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专利名称：电分析方法
技术领域：
本发明涉及电分析方法。需要说明的是，本说明书中的“分析”中包括判断是否存 在分析对象物质的“检测”，和定量地或半定量地确定分析对象物质的量的“测定”。
背景技术：
在诸如临床检查之类的生物样品分析中，由于测定微量成分的情况多，故要求检 测灵敏度或精度高的分析方法。作为这样的分析方法，除了利用特异性的相互作用、例如抗 原抗体反应或酶_底物反应之外，进一步地，还尝试通过结合电分析手段来实现高的检测 灵敏度。例如，专利文献1中公开了将免疫色谱法与电流检测型安培(amperometric)测定 法相结合，专利文献2中公开了在场效应晶体管或单电子晶体管的门极部分附加蛋白质或 酶得到的生物传感器。在上述现有技术中，以直接检测复合体为特征，该复合体通过特异性 的相互作用由电极或门极部分形成。另一方面，代替特异性的相互作用而在非专利文献1、专利文献3、专利文献4中公 开了利用通过化学反应在传感部析出或吸附的方法。非专利文献1中公开了将下述电化学变化作为电流的变化进行检测的方法，即通 过还原溶解于反应液中的银离子使银沉积于传感部后，将其再氧化而生成银离子时的电化 学的变化。专利文献3中公开了下述检测方法，即在使用使胆碱酯酶结合的标记抗体作为标 记酶，由测定胆碱酯酶的活性而测定样品中的被检物质的浓度或量的方法中，将前述酶分 解物即硫代胆碱吸附于贵金属电极并浓缩，增幅该硫代胆碱的电极中的因还原脱吸而发生 的电流信号而检测前述酶活性的方法。专利文献4中公开了将酶标记抗体的循环反应生成物即硫醇化合物的量或生成 速度作为测定对形成于绝缘栅场效应晶体管上的金电极上的吸附速度而进行测定的装置 以及方法。在上述现有技术中，在非流动条件下实施化学反应及电检测。进一步地，专利文献5中公开了一种生物传感器，其为检测生物分子中的特异性 结合相关的分子的生物传感器，其特征在于，包括(i)进行a)特异性结合反应以及b)酶 反应的反应部、(ii)反应a)及b)所生成的氧化还原反应生成物与氧化还原物质膜发生反 应的检测部、(iii)测定与氧化还原反应生成物的反应所引起的氧化还原物质膜的状态变 化从而求出介电常数变化的测定部。该现有技术与上述专利文献1或2中所记载的现有技术相同，均不在传感部上生 成沉淀专利文献1 日本特开2001-153838号公报专利文献2 日本特开平10-260156号公报专利文献3 日本特开2004-257996号公报
专利文献4 日本特开2007-263914号公报专利文献5 日本特开2005-24483号公报非专利文献1 “分析化学(Analytical Chemistry)”，(美国)，2005 年，77 卷， 579-584 页

发明内容
发明所要解决的课题尽管上述现有技术是公知的技术，但在测定微量成分时，更高的检测灵敏度和精 度受到要求。本发明人发现，在利用电分析法中的通过化学反应产生于传感部的沉淀、析 出、或吸附的前述各种现有技术中，在为了促进沉淀等而在非流动条件下进行测定是常识 的状况下，通过与该技术常识相反而在流动条件下实施测定，能够显著提高检测灵敏度和 精度。因此，本发明的课题在于提供相比于现有公知的分析方法而言具有更高的检测灵 敏度和精度的分析方法。解决课题的方法本发明涉及[1]分析方法，其特征在于，该方法包括(a)至少使分析对象物质以及与前述分析对象物质显示选择性相互作用的特异性 伴侣发生反应以相关于被检测样品中的分析对象物质的存在量，并通过实施不溶化反应， 使可溶性物质变换为不溶性物质以沉淀于传感部的步骤；(b)对沉淀于前述传感部的不溶性物质进行电分析的步骤，且前述步骤(a)或步骤(b)中的至少一个步骤在流动性条件下实施；[2]如[1]所述的分析方法，其中，前述特异性伴侣为酶；[3]如[1]所述的分析方法，其中，前述步骤(a)包括(1)形成复合体的步骤，该复合体与被检测样品中的分析对象物质的存在量相关 并含有分析对象物质、与前述分析对象物质显示选择性相互作用的特异性伴侣、以及标记 物质，和(2)通过由所形成的前述复合体中含有的标记物质直接或间接地引起的不溶化反 