLB以3ml/分钟的流速洗涤E2多数。在280nm下测量洗脱级分的光密度，合并并在4℃下针对PBS彻底地透析。
通过链亲和素-琼脂糖偶联的抗E2 mAb 18柱纯化将25mg，纯化的mAb 18(参见以下)与1.25mg生物素(Pierce，Rockville，IL)偶联，并针对PBS彻底透析。通过温和搅拌将生物素化的mAb 18(22mg)与10ml链亲和素琼脂糖High Performance(Pharmacia，NJ)在室温下偶联30分钟，接着加样至HR 10/10-柱(Pharmacia，NJ)上。通过流过物质的分光光度测定(A280nm)证实结合的生物素化的mAb 18，并用PBS洗涤柱。将先前针对PBS透析的浓缩的E2上清液以2ml/分钟的速率加样到柱上。在用PBS 5个柱体积的洗涤后，用1ml 0.1M甘氨酸(pH＝3)的级分洗脱结合物质，并立即用50μl 1M Tris碱(pH＝9)中和。在280nm下测量洗脱级分的光密度，合并并在4℃下针对PBS彻底透析。蛋白质浓度的测定通过Bradford测定(Bio-Rad，CA)测定纯化的蛋白质的浓度。
免疫印迹分析将在还原(在360mM β-巯基乙醇的存在下95℃加热5分钟)或非还原条件(在无β-巯基乙醇的情况下37℃ 10分钟)下的补充LDS-加样缓冲液的粗制或纯化的蛋白质样品(100-200ng)加样到4-12％NuPAGE凝胶上并在MES电泳缓冲液(Novex，San Diego)中电泳。使用XCell II Blotmodule(Novex，San Diego)通过湿转移将蛋白质电印迹到硝化纤维膜，并4℃下在封闭缓冲液(PBS-0.04％ Tween-0.3％乳蛋白)中封闭过夜。在以0.02-2μg/ml加入五-组氨酸(Qiagen，Hilden)，小鼠或人抗E2 mAb后在新鲜封闭缓冲液中在室温下将印迹温育3小时。使用各种稀释度的HCV患者血清进行相同的方案。在封闭缓冲液中3次分开的5分钟洗涤后，将印迹与偶联过氧化物酶的山羊抗小鼠(1∶10,000)或山羊抗人IgG(1∶20,000；Zymed Incorporation，South San Francisco)温育并拿来用于增强化学发光(ECL)。
小鼠抗E2 mAb的产生免疫抗E2 mAb 18用10μg在完全弗氏佐剂(Difco Laboratories，Detroit，MI)1∶1体积中的E2通过爪垫免疫BALB/C(5周龄)。每2周用5μg在不完全弗氏佐剂(Difco Labroatories，Detroit，MI)1∶1体积中的E2通过爪垫加强免疫小鼠2次。在收获脾脏用于随后融合之前3天用1μg E2(静脉内)加强免疫小鼠。
超免疫血清和抗E2多数R9 mAb 21
用10μg E2或E2多数R9和100μg包含CpG(5′tcc-atg-acg-ttc-ctg-acg-tt 3′；Genset，France)和25μl 2％明矾(Sigma，MO)的硫代磷酸免疫BALB-C小鼠(5周龄)。在腹膜内免疫之前将该抗原混合物涡旋并放在冰上30分钟。在收获脾脏用于融合之前3天，用2μg抗原进一步静脉内免疫小鼠。
小鼠脾脏的融合将脾脏细胞与人-小鼠杂交骨髓瘤HMMA2.11 TG/0以3∶1的比率混合。使用50％(w/v)PEG 1500(Boehringer Mannheim GmbH，Mannheim，Germany)进行融合，并将融合的细胞以30,000个细胞/孔的浓度接种到96-孔U形底微量滴定板(Nunc.Inc)完全RPMI培养基中，所述培养基包含次黄嘌呤，氨基蝶呤和胸苷(HAT)添加物(1X)(Biological Industries，BeitHaemek，Israel)。1周后用新鲜HAT培养基喂养细胞。
融合后2周，收获上清液用于针对各种免疫原的ELISA以证明特异性抗体的存在。用新鲜的包含次黄嘌呤，胸苷(HT)的培养基补充培养基。通过在96 U形-底微量滴定板中以0.5个细胞/孔的有限稀释克隆分泌特异性抗E2或抗E2多数R9 mAb的杂交瘤培养物。
克隆18和21的腹水制剂用500μl降植烷(Sigma，MO)腹膜内注射BALB-C小鼠。10天后，腹膜内注射5×106特异的小鼠单克隆抗体。3-4周后，进行腹膜灌洗并去除腹水流体。
