专利名称：以icam-1为检测指标的胎膜早破快速检测工具与检测盒的制作方法
技术领域：
本发明属于医用检测工具，特别涉及一种检测妊娠期妇女胎膜早破(Premature Rupture ofFetal Membrane，简称 PROM)的检测工具。
背景技术：
胎膜破裂(Rupture of Fetal Membrane，简称ROM)可能在孕期随时发生，在临产 前发生的胎膜破裂称为胎膜早破(PR0M)。足月后(37孕周)PROM发生率约为10%;足月前 (37孕周前)PROM的发生率为2-3.5%。胎膜早破是引起产科病人产前、产后并发症的主要 因素，是导致胎儿早产和新生儿必须入住重症监护室的主要原因。由于医务人员不得不在 延长孕周与宫内及孕妇感染的风险和胎儿肺发育问题之间求平衡，因而对胎膜早破患者的 管理成本高、难度大，准确及时诊断孕妇是否发生胎膜早破至关重要。现有技术中，采用金标准是诊断胎膜早破的一种准确方法，即在孕妇羊膜腔内注 入染料(如美蓝)，若阴道内有被染料着色的液体流出即可诊断为胎膜早破，但采用金标 准检测临床很难操作，并且造成患者的痛苦，故临床很少使用。临床上通常采用询问病史、 患者自诉阴道有羊水流出、阴道分泌物PH值变为偏碱性(正常阴道分泌物pH值为4. 5 5. 5)、显微镜下查见阴道分泌物涂片中出现羊水结晶等方法，这些方法虽然操作简单，但准 确性、敏感性均较低。细胞间黏附分子-1(Intercellular Adhesion Molecule 1，简称 ICAM-1，说明书 下文中以“ICAM-1”表示细胞间黏附分子-1)属于黏附分子的免疫球蛋白超家族，是分子 量76kD 114kD的单链糖蛋白。ICAM-I广泛表达在机体的血管内皮细胞、胸腺上皮细胞 和其他种类的上皮细胞等非血源性细胞的表面，T淋巴细胞、B淋巴细胞和树突状细胞等血 源性细胞的表面，以及成纤维细胞的表面，与淋巴细胞的浸润有关。虽然在妊娠晚期(孕周 28-40)，受胎膜和羊水中的单核细胞上ICAM-I的表达和中性粒细胞活化的影响，妊娠妇女 的羊水中ICAM-I水平升高，但目前尚未发现以ICAM-I为检测指标的胎膜早破检测工具的 报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种以ICAM-I为检测指标的胎膜 早破快速检测工具与检测盒，以实现无创检测，且能快速获得检测结果。本专利申请的发明人通过实验发现=ICAM-I是妊娠晚期出现在羊水中的主要蛋 白质之一，含量为13. 08士6. llng/mL。胎膜早破时将有羊水从羊膜腔中渗漏至阴道，羊水中 的ICAM-I则会出现在阴道分泌物/宫颈粘液(Cervical-Vaginal Fluid,CVF)中。蛋白芯 片筛选实验发现确诊的PROM产妇与确诊的非PROM产妇相比(两组产妇的年龄与妊娠周 龄匹配，无基础疾�。奕焉锖喜⒅�)，阴道分泌物/宫颈黏液样本中ICAM-I的浓度具有明 显差异。因此，可将ICAM-I作为胎膜早破的检测指标。本发明所述以ICAM-I为检测指标的胎膜早破快速检测工具包括衬片、吸水垫、硝酸纤维素膜、金标垫和样品垫，所述吸水垫、硝酸纤维素膜、金标垫和样品垫由上至下依次相接粘贴在衬片上，且金标垫被样品垫部分覆盖；硝酸纤维素膜上设置有由羊抗人细胞间 黏附分子-1 (羊抗人ICAM-1)多克隆抗体包被形成的检测线和由羊抗鼠免疫球蛋白G(羊 抗鼠IgG，Immunoglobulin G，IgG)多克隆抗体包被形成的控制线，检测线位于控制线之下 且它们之间相隔有间距；金标垫为包被有金标鼠抗人细胞间黏附分子-1单克隆抗体结合 物的吸水纤维。