专利名称：聚乙二醇化胰岛素样生长因子测定的制作方法
聚乙二醇化胰岛素样生长因子测定本发明属于免疫测定领域，更精确而言，报道了检测和定量聚乙二醇化胰岛素样 生长因子的免疫测定，该免疫测定通过形成和确定聚乙二醇化胰岛素样生长因子和胰岛素 样生长因子结合蛋白复合体来实现。
背景技术：
胰岛素样生长因子I和II(IGF I和IGF II)是胰岛素激素、生长因子和神经肽 超家族成员，其通过结合细胞表面受体(例如胰岛素样生长因子I受体或胰岛素样生长因 子II受体)发挥生物学作用。胰岛素样生长因子和生长激素(GH)轴在调节胎儿和儿童期 身体生长中发挥大部分作用。几十年的基础和临床研究已经证实其在维持赘生性生长中 也是关键性的(Khandwala, H. Μ.等，Endocr. Rev. 21 (2000) 215-244)。胰岛素样生长因子 的作用受到胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)的调节，胰岛素样生长因子结合蛋白作为 胰岛素样生长因子的转运蛋白，保护它们不受降解，限制或抑制它们结合受体，并维持生物 学上无活性胰岛素样生长因子的“储存库” (Martin, J. L.，和Baxter, R. C.，IGF binding proteins as modulators of IGF actions,在 Rosenfeld,R. G.禾口 Roberts,C. Τ·编辑，The IGF system,Molecular Biology,Physiology,and Clinical Applications(1999),Humana Press, Totowa, 227-255 中 Jones, J. L.，禾口 Clemmons，D. R.，Endocr. Rev. 12 (1995) 10-21 ； Khandwala, H. Μ. Endocr. Rev. 21 (2000) 215-244 ；Hwa, V. The IGF binding protein superfamily,在 Rosenfeld, R. G.,禾口 Roberts, C. T.编辑，The IGF system, Molecular Biology, Physiology, and Clinical Applications(1999), Humana Press, Totowa，第315-327页中)。事实上胰岛素样生长因子系统在肿瘤组织上介导的各级水平 的反应(IGF、IGFBP、IGF受体)都可作为治疗手段的靶标(Khandwala, H. Μ.等，Endocr. Rev. 21 (2000) 215-244 ；Fanayan, S.等，J. Biol. Chem. 275 (2000) 39146-39151 ；Imai，Y.等， J. Biol. Chem. 275(2000) 18188-18194)。此处也应当提到胰岛素样生长因子结合蛋白3 具有不依赖于胰岛素样生长因子的抗增殖和促凋亡效应(Wetterau，L. Α.等，Mol. Gen. Metab. 68 (1999) 161-181 ；Butt, A. J.等，J. Biol. Chem. 275 (2000) 39174-39181)。人胰岛素样生长因子I是结构上与胰岛素相关的循环激素。传统上 认为胰岛素样生长因子I是生长激素在外周组织上发挥作用的主要介质。胰 岛素样生长因子I由70个氨基酸组成，也被称为生长调节素C并由SwissProt No. P01343 定义。 在例如，Ie Bouc, Y.等，FEBS Lett. 196(1986) 108-112 ；de Pagter-Holthuizen, P. φ, FEBS Lett. 195 (1986) 179-184 ；Sandberg Nordqvist, Α. C. φ, Brain Res. Mol. Brain Res. 12 (1992) 275-277 ；Steenbergh, P. H.等， Biochem. Biophys. Res. Commun. 175 (1991) 507-514 ； Tanner, J. M.等，Acta Endocrinol. (Copenhagen) 84 (1977) 681-696 ；Uthne, K.等，J. Clin. Endocrinol. Metab.39(1974)548-554;EP 0 123 228 ；EP 0 128 733 ；US 5, 861, 373 ；US 5, 714, 460 ；EP 0 597 033 ；WO 02/32449 ；WO 93/02695 中提到了用途、活性及制备。胰岛素样生长因子I的功能调控是相当复杂的。在循环中，仅0.2%至1.0%的 边缘水平的胰岛素样生长因子I以游离形式存在，而大多数结合胰岛素样生长因子结合蛋白，所述胰岛素样生长因子结合蛋白对胰岛素样生长因子具有很高的亲和力，并调节胰岛 素样生长因子I的功能。可通过释放胰岛素样生长因子I的机制(如通过蛋白酶蛋白水解 胰岛素样生长因子结合蛋白)局部释放所述因子。胰岛素样生长因子I在发育的及成熟的脑中起旁分泌作用(Werther，G. Α.等， Mol. Endocrinol. 4 (1990) 773-778)。体外研究表明胰岛素样生长因子I对CNS中几种类型 的神经元而言是有力的非选择性亲和物质(Knusel，B.等，J. Neurosci. 