腹水流体的纯化用PBS 1∶1稀释腹水流体并以5ml/分钟加样到5ml Hi-trap蛋白质G柱(Pharmacia，NJ)上。在用40ml PBS洗涤后，用30ml 0.1M甘氨酸(pH＝2.7)洗脱结合的mAb并对PBS彻底透析。将MAb以1mg/ml的浓度-20℃保存。
ELISA
在4℃下用2μg/ml E2抗原的PBS溶液包被MaxiSorp ELISA平板(Nunc，Inc)(50μl/孔)过夜。在用200μl PBS/1％BSA/孔37℃封闭2小时后，在37℃下将连续稀释的小鼠血清(1∶100-1∶200,000)或纯化的mAb(1μg/ml)加入孔中2小时。在用PBS/0.04％吐温-20洗涤后，在37℃下加入1∶10,000稀释度的偶联过氧化物酶的山羊抗小鼠IgG(H+L)1小时，接着在450nm下使用3，3’，5，5’-四甲基-联苯胺二盐酸盐(TMB，Sigma，MO)作为底物的比色法。
实施例1通过比较77种不同E2蛋白质的氨基酸序列(来源于Genebank登记的序列)构建E2多数。选择在每个位点最频繁出现的氨基酸并相应地合成构建体。E2多数w/o是缺少包含HVR1的开始27个氨基酸的E2多数的截短形式。E2多数R9在HVR1区域包含先前鉴定的称为R9的HVR1模拟表位(27个氨基酸长)。E2多数，E2多数w/o和E2多数R9其它方面相同(图1；序列表SEQ ID NO.1描述E2多数，SEQ ID NO.2描述E2多数w/o并且SEQ ID NO.3描述E2多数R9)。在位置31(命名为X)处的氨基酸可以为苯丙氨酸(F)或异亮氨酸(I)。
合成的构建体是通过循环PCR方法产生。使用鸟枪法，将包含完整编码多数序列的具有20个链节5’和3’突出端的各个引物(～100链节)混合，并进行PCR(参见方法)。为了产生用于克隆到pAcGP67B中的最终PCR产物，设计较小的5’和3’引物，其包含5’BamHI和3’EcoRI编码位点。3’引物包含允许纯化的组氨酸标记。
将High-Five细胞作为振荡培养物培养并用重组E2(多数，多数R9或多数w/o)杆状病毒以感染复数(MOI)为3来感染。在随后72小时期间取出上清液样品并在蛋白质凝胶上用抗His或抗E2 mAb探测。早在感染后8小时，虽然非常微弱，观察到免疫反应性的E2(Mw＝50kD)，其增加一直到感染后72小时。随后选择该时刻收集上清液。
为了获得纯的E2多数蛋白质可以将包含蛋白质的上清液浓缩，透析，并加样到所述的镍-NTA琼脂糖柱或抗E2 mAb亲和柱上(参见方法)。可以将相同的流通(FT)，洗涤和洗脱(Eln)级分加样到分开的SDS-PAGE并分别进行抗His mAb反应性和考马斯蓝染色以检验纯化的效率。
实施例2为了研究合成的多数蛋白质的功能性，进行非还原性免疫印迹并用来源于各种HCV基因型的血清探测(图2和3)。在图2所示的蛋白质印迹中在凝胶上跑各种杆状病毒表达的E2制剂，等量(100ng)的E2 CHO和硫氧还蛋白。使用适当的血清稀释范围(1∶2,500-1∶10,000)，对于E2多数R9和E2多数w/o(泳道3和4)观察到与大多数检验血清型的强烈信号。其它E2蛋白质也显示与不同血清的反应性。泳道2中的E2 w/o HVR1制剂缺乏E2 N-末端的31个氨基酸，即HVR1+另外4个氨基酸，并且是唯一的不与血清反应的E2制剂。这间接暗示这4个氨基酸对于保存允许抗体识别的E2的正确构象是非常重要的。ABXTL68(0.5μg/ml)，一种完全的人抗E2 mAb作为阳性对照，而α-HCV阴性和α-HBC阳性血清(都为1∶2500的稀释度)作为阴性对照。
在分开的实验中，进行非还原性免疫印迹并用来源于HCV基因型1-4的血清探测(图3)。E2多数被所有血清型和ABXTL68识别。
实施例3用天然E2，E2多数R9，和E2多数w/o将小鼠免疫。从小鼠中获得超免疫血清并通过ELISA评估对固定的抗原的反应性。来源于用E2多数R9，和E2多数w/o免疫的小鼠的超免疫血清显示对所有4种杆状病毒生产的E2蛋白质的最高的反应性(图4A)。有趣地，对于哺乳动物E2(E2 CHO)也观察到显著的反应性，用来源于以天然E2免疫的小鼠的超免疫血清未观察到效果。对于硫氧还蛋白未观察到超免疫血清的反应性(图4A)。支持这些数据，在还原性SDS-PAGE上，来源于用E2多数R9或E2多数w/o免疫的小鼠的超免疫血清显示对于所有杆状病毒表达的E2抗原以及E2 CHO的特异的，广泛的反应性(图4B)。相反，来源于用天然E2免疫的小鼠的超免疫血清显示有限模式的反应性(图4B)。这些结果说明与天然E2相比，多数蛋白质能够诱导针对广泛范围的E2蛋白质的免疫应答，所述天然E2能够产生仅针对注射抗原的特异应答。广谱免疫应答说明作为疫苗多数蛋白质可具有比天然E2高的优势。