本发明所述以ICAM-I为检测指标的胎膜早破快速检测盒，由盒体和装入盒体内 的上述检测工具构成；所述盒体的内腔与检测工具的形状和尺寸相匹配，所述盒体的顶壁 设置有检测工具插入孔，侧壁设置有加样孔和观察孔，所述加样孔的设置位置与检测工具 装入盒体后其样品垫的位置相对应，所述观察孔的设置位置与检测工具装入盒体后其检测 线和控制线的位置相对应。上述检测工具中，所述检测线和控制线的宽度优选0. 8mm Imm ；所述检测线与控 制线之间的间距优选IOmm 12mm。检测工具的形状无严格要求，从节约成本、方便制作的 角度考虑，其形状优选矩形条。所述吸水垫是由吸水纸制作的垫体，样品垫是由吸水纤维制 作的垫体，即为吸水纤维垫。本发明所述以ICAM-I为检测指标的胎膜早破快速检测工具，其制作方法如下1、检测线、控制线的包被羊抗人ICAM-I多克隆抗体(购自R&D公司)和羊抗鼠IgG多克隆抗体(购自上 海派坤生物工程有限公司)在硝酸纤维素膜上的包被方法见论文“AFP免疫层析测试条的 研制”(侯惠仁、吴冯波、陈键、刘一兵、贺佑丰，《同位素》，2000，13(3) :124-126)。羊抗人 ICAM-I多克隆抗体工作液的浓度为1 3mg/ml，羊抗鼠IgG多克隆抗体工作液的浓度为 1 3mg/ml。2、金标垫的制备(1)胶体金的制备取氯金酸溶解于三蒸水中，形成氯金酸浓度为0. 01g/100ml的氯金酸水溶液；将 所配制的氯金酸水溶液加热至沸腾，在搅拌下加入浓度为9g 10g/100ml的柠檬酸三钠水 溶液，氯金酸水溶液的加入量为100ml氯金酸水溶液中加入1. 35ml 1. 5ml，再煮沸至呈现 透明的橙红色(约7 10分钟)，冷却至室温后用浓度为0. 1 0. 2mol/L的K2CO3溶液调 节其PH值至7. 0-7. 2，获胶体金；(2)金标鼠抗人ICAM-I单克隆抗体结合物的制备在步骤(1)制备的胶体金中加入鼠抗人ICAM-I单克隆抗体(购自R&D公司)， 搅拌混合均勻后加入牛血清白蛋白(BSA，Roche公司)，再搅拌混合均勻后加入浓度为 10g/100ml的NaCl溶液，鼠抗人ICAM-I单克隆抗体的加入量以胶体金溶液中鼠抗人 ICAM-I单克隆抗体的浓度达到200μ g/100ml为限，牛血清白蛋白的加入量以胶体金溶液 中牛血清白蛋白的浓度达到250mg/100ml为限，NaCl溶液的加入量以胶体金溶液中NaCl的 浓度达到lg/100ml为限；继后分别以2，000转/分、4，000转/分、10，000转/分的条件各 离心至少10分钟，获得的分离产物即为金标鼠抗人ICAM-I单克隆抗体结合物，将所述结合 物溶于PH 7.2的磷酸盐缓冲液中，4°C贮存备用，所述磷酸盐缓冲液中含有叠氮钠，叠氮钠 的浓度为90mg/100ml ；
(3)金标垫的制备