应，使可溶性物质变换为不溶性物质以沉淀于传感部的步骤，且前述步骤(2)或步骤(b)中的至少一个步骤在流动性条件下实施；[4]如[3]所述的分析方法，其中，前述标记物质为水解酶；[5]如[4]所述的分析方法，其中，前述水解酶为碱性磷酸酶；[6]如[1] [5]所述的分析方法，其中，前述不溶化反应为氧化还原反应；[7]如[1] [6]所述的分析方法，其中，前述可溶性物质选自无机离子、有机离 子、酶底物或其反应生成物、色素；[8]如[7]所述的分析方法，其中，前述可溶性物质为金属离子；[9]如[8]所述的分析方法，其中，前述金属离子为银离子；[10]如[1] [9]所述的分析方法，其中，前述传感部由金属、高分子、碳、纳米管 状结构体、石墨、无机物质单独或组合构成；
[11]如[1] [10]所述的分析方法，其中，前述传感部具有至少一个以上的锐角 状的立体结构；[12]如[1] [11]所述的分析方法，其中，前述特异性伴侣被固定于前述传感 部；[13]如[1] [12]所述的分析方法，其中，前述流动条件为强制性流动或自发性 流动；[14]如[1] [13]所述的分析方法，其中，含有前述电分析步骤的分析方法为安 培型分析法；[15]传感部，其是用于[1] [14]的分析方法的传感部，前述传感部具有至少一 个以上的锐角状的立体结构；[16]试剂以及试剂盒，其是以用于前述分析方法为特征的、用于测定分析对象物 的试剂以及试剂盒，所述试剂以及试剂盒含有与前述分析对象物显示选择性相互作用的特 异性伴侣、由不溶化反应变换为不溶性物质的可溶性物质以及至少一个前述传感部；[17]如[16]所述的试剂及试剂盒，其中，作为具有传感部的分析用筒体 (cartridge)而含有上述传感部。根据本发明，可以实施比现有公知的分析方法的检测灵敏度和精度更高的分析。


图1是模式地显示本发明的分析方法的一个方式中所用的一连串反应的说明图；图2是模式地显示实施例1中所制作的电极部的平面图；图3是模式地显示图2所示电极部的制作中所使用的掩模图案；图4是模式地显示实施例1中所制作的生物传感器单元的立体图；图5是模式地显示图4所示生物传感器单元的制造程序的说明图；图6是模式地显示图4所示生物传感器单元的内部结构的剖面图；图7是模式地显示图4所示生物传感器单元的平面图；图8是模式地显示将图4所示生物传感器单元与流动条件控制装置以及电化学分 析仪相连接的状态的平面图；图9是显示HBs抗原(抗原浓度=OU/mL)的CV测定结果的图；图10是显示HBs抗原(抗原浓度=48U/mL)的CV测定结果的图；图11是显示不存在银离子的条件下HBs抗原(抗原浓度=48U/mL)的CV测定结 果的图；图12是显示在各种浓度(抗原浓度=0、24、48U/mL)的HBs抗原的CV测定中电 势为+0. 138V时的氧化电流值的图；图13是显示在各种浓度(葡萄糖浓度=0、100、200mg/dL)的葡萄糖的CV测定中 电势为+0. 086V时的氧化电流值的图；图14是显示葡萄糖(葡萄糖浓度=Omg/dL)的CV测定结果的图；图15是显示葡萄糖(葡萄糖浓度=200mg/dL)的CV测定结果的图；图16是显示在非流动条件下葡萄糖(葡萄糖浓度=Omg/dL)的CV测定结果的 图17是显示在非流动条件下葡萄糖(葡萄糖浓度=200mg/dL)的CV测定结果的 图；图18是显示使用GOD未固定于作用电极的电极时的葡萄糖(葡萄糖浓度= 200mg/DL)的CV测定结果的图；图19是显示在实施例3中的条件1 (步骤A/步骤B =流动/流动)下HBs抗原 的CV测定结果的图；图20是显示在实施例3中的条件2 (步骤A/步骤B =流动/非流动)下HBs抗 原的CV测定结果的图；图21是显示在实施例3中的条件3 (步骤A/步骤B =非流动/非流动)下HBs 抗原的CV测定结果的图；图22是模式地显示实施例4中所制作的保持电极部的免疫色谱试条“ 口 7卜夕‘，7 7卜7 )结构的说明图；图23是图22所示保持电极部的免疫色谱试条的平面示意图；图24是模式地显示构成图22所示保持电极部的免疫色谱试条的试剂添加池的立 体图(单位:mm)；图25是模式地显示图24所示试剂添加池的平面图(单位mm)；图26是显示HBs抗原(抗原浓度=OU/mL)的CV测定结果的图；图27是显示HBs抗原(抗原浓度=18U/mL)的CV测定结果的图；图28是显示HBs抗原(抗原浓度=36U/mL)的CV测定结果的图；图29是显示在各种浓度(抗原浓度=0、24、48U/mL)的HBs抗原的CV测定中电 势为+0. 