类似地，针对E2多数R9产生的单克隆抗体(mAb)与几种类型的E2反应，而针对天然E2产生的mAb在它们的识别范围方面更受限制。在用E2或E2多数R9免疫和随后脾脏融合后，产生两种不同mAb。在还原性SDS-PAGE上检验这些mAb的结合特性，α-E2 mAb 18只识别天然E2(具有或w/o HVR1)而抗E2多数R9 mAb 21识别所有杆状病毒表达的E2抗原以及E2 CHO(图5)。
实施例4使用下列HCV-Trimera动物模型表征针对各种E2制剂的血清的生物活性处理小鼠以便允许人肝脏片段的稳定移植。处理包括强烈照射，接着移植scid(重度联合免疫缺损)小鼠骨髓。使用HCV阳性人血清体外进行人肝脏片段的病毒感染(美国5,849,987)。
将0.5ml包含7.5×105HCV-RNA拷贝/ml和无可检测的抗E2 IgG的人血清样品与按照下列各项的各种抗血清室温预先温育3小时来源于用天然E2(300μg)免疫的小鼠的IgG级分；来源于用E2多数R9(300μg)免疫的小鼠的IgG级分；来源于用E2多数w/o(300μg)免疫的小鼠的IgG级分；作为阴性对照的免疫前血清。
随后将预温育的血清用于体外感染正常人肝脏片段。在感染后，将肝脏片段移植到小鼠中并在19天后测定血清中的HCV-RNA。图6显示各种抗E2抗体制剂在抑制HCV的肝脏感染中的作用，如通过平均病毒负荷和HCV-RNA阳性小鼠的百分比所证明。针对天然E2，E2-多数R9和E2-多数w/o产生的血清显著降低平均病毒负荷和感染动物的百分比。
序列表<110>XTL生物制药有限公司<120>合成的HCV包膜蛋白质用于接种<130>HCVvacIL<160>6<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>278<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(31)..(31)<223>合成的<400>1(E2多数)Thr Thr His Val Thr Gly Gly Ser Ala Ala Arg Thr Thr Ser Gly Phe1 5 10 15
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Ala Thr Tyr Thr Lys Cys Gly Ser Gly Pro Trp Leu Thr Pro Arg Cys210 215 220Leu Val Asp Tyr Pro Tyr Arg Leu Trp His Tyr Pro Cys Thr Val Asn225 230 235 240Phe Thr Ile Phe Lys Val Arg Met Tyr Val Gly Gly Val Glu His Arg245 250 255Leu Asn Ala Ala Cys Asn Trp Thr Arg Gly Glu Arg Cys Asp Leu Glu260 265 270Asp Arg Asp Arg Ser Glu275<210>2<211>251<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(4)..(4)<223>合成的<400>2(E2多数w/o)Ile Gln Leu Xaa Asn Thr Asn Gly Ser Trp His Ile Asn Arg Thr Ala1 5 10 15Leu Asn Cys Asn Asp Ser Leu Asn Thr Gly Phe Leu Ala Ala Leu Phe20 25 30