用浓度为0. 5g/100ml的牛血清白蛋白(BSA，Roche公司)溶液在22 25°C浸泡 吸水纤维至少1小时，将步骤(2)制备的金标鼠抗人ICAM-I单克隆抗体结合物包被在吸水 纤维上(包被方法见论文“AFP免疫层析测试条的研制”，侯惠仁、吴冯波、陈键、刘一兵、贺 佑丰，《同位素》，2000,13 (3) 124-126)，即获得金标垫。3、以ICAM-I为检测指标的胎膜早破快速检测工具的制备将片状吸水垫2、包被有检测线和控制线的硝酸纤维素膜5、金标垫6和样品垫7 粘在片状衬片1上，然后切成矩形条。使用本发明所述检测工具和检测盒，控制线上可见一条清晰的紫红色线，证明试 纸条有效；当检测线上可见一条清晰的紫红色线，此结果判定为阳性(即发生胎膜早破)； 若检测线上没有色线出现，则判定为阴性(即未发生胎膜早破)。本发明所述检测工具和检测盒具有以下有益效果1、本发明为胎膜早破的检测提供了 一种采用新检测指标的检测工具。2、使用本发明所述检测盒对确诊胎膜破裂组和确诊胎膜未破组妊娠妇女进行采 样检测，检测结果表明该检测盒的敏感性为96%左右，特异性为91%左右。3、使用本发明所述检测盒，操作简单，检测一个样品仅需10-15分钟，与临床上通 常的现有检测方法相比，检测速度大幅度提高。4、由于检测样品是妊娠妇女的阴道分泌物，因而是一种无创检测。5、本发明所述检测工具和检测盒结构简单，易于加工制作，生产成本低，便于工业
化生产。本发明所述检测工具和检测盒适用于所有妊娠期妇女，尤其是存在早产风险、腹 部受到损伤的妊娠期妇女。
图1是本发明所述以ICAM-I为检测指标的胎膜早破快速检测工具的一种结构示 意图；图2是图1的左视图；图3是本发明所述以ICAM-I为检测指标的胎膜早破快速检测盒盒体的一种结构 示意图；图4是图3的俯视图；图5是图3的A-A剖视图；图6是本发明所述以ICAM-I为检测指标的胎膜早破快速检测盒的一种结构示意 图。图中，1-衬片、2-吸水垫、3-控制线、4-检测线、5-硝酸纤维素膜、6-金标垫、7-样 品垫、8-盒体、9-观察孔、10-加样孔、11-检测工具插入孔、12-检测工具、13-待测样品中 的 ICAM-1。
具体实施例方式下面结合附图对本发明所述以ICAM-I为检测指标的胎膜早破快速检测工具与检测盒的结构、制作方法和使用方法做进一步说明。 实施例1本实施例中，以ICAM-I为检测指标的胎膜早破快速检测工具如图1、图2所示，其 形状为矩形条，其构造包括衬片1、吸水垫2、硝酸纤维素膜5、金标垫6和样品垫7，所述吸 水垫、硝酸纤维素膜、金标垫和样品垫由上至下依次相接粘贴在衬片上，且金标垫被样品垫 部分覆盖。衬片1由医用塑料高白度PVC片材制作，上面涂布压敏胶，对生物活性分子具有 惰性；吸水垫2由吸水纸制作；硝酸纤维素膜5上设置有由羊抗人ICAM-I多克隆抗体包被 形成的检测线4和由羊抗鼠IgG多克隆抗体包被形成的控制线3，检测线4位于控制线3之 下，它们的宽度均为Imm(或0.8mm或0.9mm)，它们之间的间距为IOmm(或Ilmm或12mm)； 金标垫6为包被有金标鼠抗人ICAM-I单克隆抗体结合物的玻璃纤维膜或聚酯纤维膜；样品 垫是由玻璃纤维膜或聚酯纤维膜制作的垫体。本实施例中，以ICAM-I为检测指标的胎膜早破快速检测工具的制作方法如下1、检测线、控制线的包被羊抗人ICAM-I多克隆抗体(购自R&D公司)和羊抗鼠IgG多克隆抗体(购自上 海派坤生物工程有限公司)在硝酸纤维素膜上的包被方法见论文“AFP免疫层析测试条的 研制”(侯惠仁、吴冯波、陈键、刘一兵、贺佑丰，《同位素》，2000，13(3) 124-126).2、金标垫的制备(1)胶体金的制备取0. Olg氯金酸溶解于IOOml三蒸水中，形成氯金酸水溶液；将IOOml氯金酸水溶 液加热至沸腾，在搅拌下加入浓度为10g/100ml的柠檬酸三钠水溶液1. 