132V时的氧化电流值的图；图30是显示实施例5中所制作的保持电极部的毛细管流路的结构的立体图；图31是模式地显示构成图30所示保持碳电极部的毛细管流路的试剂添加池的立 体图(单位:mm)；图32是模式地显示图30所示试剂添加池的平面图(单位mm)；图33是显示保持碳电极的毛细管流路中的HBs抗原(抗原浓度=OU/mL)的DPV 测定结果的图；图34是显示保持碳电极的毛细管流路中的HBs抗原(抗原浓度=0. 25U/mL)的 DPV测定结果的图；图35是显示保持碳电极的毛细管流路中的HBs抗原(抗原浓度=2. 5U/mL)的 DPV测定结果的图；图36是显示在各种浓度(抗原浓度=0,0. 25,2. 5U/mL)的HBs抗原的DPV测定 中电势为+0. 165V时的氧化电流值的图；图37是显示NaCl浓度为OmmoL/L时碳电极中的HBs抗原(抗原浓度=OU/mL) 的DPV测定结果的图；图38是显示NaCl浓度为0. 5mmoL/L时碳电极中的HBs抗原(抗原浓度=OU/mL) 的DPV测定结果的图；图39是显示NaCl浓度为ImmoL/L时碳电极中的HBs抗原(抗原浓度=OU/mL) 的DPV测定结果的图40是显示NaCl浓度为2mmoL/L时碳电极中的HBs抗原(抗原浓度=OU/mL) 的DPV测定结果的图；图41是显示NaCl浓度为OmmoL/L时碳电极中的HBs抗原(抗原浓度=45U/mL) 的DPV测定结果的图；图42是是显示NaCl浓度为0. 5mmoL/L时碳电极中的HBs抗原(抗原浓度=45U/ mL)的DPV测定结果的图；图43是显示NaCl浓度为ImmoL/L时碳电极中的HBs抗原(抗原浓度=45U/mL) 的DPV测定结果的图；图44是显示NaCl浓度为2mmoL/L时碳电极中的HBs抗原(抗原浓度=45U/mL) 的DPV测定结果的图；图45是模式地显示实施例7所制作的电极部的平面图；图46是图45所示电极的光学显微镜图像；图47是图45所示电极的电子显微镜图像；图48是显示在立体结构化电极中，HBs抗原(抗原浓度=OU/mL)的DPV测定结 果的图；图49是显示在立体结构化电极中，HBs抗原(抗原浓度=0. 7U/mL)的DPV测定 结果的图；图50是显示在平面电极中，HBs抗原(抗原浓度=OU/mL)的DPV测定结果的图；图51是显示在平面电极中，HBs抗原(抗原浓度=0. 7U/mL)的DPV测定结果的 图。
具体实施例方式本发明为在组合利用选择性相互作用(例如抗原抗体反应、酶-底物反应)与不 溶化反应(优选为氧化还原反应)的分析方法中，通过前述不溶化反应使最终所产生的不 溶性生成物质在传感部表面沉淀(沉积、不溶化、析出)，从而对该沉淀的不溶性物质进行 电分析(检测或测定)的方法，其特征在于所述不溶化反应或电分析的至少一个步骤在流 动条件下实施。在本发明的分析方法中，根据所利用的选择性相互作用或不溶化反应的不同，例 如含有下述方法等，(1)通过可直接地或间接地标记于选择性相互作用相关的一方伴侣的标记物质， 而直接地或间接地引起不溶化反应的方法(以下称作复合体形成型分析方法)；(2)通过选择性相互作用本身，而直接地或间接地引起不溶化反应的方法(以下 称作酶利用型分析方法)。需要说明的是，上述区分是基于是否通过选择性相互作用形成复合体而区分的， 例如，使用酶作为标记物质的方法包含于复合体形成型分析方法中。本说明书中，所谓“直接地引起不溶化反应”是指标记物质或选择性相互作用相关 的反应自身为不溶化反应，通过前述反应生成不溶性物质。另外，“间接地引起不溶化反应” 是指，由标记物质或选择性相互作用相关的反应所生成的物质作为触发物(trigger)，最终 通过不溶化反应而生成不溶性物质。
在说明了本发明的概略后，以下，基于图1所示的本发明的复合体形成型分析方 法的一个具体实施方式