10(1990)558-570 ； Svrzic, D.，禾口 Schubert，D. ，Biochem. Biophys. Res. Commun. 172 (1990) 54—60)，所述神经 元包括多巴胺能神经元(Knusel，B.等，J. Neurosci. 10(1990)558-570)和少突胶质细胞 (McMorris, F. A.，禾口 Dubois—Dalcq，Μ. ， J. Neurosci. Res. 21(1988) 199—209 ；McMorris, F. Α.等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986) 822-826 ;Mozell，R. L.，和 McMorris，F. A.， J. Neurosci. Res. 30 (1991) 382-390))。US 5，093，317提到胆碱能神经元细胞的存活通过 施用胰岛素样生长因子I而提高。还已知胰岛素样生长因子I刺激外周神经再生(Kanje， Μ.等，Brain Res. 486 (1989) 396-398)并提高鸟氨酸脱羧酶的活性(US 5，093，317)。US 5，861，373和W093/02695提到通过提高患者中枢神经系统中胰岛素样生长因子I和/或其 类似物的有效浓度来治疗主要影响神经胶质和/或非胆碱能神经细胞的中枢神经系统损 伤或疾病的方法。WO 02/32449涉及通过向哺乳动物鼻腔施用包含治疗有效量的胰岛素样 生长因子I或其生物活性变体的药物组合物来减少或预防哺乳动物中枢神经系统中局部 缺血损伤的方法。胰岛素样生长因子I通过鼻腔吸收并以有效减少或预防与局部缺血事件 相关的局部缺血损伤的量转运至哺乳动物的中枢神经系统中。在EP 0 874 641中报道了 胰岛素样生长因子I或胰岛素样生长因子II用于制备治疗或预防中枢神经系统中神经元 损伤的药物的用途。已将降低游离胰岛素样生长因子I的脑水平和血清水平与阿尔茨海默氏病的散 发型和家族型的发病机理相关联。此外，胰岛素样生长因子I保护神经元免于Αβ诱导的 神经毒性(Niikura,T.等，J. Neurosci. 21 (2001) 1902-1910 ；Dore, S.等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94(1997)4772-4777 ；Dore,S.等，Ann. NY Acad. Sci. 890 (1999) 356-364)。近来，表 明外周施用胰岛素样生长因子I能够降低大鼠和小鼠中的脑Αβ水平(CamE.等，Nat. Med. 8 (2002) 1390-1397)。此外，研究证实在转基因AD小鼠模型中延长的胰岛素样生长因 子I治疗显著减轻脑的淀粉状蛋白斑负担。这些数据强烈支持胰岛素样生长因子I能够通 过从脑中清除Αβ来降低脑的Αβ水平和减轻斑点相关脑痴呆的观点。胰岛素样生长因子I和胰岛素样生长因子II是67%同一性的单链多肽，分别具有 70和67个氨基酸，与胰岛素具有大约40%的序列同一性并且据推测是结构同源的。胰岛 素样生长因子的前29个残基与胰岛素B链(B区，1-29)是同源的，随后是与前胰岛素的C 肽(C区，30-41)相似的12个残基，以及与胰岛素A链(Α区，42-62)同源的21个残基区。 羧基末端的八肽(D区，63-70)在胰岛素和前胰岛素中没有对应部分(Murray-Rust，J.等， BioEssays 14(1992)325-331 ；Baxter, R. C.等，J. Biol. Chem. 267 (1992) 60-65)。胰岛素样 生长因子是胰岛素超家族中翻译后未通过蛋白水解除去C区的仅有的成员。胰岛素样生长因子结合蛋白(胰岛素样生长因子结合蛋白1至6)是216至289 个残基的蛋白质，例如，成熟的胰岛素样生长因子结合蛋白5由252个残基组成(Wetterau， L. Α.等，Mol. Gen. Metab. 68 (1999) 161-181 ；综述参见例如 Rajaram，S.等，Endocr.
5Rev. 18(1997)801-831)。所有胰岛素样生长因子结合蛋白都有共同的结构域组织。发现最 保守处位于N末端(残基1至大约100)和C末端(从残基170)富含半胱氨酸结构域中。 在N末端结构域中发现12个保守的半胱氨酸，在C末端结构域中发现6个。中部的低保 守部分(L结构域)含有大部分特异性蛋白酶的切割位点(Chernausek，S. D.等，J.Biol. Chem. 270(1995) 11377-11382)。迄今为止已经描述和生化表征了胰岛素样生长因子结合蛋 白的几个不同片段(Mazerbourg, S.等，Endocrinology 140(1999)4175-4184)。诱变研究表 明高亲和力胰岛素样生长因子结合位点位于N末端结构域中(WetteraU，L.A.等，Mol. Gen. Metab. 68(1999) 161-181 ；Chernausek, S. D.等，J. Biol. Chem. 270 (1995) 11377-11382)，并 且至少胰岛素样生长因子结合蛋白3和胰岛素样生长因子结合蛋白2含有两个结合决定 簇，一个在 N —个在 C 末端结构域(Wetterau，L. Α.等，Mol. Gen. Metab. 68 (1999) 161-181)。 