Tyr Thr His Lys Phe Asn Ser Ser Gly Cys Pro Glu Arg Met Ala Ser35 40 45Cys Arg Pro Ile Asp Lys Phe Ala Gln Gly Trp Gly Pro Ile Thr Tyr50 55 60Ala Glu Pro Gly Ser Ser Asp Gln Arg Pro Tyr Cys Trp His Tyr Ala65 70 75 80Pro Arg Pro Cys Gly Ile Val Pro Ala Ser Gln Val Cys Gly Pro Val85 90 95Tyr Cys Phe Thr Pro Ser Pro Val Val Val Gly Thr Thr Asp Arg Ser100 105 110Gly Ala Pro Thr Tyr Ser Trp Gly Glu Asn Glu Thr Asp Val Leu Leu115 120 125Leu Asn Asn Thr Arg Pro Pro Gln Gly Asn Trp Phe Gly Cys Thr Trp130 135 140Met Asn Ser Thr Gly Phe Thr Lys Thr Cys Gly Gly Pro Pro Cys Asn145 150 155 160Ile Gly Gly Val Gly Asn Asn Thr Leu Thr Cys Pro Thr Asp Cys Phe165 170 175Arg Lys His Pro Glu Ala Thr Tyr Thr Lys Cys Gly Ser Gly Pro Trp180 185 190Leu Thr Pro Arg Cys Leu Val Asp Tyr Pro Tyr Arg Leu Trp His Tyr195 200 205Pro Cys Thr Val Asn Phe Thr Ile Phe Lys Val Arg Met Tyr Val Gly210 215 220
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Asp Arg Asp Arg Ser Glu275<210>4<211>834<212>DNA<213>人工序列<400>4(E2多数)accacccacg tgaccggcgg cagcgccgcc cgcaccacca gcggcttcgc cagcctgttc 60agccccggcg ccaagcagaa cattcagctg tttaacacca acggtagttg gcacattaac120cgtacggccc tgaactgcaa cgatagcctg aatacggggt ttctggccgc cttgttctat180acgcataagt tcaactctag tggttgccca gaacgtatgg cgagctgccg tccgattgat240aaattcgcgc agggctgggg cccgattacc tatgcggaac cgggcagctc tgatcagcgt300ccgtattgct ggcattacgc gccacgtccg tgtggcattg tgccggcgag ccaagtttgt360ggcccggtgt attgcttcac cccgagcccg gtggtggtgg gtacgacgga ccgcagcggc420gcgccgacgt acagctgggg cgaaaacgaa accgacgttc tgttactcaa taatacgcgt480ccaccacaag gcaactggtt cggctgcacc tggatgaact ctacgggttt cactaaaacc540tgcggcggcc cgccgtgcaa cattggcggt gttggtaaca acaccctgac ctgcccgacc600gattgcttcc gtaaacaccc ggaagcgacc tataccaaat gcggctctgg cccgtggctg660accccgcgtt gcctggtgga ttatccgtat cgtctgtggc actatccgtg caccgtgaac720ttcaccattt tcaaagttcg catgtatgtt ggtggtgttg agcaccgtct caacgctgca780tgcaactgga cccgtggcga acgttgcgat ctggaagatc gtgatcgtag cgaa 834<210>5<211>834<212>DNA