的反应模式图，对本发明进行更详细地说明。图1所示的分析体系中，以抗原3为分析对象物质，作为选择性相互作用而利用抗 原抗体反应(三明治法)，作为试剂之一，使用经酶(例如碱性磷酸酶(ALP))标记的ALP标 记抗体4作为与前述抗原特异性反应的抗体。另外，该分析体系中，作为由标记酶引起的酶反应，利用如下所示的反应式1，作为 不溶化反应而利用反应式2。需要说明的是，在图1中，pAPP表示对氨基苯基磷酸酯，pAP 表示对氨基苯酚，PQI表示对醌亚胺，PAPP为ALP的底物。另外，在反应式1中的“ (ALP)，， 表示ALP作为反应式1的催化剂而相关。进一步，作为电分析法，使用安培型分析法，该安培型分析法利用具备作用电极1、 对电极、以及参考电极的电极部。对氨基苯基磷酸酯一对氨基苯酚(ALP)(反应式1)对氨基苯酚+2Ag+—对醌亚胺+2H++2Ag丨(反应式2)Ag —Ag++e-(反应式 3)在图1所示的分析体系中，构成安培型电极部的作用电极1中预先固定有相对于 分析对象物质(抗原)的抗体2，前述作用电极作为传感部而起作用。将含有分析对象物 质(抗原3)的被检测样品与ALP标记抗体4沿着箭头A所示的流动方向从前述传感部的 上游供至分析体系，在传感部上形成固定抗体/抗原/ALP标记抗体的复合体。前述复合体 的形成量与被检测样品中的分析对象物质存在量相关。在形成前述复合体后或形成同时， 如果将标记酶ALP的底物即对氨基苯基磷酸酯(pAPP)从前述传感部的上游供至分析体系， 则变换为对氨基苯酚(pAP)(反应式1)，此时如果共存有银离子(Ag+、水溶性)，则银(Ag， 水不溶性)析出(反应式2)，并沉淀于传感部上。由于在传感部上通过再氧化而使电流从 作用电极流向对电极(反应式3)，因此沉淀于传感部(作用电极)上的银的量可以通过测 定该氧化电流而确定。具体地，将作用电极、对电极、参考电极连接于恒电位仪，相对于参考 电极电势而扫描作用电极电势，以测定伴随银的再氧化而发生的氧化电流。本发明中可以利用的选择性相互作用没有特殊的限制，只要是其中一方可以成为 分析对象物质的相互作用，且与被检测样品中的分析对象存在量相关，能够直接地或间接 地实施不溶化反应或能够形成复合体即可，作为代表性的选择性相互作用，可以举出例如 抗原抗体反应、核酸间杂交反应、酶-底物反应、核酸-蛋白质间相互作用、受体-配体间 相互作用、蛋白质间相互作用(例如IgG与蛋白质A的反应)、低分子-蛋白质间相互作用 (例如生物素与亲和素的反应)。上述的选择性相互作用的多数为能够形成复合体(例如 免疫复合体)的选择性相互作用，但上述酶_底物反应中，与被检测样品中的分析对象存在 量相关的不溶化反应或成为不溶化反应的触发物的反应是可能的。另外，除了前述相互作用之外，存在显示选择性相互作用的特异性伴侣的种种物 质是公知的，作为分析对象物质，例如可以举出蛋白质(酶、抗原/抗体、凝集素等)、肽、脂 质、激素(包含胺、氨基酸衍生物、肽、蛋白质等的含氮激素，以及类固醇激素)、核酸、糖链 (例如糖、寡糖、多糖等)、药物、色素、低分子化合物、有机物质、无机物质、或上述物质的融 合体、或构成病毒或细胞的分子、血球等。例如，作为选择性相互作用而利用抗原抗体反应时，则分析对象物质与其特异性伴侣的组合成为抗原(分析对象物质)与抗体(特异性伴侣)的组合、或抗体(分析对象 物质)与抗原(特异性伴侣)的组合。另外，作为选择性相互作用而利用酶-底物反应时， 则分析对象物质与其特异性伴侣的组合成为底物(分析对象物质)与酶(特异性伴侣)的 组合、或酶(分析对象物质)与底物(特异性伴侣)的组合。作为含有上述分析对象物质的被检测材料，除了血液(全血、血浆、血清)、淋巴 液、唾液、尿、大便、汗、粘液、泪、脑脊液、鼻液、颈部或阴道的分泌液、精液、胸膜液、羊水、腹 水、中耳液、关节液、胃吸引液、组织·细胞等的提取液或破碎液等生物液之外，可使用包括 食品、土壤、植物的提取液或破碎液等溶液或河水、温泉水、饮料水、污染水等基本所有的液 体样品。基于所利用的选择性相互作用，可以适当选择含有标记化的试剂构成，例如，利用 抗原抗体反应时，可以利用各种公知方法、例如三明治法、二段法、竞争法、抑制法等。在三 明治法的情况下，如图1所示，可以利用固定伴侣与标记伴侣的组合。在二段法的情况下， 可以利用固定伴侣、未标记伴侣、只与前述未标记伴侣特异性反应的物质的标记化物的组 合，具体地，可以使用利用一次抗体/标记化二次抗体的方法、利用生物素化抗体/标记 化亲和素的方法等。