近来，已经描述了一组比胰岛素样生长因子结合蛋白具有更低亲和力的结合胰岛素样生 长因子的胰岛素样生长因子结合蛋白相关蛋白(IGFBP-rP) (Hwa, V.等，The IGF binding protein superfamily,在 Rosenfeld, R. G.,禾口 Roberts, C. Τ.编辑，The IGF system, Molecular Biology, Physiology, and Clinical Applications (1999), Humana Press, Totowa，第315-327页中)。胰岛素样生长因子结合蛋白和IGFBP-rP都有高度保守并且富 含半胱氨酸的N末端结构域，这似乎对于几种生物学作用(包括它们结合胰岛素样生长因 子以及高亲和力结合胰岛素)是重要的(Hwa等，1999)。胰岛素样生长因子结合蛋白3的 N末端(例如通过消化血浆产生)也结合胰岛素，因此在生理学上可能与胰岛素作用相关。 除了 N末端结构域外，胰岛素样生长因子结合蛋白和IGFBP-rP之间缺少序列相似性。发明概述本发明的第一方面是检测聚乙二醇化胰岛素样生长因子的免疫测定，包含捕获抗 体和示踪抗体，其中所述捕获抗体是单克隆抗聚乙二醇抗体，所述示踪抗体是单克隆抗洋 地黄毒苷(digoxygenin)抗体，所述聚乙二醇化胰岛素样生长因子作为与洋地黄毒苷化胰 岛素样生长因子结合蛋白的复合体而得到检测，其中所述聚乙二醇化胰岛素样生长因子与 所述洋地黄毒苷化胰岛素样生长因子结合蛋白的孵育步骤为室温下12至24小时，所述洋 地黄毒苷化胰岛素样生长因子结合蛋白的浓度为5. 0μ g/ml或更低。在一个实施方案中，所述抗聚乙二醇抗体缀合到固相，并且所述抗洋地黄毒苷抗 体缀合到可检测标签。在另一个实施方案中，所述缀合为化学缀合。在另一个实施方案中， 所述可检测标签选自酶、抗原、荧光基团、化学发光基团和金属螯合物复合体。在又一个实 施方案中，所述聚乙二醇化胰岛素样生长因子是SEQ ID NO :1的胰岛素样生长因子I或其 聚乙二醇化变体。在又一个实施方案中，所述聚乙二醇化胰岛素样生长因子是单聚乙二醇 化的。在又一个实施方案中，所述胰岛素样生长因子结合蛋白是胰岛素样生长因子结合蛋 白3、胰岛素样生长因子结合蛋白4、或胰岛素样生长因子结合蛋白5。在另一个实施方案 中，本发明的免疫测定的特征在于所述聚乙二醇化胰岛素样生长因子与所述洋地黄毒苷化 胰岛素样生长因子结合蛋白的孵育步骤为18至22小时，优选地为20小时。在又一个实施 方案中，本发明的免疫测定的特征在于所述聚乙二醇化胰岛素样生长因子与所述洋地黄毒 苷化胰岛素样生长因子结合蛋白的孵育步骤中所述洋地黄毒苷化胰岛素样生长因子结合 蛋白的浓度为 0. 1 至 5. 0μ g/ml，或 0. 1 μ g/ml 至 1.0yg/ml。本发明的第二方面是确定样品中聚乙二醇化胰岛素样生长因子的方法，包括下述步骤a)提供待分析的样品，b)将缀合到固相的抗聚乙二醇抗体与所述样品孵育以形成抗聚乙二醇抗体/聚 乙二醇化胰岛素样生长因子复合体，c)将b)中形成的所述复合体与洋地黄毒苷化胰岛素样生长因子结合蛋白4在室 温下孵育12至24小时以形成第二复合体，其包含b)中形成的复合体，所述洋地黄毒苷化 胰岛素样生长因子结合蛋白4的浓度为5. 0μ g/ml或更低，d)将C)中形成的所述复合体与辣根过氧化物酶缀合的抗洋地黄毒苷抗体孵育以 形成第三复合体，其包含c)中形成的复合体，e)通过将d)中形成的复合体与ABTS孵育并通过检测有色产物的形成确定聚乙二 醇化胰岛素样生长因子。在所述方法的一个实施方案中，在步骤b)，和/或C)，和/或d)之后进行洗涤步 骤。在一个实施方案中，所述聚乙二醇化胰岛素样生长因子是聚乙二醇化胰岛素样生长因 子I或其聚乙二醇化变体。在另一个实施方案中，所述聚乙二醇化胰岛素样生长因子和所 述洋地黄毒苷化胰岛素样生长因子结合蛋白4的孵育步骤为18至22小时。在另一个实施 方案中，所述聚乙二醇化胰岛素样生长因子和所述洋地黄毒苷化胰岛素样生长因子结合蛋 白4的孵育步骤中所述洋地黄毒苷化胰岛素样生长因子结合蛋白4的浓度为0. 1 μ g/ml至 5. 0 μ g/ml ο本发明的第三方面是定量确定样品中聚乙二醇化胰岛素样生长因子I或其聚乙 二醇化变体的量的方法，包括下述步骤a)提供待分析样品，b)提供至少两种参比样品，每种含有确定但不同量的聚乙二醇化胰岛素样生长因 子I，c)将缀合到固相的抗聚乙二醇抗体分别与所述样品以及与所述至少两种含有不 同量聚乙二醇化胰岛素样生长因子I的参比样品孵育，从而形成抗聚乙二醇抗体/聚乙二 醇化胰岛素样生长因子复合体，d)将C)中各自与样品和参比样品形成的所述复合体分别与洋地黄毒苷化胰岛素 样生长因子结合蛋白4孵育，从而形成第二复合体，其包含c)中形成的复合体，其中与洋地 黄毒苷化胰岛素样生长因子结合蛋白4的孵育为室温下12至24小时，所述洋地黄毒苷化 胰岛素样生长因子结合蛋白4的浓度为5. 0 μ g/ml或更低，e)将d)中各自与样品和参比样品形成的所述复合体分别与辣根过氧化物酶缀合 的抗洋地黄毒苷抗体孵育，从而形成第三复合体，其包含d)中形成的复合体，f)将e)中各自与样品和参比样品形成的复合体分别与ABTS孵育5至15分钟，并 确定所形成的有色产物的量，g)通过标准曲线定量确定所述样品中聚乙二醇化胰岛素样生长因子I或其聚乙 二醇化变体的量，该标准曲线基于参比样品中所形成有色产物的量来计算。本发明第四方面是本发明的方法在患者随访中的用途，该患者已经施用了聚乙二 醇化胰岛素样生长因子或其聚乙二醇化变体。