5ml，再煮沸至呈现 透明的橙红色(约7 10分钟)，冷却至室温后用浓度为0. 2mol/L的K2C03溶液调节其 PH值至7. 0-7. 2，获胶体金;(2)金标鼠抗人ICAM-I单克隆抗体结合物的制备在步骤⑴制备的IOOml胶体金中加入200 μ g鼠抗人ICAM-I单克隆抗体(购 自R&D公司)，搅拌混合均勻后加入250mg牛血清白蛋白(BSA，Roche公司)，再搅拌混合均 勻后加入浓度为10g/100ml的NaCl溶液，NaCl溶液的加入量以胶体金溶液中NaCl的浓度 达到lg/100ml为限。继后分别以2，000转/分、4，000转/分、10，000转/分的条件各离 心10分钟，获得的分离产物即为金标鼠抗人ICAM-I单克隆抗体结合物，将所述结合物溶于 PH 7.2的磷酸盐缓冲液中，4°C贮存备用，所述磷酸盐缓冲液中含有叠氮钠，叠氮钠的浓度 为 90mg/100ml ；(3)金标垫的制备用浓度为0. 5g/100ml的牛血清白蛋白(BSA，Roche公司)溶液在22 25°C浸泡 玻璃纤维膜或聚酯纤维膜1小时后，将步骤(2)制备的金标鼠抗人ICAM-I单克隆抗体结合 物包被在玻璃纤维膜或聚酯纤维膜上(包被方法见论文“AFP免疫层析测试条的研制”，侯 惠仁、吴冯波、陈键、刘一兵、贺佑丰，《同位素》，2000，13(3) :124-126)，即获得金标垫。3、以ICAM-I为检测指标的胎膜早破快速检测工具的制备将片状吸水垫2、包被有检测线和控制线的硝酸纤维素膜5、金标垫6和样品垫7 粘在片状衬片1上，然后切成矩形条。实施例2
本实施例中，以ICAM-I为检测指标的胎膜早破快速检测盒的形状和构造如图6所 示，由盒体8和装入盒体内的检测工具12构成。所述检测工具12为实施例1所述形状和构 造的检测工具。所述盒体8用医用塑料制作，如图3、图4、图5所示，外形为长方体，内腔与 检测工具的形状和尺寸相匹配，其顶壁设置有检测工具插入孔11，其侧壁设置有加样孔10 和观察孔9，所述加样孔10的设置位置与检测工具装入盒体后其样品垫7的位置相对应，所 述观察孔9的设置位置与检测工具装入盒体后其检测线4和控制线3的位置相对应。所制 作的检测盒用放置有干燥剂的铝箔袋密封封装备用。所述检测盒的使用方法和检测原理如下将待测样品(妊娠妇女阴道分泌物/宫颈粘液)从盒体8的加样孔10加入检测工具的样品垫7，由于层析原理，待测样品从样品垫7沿条状检测工具向上移动，当移动至 金标垫6，将金标鼠抗人ICAM-I单克隆抗体结合物溶解，并带着金标鼠抗人ICAM-I单克隆 抗体继续向上移动，当移动至硝酸纤维素膜上的检测线4，如果待测样品中有ICAM-I抗原 存在，检测线4上的羊抗人ICAM-I多克隆抗体和金标鼠抗人ICAM-I单克隆抗体与样品中 的ICAM-I抗原将会在检测线上形成一条紫红色的夹心免疫复合物，检测线上可见一条清 晰的紫红色线，此结果判为阳性；样品中的ICAM-I抗原含量越高，色线颜色越深。如果样品 中没有ICAM-I抗原，金标鼠抗人ICAM-I单克隆抗体则不会与检测线上的羊抗人ICAM-I多 克隆抗体形成复合物，检测线上没有色线出现，此结果判定为阴性。当待测样品和金标鼠抗 人ICAM-I单克隆抗体继续向上移动至控制线3时，控制线上的羊抗鼠IgG多克隆抗体将会 与金标鼠抗人ICAM-I单克隆抗体结合，在控制线上形成一条红色或紫红色线，证明测试工 具有效。检测结果通过盒体上的观察孔9观察获得。