在竞争法的情况下，可以利用分析对象物质(标准物质)的标记化物 (已知量)与固定伴侣的组合。本发明中所用的可溶性物质是在受到不溶化反应前在分析体系所使用的溶剂中 呈可溶性，且通过受到前述不溶化反应变换为在前述溶剂中呈不溶性的物质的物质，进一 步，由前述不溶化反应生成的前述不溶性物质只要能够进行电学性分析即可，没有特殊的 限制。需要说明的是，在本说明书中“不溶化反应”包括从可溶性物质通过“不溶化反应”而 生成溶解度低的物质的反应。另外，在本说明书中“可溶性”与“不溶性”是根据分析体系所 使用的溶剂体系而可以适当定义的用语，例如使用水系溶剂的情况下是指“水溶性”与“水 不溶性”，使用有机溶剂的情况下是指“有机溶剂可溶性”与“有机溶剂不溶性”。下面，主要 以使用水系溶剂的情况(即，使用通过不溶化反应而将水溶性物质变换为水不溶性物质的 体系的情况)为例进行说明，但在使用水之外的溶剂的情况下，只要是本领域技术人员，则 通过进行适当必要的变更即可以实施本发明。作为本发明中所使用的水溶性物质，只要是在受到不溶化反应前在分析体系所使 用的水系溶剂中呈可溶性，且通过受到前述不溶化反应变换为在前述水系溶剂中呈不溶性 的物质的物质即可，没有特殊的限制，例如可以举出无机离子(优选金属离子)、有机离子、 酶底物或其反应生成物、色素等。作为上述金属离子，例如可以举出锑离子、铋离子、铜离子、水银离子、银离子、钯 离子、钼离子、金离子。这些金属离子在水性溶剂中为水溶性，也可以是金属配合物(优选 为金属配合物离子)的状态，通过不溶化反应而作为金属析出。另外，作为金属离子，可以使用2价阳离子(例如铜离子、镍离子、铁离子)。上述 2价阳离子在水性溶剂中为水溶性，与[Fe(CN)6]3-离子(例如由[Fe(CN)6]4-离子的氧化而 生成的[Fe (CN) 6] 3_离子)结合则作为金属复合体MH[Fe(CN)6] (Μ :2价阳离子)而析出。需要说明的是，金属离子被还原而发生不溶化(析出)的反应依赖于各物质所具 有的氧化还原电势的大小。也就是说离子化倾向越小越易于作为金属而析出，因此并不受 前述反应限定。另外，由于离子在溶液中的电化学活度等、其他因素(温度、ΡΗ、离子强度、反应液组成等)严重地影响析出的容易度，本说明书中所说的析出的金属应该作最广义的 解释，在任何意义上均不能做限定解释。例如，通过使与金属离子形成不溶性盐的离子在不 溶化反应时共存，也可以控制不溶化的程度。另外，有时优选不使形成不溶性盐的离子在不 溶化反应时共存，而使其作为金属不溶化而析出的情况。不溶化反应时的形成不溶性盐的 离子的存在量，只要是本领域技术人员，则可以确定适合的适宜条件。适宜条件可以确定为 0 5mmol/L以下、优选为0 2mmol/L、较优选为0 lmmol/L、进一步优选为0 0. 5mmol/ L的范围内。进一步，作为被析出的物质，不限于金属离子，只要是满足上述条件的物质，可 以适宜地使用。作为能够用作水溶性物质的色素，例如可以举出席夫(Schiff)试剂、苯胺。席夫 试剂在水性溶剂中为水溶性，2个分子的醛基(例如，通过羧基的还原而生成醛基)与1个 分子的席夫试剂相结合，通过还原反应而作为赤紫色的化合物析出。另外，苯胺在水性溶剂 中为水溶性，通过氧化反应作为聚苯胺而析出。另外，作为前述水溶性色素，例如可以举出5-溴-4-氯-3-羟基吲哚( 5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindole) (BCI) > it ^ 5ft S 0 M M (Nitro Blue Tetrazolium Chloride) (NBT)、吲哚，通过还原反应而作为不溶性物质即5，5’ - 二 溴-4，4，二氯-靛蓝(5，5 ‘ -dibromo-4,4 ‘ -dichloro-indigo) (2BCI)、BCI/ 硝基 四氮唑蓝双甲(NBTDiformazan)、靛蓝析出。前述色素例如可以通过基于标记酶(例 如碱性磷酸酶，ALP)的酶反应，而由适当的酶底物例如5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸酯 (5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate) (BCIP)、3_吲哚酰磷酸酯生成。