本发明此方面的一个实施方案是所述捕获抗体为所述抗聚乙二醇抗体的混合物，其包含至少两种所述抗聚乙二醇抗体，该至少两种抗体缀合到固相的抗体位点不同，并且 所述示踪抗体是所述抗洋地黄毒苷抗体的混合物，其包含至少两种所述抗洋地黄毒苷抗 体，该至少两种抗体缀合到可检测标签的抗体位点不同。在另一个实施方案中，抗体通过 化学结合经抗体氨基酸骨架的N末端和/或ε氨基(赖氨酸)、不同赖氨酸的ε氨基、羧 基、巯基、羟基、和/或酚功能基团、和/或通过抗体碳水化合物结构的糖醇基团与其缀合配 偶体进行缀合。在本发明此方面的一个实施方案中，捕获抗体混合物或示踪抗体混合物包 含通过氨基和通过碳水化合物结构缀合到它们缀合配偶体的相应抗体。在另一个实施方案 中，捕获抗体通过被动吸附或通过特异性结合对缀合到固相。在本发明的一个实施方案中， 特异性结合对(第一成分/第二成分)选自链霉抗生物素或抗生物素蛋白/生物素、或抗 体/抗原、或凝集素/多糖、或类固醇/类固醇结合蛋白、或激素/激素受体、或酶/底物、 或IgG/蛋白质A和/或G。在另一个实施方案中，捕获抗体缀合到生物素并且通过固定的 抗生物素蛋白或链霉抗生物素缀合到固相。在另一个实施方案中，捕获抗体为IgM类型的 抗聚乙二醇抗体。在本发明此方面的又一个实施方案中，示踪抗体通过特异性结合对缀合 到可检测标签。本发明此方面的另一个实施方案为捕获抗体与示踪抗体的比例是1 10 至50 1(比例的意思是抗体分子的比例，不考虑缀合物的分子量，其可能是不同的)。本发明的另一方面是确定样品中聚乙二醇化胰岛素样生长因子I或其聚乙二醇 化变体的试剂盒，包括a)链霉抗生物素包被的微量滴定板，b)缀合到生物素的抗聚乙二醇抗体，c)缀合到辣根过氧化物酶的抗洋地黄毒苷抗体，d)洋地黄毒苷化胰岛素样生长因子结合蛋白4，e) ABTS ο在一个实施方案中，b)和C)中的抗体是单克隆抗体。在另一个实施方案中，b)中 的抗体为IgM类型，并且c)中的抗体为IgG类型。发明详述本发明涉及通过使用捕获抗体和示踪抗体来确定聚乙二醇化胰岛素样生长因子 或其聚乙二醇化变体的免疫测定，其中所述捕获抗体为抗聚乙二醇抗体和所述示踪抗体为 抗洋地黄毒苷抗体，其中所述聚乙二醇化胰岛素样生长因子作为所述聚乙二醇化胰岛素样 生长因子与胰岛素样生长因子结合蛋白形成的复合体而被确定，其中所述聚乙二醇化胰岛 素样生长因子和所述洋地黄毒苷化胰岛素样生长因子结合蛋白的孵育步骤为室温下12至 24小时，所述洋地黄毒苷化胰岛素样生长因子结合蛋白的浓度为5. 0μ g/ml或更低。免疫测定是本领域技术人员熟知的。相关教科书中总结了实施这样测定的 方法以及实际应用和操作过程。相关教科书的例子为Tijssen，P.，Preparation of enzyme-antibody or other enzyme-macromolecule conjugates (在"Practice and theory of enzyme immunoassays" (1990), 221-278, R. H. Burdon 禾口 v. P. H. Knippenberg 编辑，Elsevier，Amsterdam 中)，以及多卷的〃 Methods in Enzymology" (S. P. Colowick, N. 0. Caplan编辑，Academic Press)，其讨论免疫学检测方法，特别是第70、73、74、84、92和 121 卷。抗体作为蛋白质包含许多反应部分，如，例如氨基(赖氨酸、α氨基)，巯基(胱氨酸、半胱氨酸和甲硫氨酸)，羧基(天冬氨酸、谷氨酸)和糖醇基。这些可用于偶联到结合配 偶体，如表面、蛋白质、聚合物(如，例如PEG、纤维素或聚苯乙烯)、酶、或结合对的成员(参 见例如 Aslam M.，禾口 Dent，A.，Bioconjugation MacMillan Ref. Ltd. (1999)50—100)。蛋白质最常见的反应基团之一是氨基酸赖氨酸的脂肪族胺。通常，几乎所有 抗体都包含丰富的赖氨酸。赖氨酸胺是PH 8. O以上(pKa = 9. 18)相当好的亲核物质，因 此与多种试剂容易地、完全地反应形成稳定的键。抗体中另一种常见的反应基团是来自于 含硫氨基酸胱氨酸及其还原产物半胱氨酸(或半个胱氨酸)的巯基残基。半胱氨酸包含 比胺更加亲核的游离巯基，通常是蛋白质中最具有反应性的功能基团。巯基通常在中性PH 具有反应性，因此可在胺存在时选择性地偶联到其它分子。由于游离的巯基是相对具有 反应性的，带有这些基团的蛋白质常常以它们作为二硫基团或二硫键的氧化形式而存在。 除了胱氨酸和半胱氨酸，一些蛋白质也含有氨基酸甲硫氨酸，其包含硫醚连接的硫。文献 报道使用几种硫醇交联试剂如Traut' s试剂(2-亚氨硫杂环戊烷)、琥珀酰亚胺基(乙 酰硫基)乙酸酯(SATA)或磺基琥珀酰亚胺基6-[3-(2_吡啶基二硫基)丙酰氨基]己酸 酯(Sulfo-LC-SPDP)提供通过反应性氨基引入多个巯基的有效方式。反应性酯类，特别是 N-羟基琥珀酰亚胺基(NHS)酯类，是其中最常用的修饰胺基的试剂。水性环境中反应的最 适？!1为？!18.0至9.0。异硫氰酸酯是胺修饰试剂，与蛋白质形成硫脲键。它们与蛋白质胺 在水性溶液中反应(在PH9. O至9. 5最佳)。在温和含水条件下醛与脂肪族和芳香族胺、 胼和酰胼反应形成亚胺中间体(希夫氏碱)。希夫氏碱可通过温和或强力还原剂(如硼氢 化钠或氰基硼氢钠)被选择性地还原从而获得稳定的烷胺键。用于修饰胺的其它试剂为酸 酐。