<213>人工序列<400>5(E2多数w/o)cagaccaccg tggttggcgg tagccagtct cacaccgtgc gtggcctgac cagcctgttc 60agcccgggtg cctctcaaaa cattcagctg tttaacacca acggtagttg gcacattaac120cgtacggccc tgaactgcaa cgatagcctg aatacggggt ttctggccgc cttgttctat180acgcataagt tcaactctag tggttgccca gaacgtatgg cgagctgccg tccgattgat240aaattcgcgc agggctgggg cccgattacc tatgcggaac cgggcagctc tgatcagcgt300ccgtattgct ggcattacgc gccacgtccg tgtggcattg tgccggcgag ccaagtttgt360ggcccggtgt attgcttcac cccgagcccg gtggtggtgg gtacgacgga ccgcagcggc420gcgccgacgt acagctgggg cgaaaacgaa accgacgttc tgttactcaa taatacgcgt480ccaccacaag gcaactggtt cggctgcacc tggatgaact ctacgggttt cactaaaacc540tgcggcggcc cgccgtgcaa cattggcggt gttggtaaca acaccctgac ctgcccgacc600gattgcttcc gtaaacaccc ggaagcgacc tataccaaat gcggctctgg cccgtggctg660accccgcgtt gcctggtgga ttatccgtat cgtctgtggc actatccgtg caccgtgaac720ttcaccattt tcaaagttcg catgtatgtt ggtggtgttg agcaccgtct caacgctgca780tgcaactgga cccgtggcga acgttgcgat ctggaagatc gtgatcgtag cgaa 834<210>6<211>834<212>DNA<213>人工序列<400>6(E2多数R9)cagaccaccg tggttggcgg tagccagtct cacaccgtgc gtggcctgac cagcctgttc 60agcccgggtg cctctcaaaa cattcagctg tttaacacca acggtagttg gcacattaac120cgtacggccc tgaactgcaa cgatagcctg aatacggggt ttctggccgc cttgttctat180
acgcataagt tcaactctag tggttgccca gaacgtatgg cgagctgccg tccgattgat240aaattcgcgc agggctgggg cccgattacc tatgcggaac cgggcagctc tgatcagcgt300ccgtattgct ggcattacgc gccacgtccg tgtggcattg tgccggcgag ccaagtttgt360ggcccggtgt attgcttcac cccgagcccg gtggtggtgg gtacgacgga ccgcagcggc420gcgccgacgt acagctgggg cgaaaacgaa accgacgttc tgttactcaa taatacgcgt480ccaccacaag gcaactggtt cggctgcacc tggatgaact ctacgggttt cactaaaacc540tgcggcggcc cgccgtgcaa cattggcggt gttggtaaca acaccctgac ctgcccgacc600gattgcttcc gtaaacaccc ggaagcgacc tataccaaat gcggctctgg cccgtggctg660accccgcgtt gcctggtgga ttatccgtat cgtctgtggc actatccgtg caccgtgaac720ttcaccattt tcaaagttcg catgtatgtt ggtggtgttg agcaccgtct caacgctgca780tgcaactgga cccgtggcga acgttgcgat ctggaagatc gtgatcgtag cgaa 83权利要求