因此，前述BCI、 吲哚也是酶底物的反应生成物。例如，使用酶底物BCIP的情况下，通过ALP相关的酶反应而形成BCI，通过还原反 应而析出2BCI。另外，使用酶底物BCIP与色素NBT的混合物的情况下，通过基于ALP的酶 反应的ALP的酶反应而生成2BCI，同时通过还原反应生成NBT双甲，从而析出其复合体即 2BCI/NBT双甲。另外，使用酶底物3-吲哚酰磷酸酯的情况下，通过ALP的酶反应形成吲哚， 通过还原反应而作为靛蓝析出。在上述例子中，通过用作标记物质的ALP相关的酶反应，继而引起不溶化反应，其 结果水溶性物质被变换为水不溶性物质。本发明中包括，标记物质作为引发物间接性地引 起不溶化反应的方式，与通过标记物质直接性地引起不溶化反应的方式。作为能够用作水溶性物质的酶底物，除了上述的PAPP (或其衍生物)之外，可以举 出硫代胆碱的酯衍生物，例如乙酰硫代胆碱、丙酰硫代胆碱、丁二酰二硫代胆碱、丁酰硫代 胆碱。如果将硫代胆碱的酯衍生物与前述金属离子(例如金、银等)同时使用，则通过基于 适当的标记酶(例如胆碱酯酶，更具体地，乙酰胆碱酯酶、酰基胆碱酯酶等)的酶反应，金属 离子被还原作为金属而析出。另外，通过前述酶反应生成硫代胆碱，通过硫代胆碱的硫醇基 与所析出的前述金属的一部分结合而作为金属-硫代胆碱复合体析出。进一步地，所生成 的硫代胆碱，对于形成基板或电极的金属(例如金基板或金电极)也可通过介由硫醇基结 合而析出。对于酶底物乙酰硫代胆碱或丙酰硫代胆碱可以使用标记酶乙酰胆碱酯酶，对于 酶底物琥珀酰二硫代胆碱或丁酰硫代胆碱可以使用标记酶酰基胆碱酯酶。另外，作为水溶性物质可以使用芳基重氮盐，例如R-Ph-N2BF4等。使用芳基重氮盐 的情况下，可以通过还原反应产生化学活性强的活性自由基，并以共价键结合至使用各种传感部，优选碳、石墨、碳纳米管的检测部。以上对可以用于本发明的分析方法(包括复合体形成型分析方法与酶利用型分 析方法两者)的可溶性物质(特别是水溶性物质)进行了说明，但本发明的复合体形成型 分析方法中，根据所用的可溶性物质、反应体系，可以适当地选择标记物质。例如，除了上述 ALP或胆碱酯酶等水解酶之外，还可以使用转移酶、裂解酶、连接酶、异构酶、氧化还原酶等， 作为氧化还原酶，可以使用例如葡萄糖氧化酶(GOD)、过氧化物酶、黄嘌呤氧化酶、氨基酸氧 化酶、抗坏血酸氧化酶、酰基CoA氧化酶、胆固醇氧化酶、半乳糖氧化酶、草酸氧化酶、肌氨 酸氧化酶等。上述酶可以直接地或间接地引起不溶化反应(例如氧化反应、还原反应、水解 反应、脱水反应、加成聚合、缩合聚合(缩聚)、中和反应)，只要是通过前述不溶化反应，可 以将可溶性物质变换为不溶性物质，并通过在固体表面析出、结合、沉积等而引起吸附、沉 积反应的酶即可，没有特殊的限制，可以单独使用1种酶，或者将2种以上的酶组合使用。另外，除了上述的酶之外，可以使用各种还原剂或氧化剂。另一方面，作为可以用于本发明的酶利用型分析方法中的酶，可以使用酶或酶底 物的任一方作为分析对象物质的酶，例如可以从在复合体形成型分析方法中能够使用的上 述酶中选择1种以上的酶。本发明中所采用的电分析方法，只要是对在传感部表面所沉淀的不溶性物质进行 电分析即可，没有特殊的限制。在本说明书中，“电分析”包括捕捉在传感部表面的电荷变化 作为电流变化的分析、捕捉在传感部表面的电荷变化作为电压(电势)变化的分析、捕捉作 为传感部表面的电阻(或阻抗)的变化的分析等。作为本发明中所使用的电分析方法，例 如可以举出利用至少具备作用电极与对电极的电极的安培型分析法、利用晶体管的伏安测 量A夕7 乂卜丨J ^夕)型测定法。在上述安培型分析法中，作为电流变化可以捕捉传感部表面的电荷变化。安培型 电极，在基板上至少具有作用电极与对电极，根据需要还包括参考电极。安培型分析法是下 述方法，通过在作用电极与对电极之间对电极部附近所发生的电极活性物质或电阻性物质 (绝缘性物质)施加预定电压，并测定在两电极间流动的对应于前述电极活性物质或电阻 性物质(绝缘性物质)的量的电流信号，或者通过作用电极与对电极间的施加电压值来区 分在电极部附近所发生的电极活性物质或电阻性物质(绝缘性物质)的不同。