例如，二亚乙基三胺五乙酸酐(DTPA)是双功能螯合剂，包含两个胺反应性酸酐基团。它 能与蛋白质的N末端和ε-氨基反应形成酰胺键。酸酐环打开产生多元金属螯合臂，其能 够以配位化合物紧密结合金属。抗体中另一常见反应性基团为羧酸(天冬氨酸、谷氨酸)。蛋白质在C末端位置和 天冬氨酸和谷氨酸侧链内包含羧酸基团。为了缀合羧酸基团通常通过使用水溶性碳二亚胺 转化成反应性酯并与亲核试剂(如胺、酰胼或胼)反应。为了在蛋白质中其它胺存在下与 活化的羧酸选择性反应，含胺试剂应当是弱碱性的。当PH提高到8. O以上时可发生蛋白交 联。高碘钠可用于将碳水化合物部分内的糖的醇部分氧化成醛。每个醛基团都能与 胺、酰胼或胼反应，如对羧酸所述。由于碳水化合物部分主要在抗体的可结晶片段(Fe)区 发现，可通过对远离抗原结合位点的碳水化合物进行定点修饰从而完成缀合。巯基反应试剂为将巯基偶联到蛋白质上的那些试剂，形成硫醚偶联产物。这些试 剂在弱酸至中性PH下迅速反应，因此可在胺基团存在时被选择性地反应。卤乙酰衍生物 (例如碘乙酰胺)形成硫醚键，是用于巯基修饰的试剂。在抗体中，反应发生在半胱氨酸基 团上，半胱氨酸基团或者是本身存在的，或者来自于对抗体不同位置的胱氨酸二硫化物的 还原。其他有用试剂是马来酰亚胺。马来酰亚胺与巯基反应性试剂的反应基本上与碘乙酰 胺的反应相同。马来酰亚胺在弱酸至中性PH下迅速反应。胺、酰胼和胼是醛和羧酸反应性试剂(形成酰胺、腙或烷胺键)。在通过水溶性碳 二亚胺活化羧基后，胺、酰胼和胼可被偶联到蛋白质的羧基。含胺试剂必须为弱碱性，以便 在更强碱性的赖氨酸ε _胺存在时与碳二亚胺活化蛋白质选择性反应形成稳定的酰胺键。在与醛基(可通过高碘酸盐氧化抗体上的碳水化合物残基在抗体上产生醛基)反应中形成 希夫氏碱中间体，可通过使用氰基硼氢钠(温和的并且选择性的)或硼氢化钠(强力的) 水溶性还原剂还原中间体而使其还原成烷胺。本发明中使用的术语“免疫测定”是指免疫学测定方法，即一种体外方法。通过免 疫测定可以直接确定样品中聚乙二醇化胰岛素样生长因子或其聚乙二醇化变体的存在和 / 或数量(参见例如 The Immunoassay Handbook, David Wild 编辑，M Stockton Press, 1994)。一般而言免疫测定包含一种或更多种(在一个实施方案中为两种不同的)特异性结 合到样品中待分析的分子的结合分子。在一个实施方案中，本发明的免疫测定包含两种不 同抗体，其结合到聚乙二醇化胰岛素样生长因子上两种不同的无重叠的表位。在另一个实 施方案中，本发明的免疫测定包含一种特异性结合到聚乙二醇化胰岛素样生长因子或其聚 乙二醇化变体的抗体，以及结合到待检测分子的无重叠表位的一种分子。为检测的目的，至 少一种结合分子通过可检测的标签标记，例如，包括放射性同位素、酶或染料，它们可通过 放射性分解、酶催化的颜色产生、荧光输出或抑制、或化学发光输出进行检测。免疫测定方 法包括下述方法如放射免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、荧光免疫测定(FIA) 和化学发光测定(CLA)。在一个实施方案中，本发明的免疫测定为异质免疫测定。在这样 的免疫测定中，能够从包含捕获抗体和分析物的复合体中除去待分析样品中存在的未结合 的分子，该复合体结合到固相。可通过离心、过滤、磁性分离或从固相上抽吸样品液体实施 分离，在一个实施方案中，随之通过缓冲液反复洗涤与固相结合的复合体。在一个实施方案 中，免疫测定为夹心免疫测定(参见例如Immunochemistry of Solid-Phase Immunoassay, John Ε. Butler,CRC Press，1991)。在这种免疫测定中，第一步中使聚乙二醇化胰岛素样生 长因子结合到固定于固相的抗体，该抗体特异性结合到聚乙二醇化胰岛素样生长因子的第 一表位。形成复合体后除去样品，并通过缓冲液反复洗涤复合体。随后向复合体中加入检 测分子，该检测分子结合到聚乙二醇化胰岛素样生长因子的与第一表位无重叠的表位。所 述检测分子通常或者直接地(例如缀合到荧光基团、放射标签或金属螯合物)或者间接地 (例如缀合到结合对的第一配偶体)缀合到可检测标签。聚乙二醇化胰岛素样生长因子被 “夹心”在抗体和检测分子之间。可进行第二洗涤步骤以便除去未结合的检测分子。最后可 检测的标签通过适当的检测剂进行检测。在本发明的免疫测定和方法的一个实施方案中， 抗体结合到聚乙二醇化胰岛素样生长因子或其聚乙二醇化变体的聚乙二醇部分，检测分子 结合到胰岛素样生长因子部分。本申请中使用的术语“样品”是指，但不限于，来自于活体或以前为活体的任意量 的物质。这样的活体包括但不限于人、小鼠、猴、大鼠、兔及其他动物。在一个实施方案中， 本发明的免疫测定或方法中的样品取自于小鼠、大鼠、犬、短尾猴或人。在另一个实施方案 中，本发明的免疫测定或方法中的样品来自于短尾猴或人。这样的样品包括但不限于个体 的全血、血清或血浆，它们是临床常规中最广泛使用的样品来源。本申请中使用的术语“固相”是指非流体物质，包括颗粒(包括微�：椭樽�)，其 通过下述材料制造如聚合物、金属(顺磁的、铁磁的颗粒)、玻璃和陶瓷；凝胶物质如二氧 化硅、铝和聚合物凝胶；毛细管，其可通过聚合物、金属、玻璃和/或陶瓷制造；沸石和其他 多孔物质；电极；微量滴定板；固体条；和试管、导管或其它分光计样品容器。测定的固相 成分与测定可能接触的惰性固体表面的不同之处在于“固相”在其表面上包含至少一个部