1.一种纯化和分离的E2蛋白质或其变体，所述E2蛋白质具有选自SEQ ID NO1-3的序列。
2.按照权利要求1的纯化和分离的E2蛋白质，其另外与另一种多肽连接。
3.一种组合物，其实质上包含按照权利要求1或2的E2蛋白质和适当的载体。
4.一种纯化和分离的核酸，其编码按照权利要求1或2的E2蛋白质。
5.一种纯化和分离的核酸，其编码按照权利要求1的E2蛋白质，其具有选自SEQ ID NO4-6的核苷酸序列。
6.一种表达载体，其包含按照权利要求4或5的核酸。
7.一种宿主生物，其用按照权利要求6的表达载体转化或转染。
8.一种E2蛋白质，其由权利要求7的宿主生物生产。
9.一种预防丙型肝炎的方法，其包含以能够刺激生产足够水平的保护性抗体的量对个体给药权利要求3的组合物。
10.一种治疗丙型肝炎的方法，其包含以能够引发针对HCV的免疫应答的量对HCV携带者给药权利要求3的组合物。
11.一种用于免疫个体抗丙型肝炎的疫苗，其实质上由药用载体中按照权利要求1或2的E2蛋白质组成。
12.一种组合物，其包含按照权利要求6的表达载体。
13.一种预防丙型肝炎的方法，其包含以能够刺激生产足够水平的保护性抗体的量对个体给药权利要求12的组合物。
14.一种治疗丙型肝炎的方法，其包含以能够引发针对HCV的免疫应答的量对HCV携带者给药权利要求12的组合物。
15.一种用于免疫个体抗丙型肝炎的疫苗，其实质上由药用载体中按照权利要求6的表达载体组成。
16.抗E2抗体，其具有对于选自SEQ ID NO1-3的E2氨基酸序列的特异的结合亲和力。
17.一种预防丙型肝炎的方法，其包含以有效保护所述个体免于HCV攻击的量对个体给药权利要求16的抗体。
18.按照权利要求1或2的E2蛋白质用于制备HCV疫苗组合物的应用。
19.按照权利要求1或2的E2蛋白质用于在慢性HCV携带者中诱导针对HCV的免疫的应用。
20.按照权利要求19的E2蛋白质的应用，其用于在其它任何治疗之前，同时，或之后在慢性HCV携带者中诱导针对HCV的免疫。
21.按照权利要求1或2的E2蛋白质的应用，其用于在肝脏移植之前或之后，或在推定的感染之后在感染HCV的个体中诱导针对HCV的免疫。
22.按照权利要求1或2的E2蛋白质用于预防性地诱导针对HCV的免疫的应用。
23.按照权利要求1-3中任何一项的E2蛋白质或组合物，其用作HCV疫苗。
24.按照权利要求1-3中任何一项的E2蛋白质或组合物，其用于在慢性HCV携带者中诱导针对HCV的免疫。
25.按照权利要求24的E2蛋白质或组合物，其用于在其它任何治疗之前，同时，或之后在慢性HCV携带者中诱导针对HCV的免疫。
26.按照权利要求1-3中任何一项的E2蛋白质或组合物，其用于在肝脏移植之前或之后，或在推定的感染之后在感染HCV的个体中诱导针对HCV的免疫。
27.按照权利要求1-3中任何一项的E2蛋白质或组合物，其用于预防性诱导针对HCV的免疫。
28.按照权利要求16的特异性抗体治疗或预防HCV感染的应用。
29.用于检测存在于生物样品中的HCV抗体的试剂盒，其包含在适当的容器中的按照权利要求1或2的E2蛋白质。
30.用于检测HCV抗体的免疫测定，所述免疫测定包含(1)提供按照权利要求1或2的E2蛋白质，(2)在允许形成抗体-抗原复合体的条件下将生物样品与所述E2蛋白质温育，(3)确定所述包含所述E2蛋白质的抗体-抗原复合体是否形成。
全文摘要
本发明涉及合成的E2蛋白质的氨基酸和推断的核酸序列，所述E2蛋白质包含在全世界77种不同HCV 1b分离株的E2中发现的最保守氨基酸的共有序列。本发明另外涉及缺少HVR1的、E2蛋白质的截短形式。本发明的另一方面涉及包含E2蛋白质的疫苗。
文档编号G01N33/576GK1555415SQ02818082
公开日2004年12月15日 申请日期2002年9月9日 优先权日2001年9月13日
发明者刘易斯·内维尔, 阿里·曹贝尔曼, 刘易斯 内维尔, 曹贝尔曼 申请人:Xtl生物制药有限公司
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