例如，作为水溶性物质而使用金属离子的情况下，在沉淀有金属的传感部上相对 于参考电极施加电压，由此将沉积于传感部的金属再氧化为金属离子，从而能够将传感部 的电化学变化作为电流变化而检测。另外，作为捕捉电流变化的方法，除了电流测定之外，可以使用循环伏安测量、微 分脉冲伏安测量、计时安培测量、微分脉冲安培测量等周知的方法。在前述伏安测量型分析法中，作为电压(电势)变化而捕捉传感部表面的电荷变 化。伏安测量型分析法中所利用的晶体管，是将输入至门电极的电压信号变换为从源电极 或漏电极输出的电流信号的元件，如果在源电极与漏电极之间施加电压，则存在于两者间 所形成的通道中的荷电粒子在源电极与漏电极之间沿着电场方向移动，作为电流信号而从 源电极或漏电极输出。此时，所输出的电流信号的强度与荷电粒子的密度成比例。如果在隔 着绝缘体设置于通道上方、侧面、或下方等的门电极上施加电压，则通道中所存在的荷电粒 子的密度发生变化，因此利用这一点通过使门电压发生变化而能够使电流信号发生变化。
例如，作为水溶性物质使用乙酰硫代胆碱的情况下，可以将通过乙酰胆碱酯酶而 在传感部所沉积的硫代胆碱所引起的传感部中的电荷变化作为电压(电势)变化而检测。作为传感部的优选方式，在前述传感部为导电性的情况下，只要是导电性物质即 可，可以单独使用或组合使用金、银、钼、铑、钌、铱、水银、钯等金属或锇聚合物等高分子、 碳、纳米管状结构体(碳纳米管)、石墨、无机物质。另外，由前述物质所构成的物质的形状， 只要不抑制反应即可，可以包括平面、凹凸、粒子(胶体金等)状物质等。作为前述纳米管状结构体的优选方式，为选自由碳纳米管、氮化硼纳米管、氧化钛 纳米管所形成的组的结构体。另外，只要传感部具有导电性，则传感部的构成中可与上述导电性物质一道添加 非导电性物质。作为非导电性物质，可以举出聚酯系树脂等不溶性载体等。作为传感部的其他优选方式，传感部优选为使用纳米管状结构体(碳纳米管)的 场效应晶体管或单电子晶体管的门电极，纳米管状结构体优选为选自由碳纳米管、氮化硼 纳米管、氧化钛纳米管所形成的组的结构体。作为传感部的其他优选方式，为了增大传感部的表面积，可以使用诸如用于免疫 色谱等的硝酸纤维素膜的多孔载体或国际公开第W02006/038456号小册子所记载的高分 子聚合物或乳胶载体等不溶性载体(或不溶性粒子)，进一步地，也可以与上述物质一道使 用导电性聚合物或导电性载体等导电性物质以在传感部的表面形成三维体。通过上述传感 部表面形成三维体，可以显著增加传感部的表面积，从而提高检测灵敏度。另外，作为传感部的其他优选方式，为了在流动性条件下提高传感部的生成物质 的沉淀(沉积、不溶化、析出)效率，可通过对传感部设置井状、凹凸、凸状、间壁等，来防止 在流动性条件下沉积(不溶化、析出、堆积)的生成物质向流动方向(例如下游)流出。另 外，通过设置前述结构物，可以期待提高所沉淀的生成物质的反应性的效果。前述结构物， 可以只形成于传感部，或者，也可以形成于电极部或生物传感器单元，而以其一部分存在于 传感部的方式形成。具体地，优选具有锐角的立体结构的形状，可举出多面体、多角柱、球、圆柱、锥体 等，特别优选锥状。传感部只要形成包括至少1个以上的锐角部位或突起的立体结构即可， 但优选形成多个立体结构。立体结构的个数或大�。�或锐角形状的个数、以及上述形状或配 置，可以结合测定条件而选择适当的物质。所谓为锐角，只要在传感部所形成的立体结构的 一部分或整体显示端部效果(端效果、边缘效果)的结构即可。端部效果是指电镀等领域中 所周知的效果，是在锐角端电荷发生集中的效果，通过本效果推测例如作为生成物质(不 溶性物质)的银等金属再度积极地发生金属离子化，而能够提高检测灵敏度。分析对象物质与特异性伴侣之间的选择性相互作用反应，是在特异性伴侣被固定 的位置进行。前述特异性伴侣被固定的位置，只要能进行选择性相互作用，且此后能进行电 学测定即可，没有特殊限制，优选可以为传感部表面。另外，前述特异性伴侣的固定方法，没有直接地固定还是间接地固定等限制，可以 结合选择性相互作用反应的性质，而使用任意的方法。例如，可以直接地物理吸附于或通过 共价键而结合于基板上，也可以预先介由在基板上具有锚部的柔性间隔物而间接地结合。 