10分，该部分的目的在于与测定中使用的捕获分子相互作用。固相可以是固定不动的成分， 如导管、条、试管或微量滴定板，或可以是不固定的成分，如珠子和微粒。微粒也可用作异质 测定形式的固相。可以使用允许蛋白质和其它物质共价或非共价附着的多种微粒。这样 的颗粒包括聚合物颗粒如聚苯乙烯和聚(异丁烯酸甲酯)；金颗粒如金纳米颗�：徒禾褰�; 和陶瓷颗粒如二氧化硅、玻璃和金属氧化物颗粒。参见例如Martin，C. R.等，Analytical Chemistry-News & Features (1998) 322A-327A。本发明免疫测定的固相支持物在现有技术 中有广泛描述(参见例如 Butler, J. Ε.，Methods 22 (2000) 4-23)。色原(荧光或发光基团或染料)、酶、NMR活性基团或金属颗粒、半抗原(例如洋地 黄毒苷)是“可检测标签”的例子。可检测标签也可以是可光活化的交联基团，例如叠氮或 吖丙因(azirine)基团。在一个实施方案中，可检测的标签为可通过电化学发光检测的金 属螯合物，特别优选的是钌螯合物，例如钌(二吡啶基)32+螯合物。例如，在EP 0 580 979、 WO 90/005301, WO 90/11511和WO 92/14138中描述了适当的钌标签基团。为直接检测，标签基团可选自任何已知的可检测基团，如染料、发光标签基团(如 化学发光基团，例如吖啶酯或1，2_二氧杂环丁烷(dioxetane))、或荧光染料(例如荧光素、 香豆素、罗丹明、噁嗪、试卤灵、花菁及其衍生物)。标签基团的其他例子为发光金属复合体 (如钌或铕复合体)、酶(例如用于ELISA或CEDIA(Cloned Enzyme Donor Immunoassay，即 克隆酶供体免疫测定，例如EP-A-O 061 888)的酶)、和放射性同位素。间接检测系统包括，例如检测试剂通过生物亲和性结合对的第一配偶体标 记。适当结合对的例子为半抗原或抗原/抗体、生物素或生物素类似物如氨基生物素 (aminobiotin)，亚氨基生物素(iminobiotin)或脱硫生物素/抗生物素蛋白或链霉抗生物 素、糖/凝集素、核酸或核酸类似物/互补核酸、和受体/配体，例如类固醇激素受体/类固 醇激素。优选的第一结合对成员包括半抗原、抗原和激素。特别优选的是半抗原如洋地黄 苷毒素和生物素及其类似物。这样的结合对的第二配偶体，例如抗体、链霉抗生物素等等通 常被标记(例如通过前述的标签)从而允许直接检测。在本发明的免疫学检测方法中选择的试剂条件允许所用的试剂结合，例如将抗体 结合到聚乙二醇化胰岛素样生长因子。本领域技术人员将这样的结合事件的结果通过术语 “复合体”来表示。在本发明的测定方法中形成的复合体可用来确定存在，也可用来确定浓 度(即定量)。本申请中使用的术语“胰岛素样生长因子”是指SEQ ID NO :1(胰岛素样生长因子 I)或SEQ ID NO :2(胰岛素样生长因子II)的蛋白质或其变体。在一个实施方案中，胰岛素 样生长因子的变体是SEQ ID NO :1的胰岛素样生长因子同时其27位赖氨酸被极性氨基酸 取代，并且或者65位赖氨酸或68位赖氨酸被极性氨基酸取代。术语“极性氨基酸”是指精 氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺，即赖氨酸被精氨酸、谷氨酰胺或天冬酰胺取代。在一个实施方 案中所述极性氨基酸是精氨酸。在另一个实施方案中，所述聚乙二醇化胰岛素样生长因子 是单聚乙二醇化胰岛素样生长因子，其氨基酸序列为SEQ ID NO :1同时其27和65位赖氨 酸被极性氨基酸取代，并且PEG残基共价结合到68位氨基酸。在另一个实施方案中，所述 聚乙二醇化胰岛素样生长因子为单聚乙二醇化胰岛素样生长因子，其氨基酸序列为SEQ ID NO 1同时其27和68位赖氨酸被极性氨基酸取代，并且PEG残基共价结合到65位氨基酸。 在又一个实施方案中，所述聚乙二醇化胰岛素样生长因子为单聚乙二醇化胰岛素样生长因子，其氨基酸序列为SEQ IDNO :1同时其27位，或其27和65和/或68位赖氨酸被极性氨 基酸取代，并且PEG残基共价结合到所述因子的氨基末端。本发明的第一方面是检测聚乙二醇化胰岛素样生长因子的免疫测定，包含捕获抗 体、胰岛素样生长因子/胰岛素样生长因子结合蛋白复合体和示踪抗体，其中a)所述捕获抗体是单克隆抗聚乙二醇抗体，b)所述聚乙二醇化胰岛素样生长因子作为与洋地黄毒苷化胰岛素样生长因子结 合蛋白复合体而被检测，c)所述示踪抗体为单克隆抗洋地黄毒苷抗体。聚乙二醇(PEG)抗体是生物素酰化的，在一个实施方案中，其结合到固相(例如链 霉抗生物素包被的微量滴定板)。在第一孵育步骤中，作为参比标准或来自于测试样品的聚 乙二醇化胰岛素样生长因子或其聚乙二醇化变体结合到与固相缀合的抗聚乙二醇抗体。本 申请中使用的术语“聚乙二醇化胰岛素样生长因子”是指其上共价附着聚乙二醇残基的“胰 岛素样生长因子”。其后，洋地黄毒苷化检测试剂，在一个实施方案中为洋地黄毒苷化胰岛 素样生长因子结合蛋白(其是过量存在的)在第二孵育步骤中结合到前面形成的复合体。 在哺乳动物来源的样品中，胰岛素样生长因子一般与内源胰岛素样生长因子结合蛋白形成 复合体。为了确定聚乙二醇化胰岛素样生长因子，必须用本测定的洋地黄毒苷化胰岛素样 生长因子结合蛋白(因此其是过量添加的)替换内源胰岛素样生长因子结合蛋白。缀合到 辣根过氧化物酶的抗洋地黄毒苷抗体和ABTS溶液用作检测系统。