权利要求
以细胞间黏附分子-1为检测指标的胎膜早破快速检测工具，其特征在于包括衬片(1)、吸水垫(2)、硝酸纤维素膜(5)、金标垫(6)和样品垫(7)，所述吸水垫、硝酸纤维素膜、金标垫和样品垫由上至下依次相接粘贴在衬片上，且金标垫被样品垫部分覆盖，硝酸纤维素膜(5)上设置有由羊抗人细胞间黏附分子-1多克隆抗体包被形成的检测线(4)和由羊抗鼠免疫球蛋白G多克隆抗体包被形成的控制线(3)，检测线位于控制线之下且它们之间相隔有间距，金标垫(6)为包被有金标鼠抗人细胞间黏附分子-1单克隆抗体结合物的吸水纤维。
2.根据权利要求1所述的以细胞间黏附分子-1为检测指标的胎膜早破快速检测工具， 其特征在于所述检测线(4)和控制线(3)的宽度为0.8mm 1mm。
3.根据权利要求1或2所述的以细胞间黏附分子-1为检测指标的胎膜早破快速检测 工具，其特征在于所述检测线⑷与控制线⑶之间的间距为IOmm 12mm。
4.根据权利要求1或2所述的以细胞间黏附分子-1为检测指标的胎膜早破快速检测 工具，其特征在于它的形状为矩形条。
5.根据权利要求3所述的以细胞间黏附分子-1为检测指标的胎膜早破快速检测工具， 其特征在于它的形状为矩形条。
6.以细胞间黏附分子-1为检测指标的胎膜早破快速检测盒，由盒体(8)和装入盒体内 的检测工具构成；所述检测工具包括衬片(1)、吸水垫(2)、硝酸纤维素膜(5)、金标垫(6)和样品垫(7)， 所述吸水垫、硝酸纤维素膜、金标垫和样品垫由上至下依次相接粘贴在衬片上，且金标垫被 样品垫部分覆盖，硝酸纤维素膜(5)上设置有由羊抗人细胞间黏附分子-1多克隆抗体包被 形成的检测线(4)和由羊抗鼠免疫球蛋白G多克隆抗体包被形成的控制线(3)，检测线位于 控制线之下且它们之间相隔有间距，金标垫(6)为包被有金标鼠抗人细胞间黏附分子-1单 克隆抗体结合物的吸水纤维；所述盒体的内腔与检测工具的形状和尺寸相匹配，所述盒体的顶壁设置有检测工具插 入孔(11)，侧壁设置有加样孔(10)和观察孔(9)，所述加样孔(10)的设置位置与检测工具 装入盒体后其样品垫(7)的位置相对应，所述观察孔(9)的设置位置与检测工具装入盒体 后其检测线(4)和控制线(3)的位置相对应。
7.根据权利要求6所述的以细胞间黏附分子-1为检测指标的胎膜早破快速检测盒，其 特征在于所述检测工具的形状为矩形条。
全文摘要
以ICAM-1为检测指标的胎膜早破快速检测工具，包括衬片、吸水垫、硝酸纤维素膜、金标垫和样品垫，所述吸水垫、硝酸纤维素膜、金标垫和样品垫由上至下依次相接粘贴在衬片上，且金标垫被样品垫部分覆盖；硝酸纤维素膜上设置有由羊抗人细胞间黏附分子-1多克隆抗体包被形成的检测线和由羊抗鼠免疫球蛋白G多克隆抗体包被形成的控制线，检测线位于控制线之下且它们之间相隔有间距；金标垫为包被有金标鼠抗人细胞间黏附分子-1单克隆抗体结合物的吸水纤维。以细胞间黏附分子-1为检测指标的胎膜早破快速检测盒，由盒体和装入盒体内的上述检测工具构成。
文档编号G01N33/558GK101871943SQ20101018968
公开日2010年10月27日 申请日期2010年6月2日 优先权日2010年6月2日
发明者关祥乾, 向洪发, 周容, 胡怀忠 申请人:成都创宜生物科技有限公司
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