在一个实施方案中，捕获抗体是完整抗体，即其包含轻和重链，其中轻链包含可变 域和恒定域，其中重链包括可变域、ChU CH2、CH3、和可选的CH4结构域以及铰链区。在不同 实施方案中，捕获抗体可选自所述抗聚乙二醇抗体的轻链、重链可变区、Fab、Fab’、F(ab)2、 或F(ab，)2片段，即其是所述抗聚乙二醇抗体的轻链、重链可变区、Fab、或Fab，、或F(ab)2、 或F(ab，)2片段。根据免疫球蛋白的重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白分为不同类型IgA、 IgD、IgE、IgG和IgM。这些类型中的一些进一步分成亚类(同种型)，即IgG分为IgGl、 IgG2、IgG3和IgG4，或IgA分为IgAl和IgA2。在一个实施方案中，捕获抗体是多聚抗体， 例如1#。可通过不同方法将示踪和/或捕获抗体缀合到其缀合配偶体，如被动吸附、化学 结合或通过特异性结合对结合。本文中使用的术语“缀合配偶体”是指例如固相、多肽、可 检测标签、或特异性结合对的成员。在一个实施方案中，捕获和/或示踪抗体与其缀合配偶 体的缀合是相互独立的，通过化学结合经抗体氨基酸骨架的N末端和/或ε氨基(赖氨 酸)、不同赖氨酸的ε氨基、羧基、巯基、羟基、和/或酚功能基团、和/或经抗体碳水化合 物结构的糖醇基团进行缀合。在一个实施方案中，捕获和/或示踪抗体通过特异性结合对 缀合到其缀合配偶体。在一个实施方案中，捕获抗体缀合到生物素并通过固定在固相的抗 生物素蛋白或链霉抗生物素固定到固体支持物。在一个实施方案中，示踪抗体缀合到辣根 过氧化物酶并且是抗洋地黄毒苷抗体。在另一个实施方案中，捕获抗体通过被动吸附缀合 到固相。通过被动吸附缀合到固相的抗体包括通过不同抗体位点缀合到固相的抗体混合 物。因此，通过被动吸附缀合到固相的捕获抗体是两种或更多不同缀合物的混合物，该缀合 物用于有效缀合到固相的抗体位点(即抗体氨基酸残基)不同。被动吸附是例如Butler，J. E.在"Solid Phases in Immunoassay，，(在 Diamandis,Ε· P.禾口 Christopoulos, Τ· K.编 辑 Jmmunoassay (1996)，Academic Press, San Diego 第 205-225 页中)所描述的那样。在本发明的一个实施方案中，捕获抗体通过特异性结合对固定。这样的结合对 (第一成分/第二成分)是，例如链霉抗生物素或抗生物素蛋白/生物素、抗体/抗原(参 见例如 Hermanson，G. T.等，Bioconjugate Techniques，Academic Press，1996)、凝集素 / 多糖、类固醇/类固醇结合蛋白、激素/激素受体、酶/底物、IgG/蛋白质A和/或G和/ 或L等等。在一个实施方案中，捕获抗体缀合到生物素并通过抗生物素蛋白或链霉抗生物 素固定。在另一个实施方案中，示踪抗体缀合到电化学发光标签(如钌二吡啶基复合体)。本发明的免疫测定利用胰岛素样生长因子与胰岛素样生长因子结合蛋白的特异 性相互作用。胰岛素样生长因子结合蛋白特异性结合到胰岛素样生长因子，检测所形成的 胰岛素样生长因子/胰岛素样生长因子结合蛋白复合体。这一复合体不能直接检测，因此 需要进一步的结合配偶体。所以，本发明的免疫测定包含作为核心成分的a)特异性结合到胰岛素样生长因子的捕获抗体，b)特异性结合到胰岛素样生长因子结合蛋白的示踪抗体。因此，本发明检测聚乙二醇化胰岛素样生长因子的免疫测定包含下述化合物(也 参见
图1)_ 固相，-捕获抗体，其特异性结合到聚乙二醇并缀合到固相，-胰岛素样生长因子结合蛋白，其或者直接缀合到可检测标签，或着缀合到结合对 的第一配偶体，-可选地，如果胰岛素样生长因子结合蛋白缀合到结合对的第一配偶体，则还包括 包含所述结合对的第二配偶体的示踪分子。缀合到固相的抗聚乙二醇抗体特异性结合到聚乙二醇化化合物的聚乙二醇残基。 如果将含有聚乙二醇化化合物的样品与缀合到固相的抗聚乙二醇抗体接触，聚乙二醇化化 合物将被抗聚乙二醇抗体结合，因此，将通过抗聚乙二醇抗体缀合到固相。在一个实施方案 中，抗聚乙二醇抗体是单克隆抗体，可以属于任何免疫球蛋白类型。在另一个实施方案中， 所述抗聚乙二醇抗体是IgM类型的单克隆抗聚乙二醇抗体。示例性的抗聚乙二醇抗体在US 7，320，791或WO 2002/094853中有报道。抗聚乙二醇抗体可共价或通过特异性结合对或通 过物理相互作用缀合到固相。在一个实施方案中，固相是微量滴定板的孔。在一个实施方案中，所述捕获抗聚乙 二醇抗体通过特异性结合对缀合到固相，例如通过链霉抗生物素/生物素特异性结合对， 由此抗聚乙二醇抗体通过共价键连接到生物素，并且固相通过共价键连接了链霉抗生物
ο本发明中术语“胰岛素样生长因子结合蛋白”包括胰岛素样生长因子结合蛋白胰 岛素样生长因子结合蛋白1、胰岛素样生长因子结合蛋白2、胰岛素样生长因子结合蛋白3、 胰岛素样生长因子结合蛋白4、胰岛素样生长因子结合蛋白5和胰岛素样生长因子结合蛋 白6。人胰岛素样生长因子结合蛋白1至6的序列在SwissProt Database (http //www. expasy. ch)中有详细描述并通过下述登录号鉴别
1权利要求
检测聚乙二醇化胰岛素样生长因子的免疫测定，包含捕获抗体和示踪抗体，其特征在于a)所述捕获抗体是单克隆抗聚乙二醇抗体，b)所述聚乙二醇化胰岛素样生长因子作为与洋地黄毒苷化的胰岛素样生长因子结合蛋白的复合体而得到检测，c)所述示踪抗体是单克隆抗洋地黄毒苷抗体，其中所述聚乙二醇化胰岛素样生长因子与所述洋地黄毒苷化的胰岛素样生长因子结合蛋白的孵育为室温下12至24小时，所述洋地黄毒苷化的胰岛素样生长因子结合蛋白的浓度为5.0μg/ml或更低。
2.根据权利要求1的免疫测定，其特征在于a)所述抗聚乙二醇抗体缀合到固相，并且b)所述抗洋地黄毒苷抗体缀合到可检测标签。
3.根据权利要求2的免疫测定，其特征在于所述缀合是通过共价键的缀合。
4.根据权利要求2或3中任一项的免疫测定，其特征在于所述可检测标签选自酶、抗 原、荧光基团、化学发光基团、电化学发光基团和金属螯合物复合体。
5.根据前述任一项权利要求的免疫测定，其特征在于所述聚乙二醇化胰岛素样生长因 子是聚乙二醇化胰岛素样生长因子I或其聚乙二醇化变体。
6.根据前述任一项权利要求的免疫测定，其特征在于所述胰岛素样生长因子结合蛋白 是胰岛素样生长因子结合蛋白4。
7.根据前述任一项权利要求的免疫测定，其特征在于所述聚乙二醇化胰岛素样生长因 子与所述洋地黄毒苷化胰岛素样生长因子结合蛋白的孵育为18至22小时。
8.根据前述任一项权利要求的免疫测定，其特征在于所述聚乙二醇化胰岛素样生长因 子与所述洋地黄毒苷化胰岛素样生长因子结合蛋白的孵育步骤中，所述洋地黄毒苷化胰岛 素样生长因子结合蛋白的浓度为0. 1 μ g/ml至5. 0 μ g/ml。
9.确定样品中聚乙二醇化胰岛素样生长因子的方法，包括下述步骤a)提供待分析的样品，b)将缀合到固相的抗聚乙二醇抗体与所述样品孵育，从而形成抗聚乙二醇抗体/聚乙 二醇化胰岛素样生长因子复合体，c)将b)中形成的所述复合体与洋地黄毒苷化胰岛素样生长因子结合蛋白4在室温下 孵育12至24小时，从而形成复合体，其包含b)中形成的复合体，所述洋地黄毒苷化的胰岛 素样生长因子结合蛋白4的浓度为5. 0 μ g/ml或更低，d)将c)中形成的所述复合体与辣根过氧化物酶缀合的抗洋地黄毒苷抗体孵育，从而 形成复合体，其包含c)中形成的复合体，e)通过将d)中形成的复合体与ABTS孵育并通过有色产物的形成确定聚乙二醇化胰岛 素样生长因子。
10.根据权利要求9的方法，其特征在于在步骤b)、C)、和/或d)之后进行洗涤步骤。
11.根据权利要求9或10的方法，其特征在于所述聚乙二醇化胰岛素样生长因子是聚 乙二醇化胰岛素样生长因子I或其聚乙二醇化变体。
12.根据权利要求9至11中任一项的方法，其特征在于所述聚乙二醇化胰岛素样生长2因子与所述洋地黄毒苷化胰岛素样生长因子结合蛋白4的孵育为18至22小时。
13.根据权利要求9至12中任一项的方法，其特征在于所述聚乙二醇化胰岛素样生长 因子与所述洋地黄毒苷化胰岛素样生长因子结合蛋白4的孵育中，所述洋地黄毒苷化胰岛 素样生长因子结合蛋白4的浓度为0. lyg/ml至5.0yg/ml。
14.根据权利要求9的方法在患者随访中的用途，该患者施用了聚乙二醇化胰岛素样 生长因子I或其聚乙二醇化变体。
15.确定样品中聚乙二醇化胰岛素样生长因子的试剂盒，包含a)链霉抗生物素包被的微量滴定板，b)缀合到生物素的抗聚乙二醇抗体，c)缀合到辣根过氧化物酶的抗洋地黄毒苷抗体，d)洋地黄毒苷化胰岛素样生长因子结合蛋白。
16.根据权利要求15的试剂盒，其特征在于b)和c)中所述抗体是单克隆抗体。
17.根据权利要求15或16的试剂盒，其特征在于所述抗聚乙二醇抗体是IgM类型。
18.根据权利要求15至17中任一项的试剂盒，其特征在于所述胰岛素样生长因子结合 蛋白是胰岛素样生长因子结合蛋白4。
19.定量确定样品中聚乙二醇化胰岛素样生长因子的量的方法，包括下述步骤a)提供待分析的样品，b)提供参比样品，其含有确定量的聚乙二醇化胰岛素样生长因子，c)将缀合到固相的抗聚乙二醇抗体与所述样品以及与至少两种含有不同量聚乙二醇 化胰岛素样生长因子的参比样品孵育，从而形成抗聚乙二醇抗体/聚乙二醇化胰岛素样生 长因子复合体，d)将c)中与各个样品和参比样品形成的所述复合体与洋地黄毒苷化胰岛素样生长因 子结合蛋白4孵育，从而形成第二复合体，其包含c)中形成的复合体，其中与洋地黄毒苷化 胰岛素样生长因子结合蛋白4的孵育为室温下12至24小时，所述洋地黄毒苷化胰岛素样 生长因子结合蛋白4的浓度为5. 0μ g/ml或更低，e)将d)中与各个样品和参比样品形成的所述复合体与辣根过氧化物酶缀合的抗洋地 黄毒苷抗体孵育，从而形成第三复合体，其包含d)中形成的复合体，f)将e)中与各个样品和参比样品形成的的复合体与ABTS孵育5至15分钟，并确定所 形成的有色产物的量，g)基于标准曲线定量确定所述样品中聚乙二醇化胰岛素样生长因子的量，该标准曲线 基于参比样品中所形成有色产物的量计算而得。
20.根据权利要求19的方法，其特征在于步骤d)中所述孵育为18至22小时。
全文摘要
本发明报道了确定聚乙二醇化胰岛素样生长因子的免疫测定，该免疫测定利用抗聚乙二醇抗体和抗洋地黄毒苷抗体检测胰岛素样生长因子/胰岛素样生长因子结合蛋白复合体。
文档编号G01N33/543GK101965516SQ200980108314
公开日2011年2月2日 申请日期2009年3月31日 优先权日2008年4月3日
发明者A·肖布马尔, J·施莱彭, K·朗, T·施洛特豪尔 申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司
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