另外，例如使用金等贵金属为基板的情况下，也可以介由自组织化膜而结合。另外，在该特异性伴侣固定之后，可以通过牛血清白蛋白、聚环氧乙烷或其他惰性分子对表面进行处理，或通过在特定物质的固定层之上被覆吸附层以抑制非特异性反应， 或选择、控制能够通过的物质。在本发明的酶利用型分析方法中，实施基于选择性相互作用的不溶化反应步骤 (a)以及电分析步骤(b)。另外，在本发明的复合体形成型分析方法中实施基于选择性相 互作用的复合体形成步骤(al)、基于前述复合体中所含有的标记物质的不溶化反应步骤 (a2)以及电分析步骤(b)。上述步骤的实施顺序通常以上述顺序实施，但是只要能获得与 被检测样品中的分析对象物质的存在量相关的电信号，则也可以同时实施相邻步骤(或其 一部分)。另外，在本发明中，在前述步骤中，不溶化反应步骤或电分析步骤的至少一个步骤 在流动性条件下实施。在本说明书中“流动性条件下”是指在该步骤的整个期间持续地同时且连续或不 连续地实施对反应体系供给新鲜反应用液体至所需的反应部界面，和排出反应后的反应 液。“流动性条件下”的该反应部优选为进行步骤(a)或步骤(a2)的不溶化反应部或/和 进行步骤(b)的传感部。另外，流动方向不限于一个方向，进一步地，为了促进所需反应，在 所需的步骤中可以发生往复、振动或对流。例如在分批法中，一旦供给所需量的反应用液后，进行预定时间的所需反应，在反 应结束后排出反应液，但在本发明方法中，同时进行反应用液的供给和反应液的排出。需要 说明的是，在本发明方法中，在所需步骤的整个期间内，通常同时地、连续地实施上述供给 和排出，但只要能充分获取本发明的效果，也可以同时地、不连续地(即，伴随有供给和排 出的暂时停止)实施前述供给以及排出。前述流动中包括强制性流动和自发性流动两者，作为强制性流动的例子可以举出 利用基于机械、电、手动方法的、基于泵、离心、搅拌、超声、磁场等或挤压的、加压、抽吸或振 动的流动，作为自发性流动的例子可以举出毛细管作用或自由下落等自发性流动。上述方 法，即可以用于经微加工的流动或分支流动或毛细管流动或贯通流动的流路中，也可以用 于免疫色谱法等的膜条(membrane strip)中。本发明的流动性条件下的流速，只要是生成的不溶性物质能够在传感部上沉淀的 速度，且是流动性(除了静置状态以外)即可，没有特殊的限制。前述流速，根据各种条件， 例如所利用的选择性相互作用或不溶化反应、所使用的标记物质、可溶性物质、或氧化还原 性物质、流路尺寸、所使用的电分析方法等而变化，但只要是本领域技术人员，例如按照后 述的实施例中所记载的程序，通过简单的准备试验，无需过度的试行错误即可适当地决定。如“发明所要解决的课题”一栏中所述的，在利用由化学反应引起的向传感部的沉 淀、析出、或吸附的各种现有技术中，在非流动条件下进行，从促进沉淀等观点出发是本申 请申请时的技术常识。与该技术常识相反，在本发明中通过在流动性条件下实施，与非流动 性条件下相比较，能够显著提高检测灵敏度或精度的理由，现今尚未判明，但本发明人推测 为以下的机理。需要说明的是，本发明不受以下推测限定。例如，如图1所示的反应，作为水溶性物质而使用银离子的情况下，酶底物及银离 子在氧化还原反应时被消耗。与非流动性条件下相比，在流动性条件下，由于供给新的酶底 物及银离子，推测其灵敏度增加。另外，析出的银在再氧化为银离子时，通过在流动性条件 下将传感部附近所发生的银离子从传感部附近去除，使银的再氧化反应速度上升，因而推 测其灵敏度上升。更进一步，通过同时引起上述2个反应，推测灵敏度将协同上升。实施例以下通过实施例对本发明进行详细说明，但本发明的范围并不限于此。《实施例1使用金电极的B型肝炎表面抗原(HBs抗原)的测定》1-1.电极部及传感部的制作利用图3所示掩模图案，通过溅射法与提离法制作包含图2所示图案的电极部。首 先，在包含聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)的绝缘性基板11上形成金薄膜(膜厚50nm)后， 通过在一部分上涂布银·氯化银油墨(BAS社制)来制作参考电极16。接着，为了将电极 部12与引线部13之间分开，通过用绝缘膜17被覆引线部的一部分，由此制作具备作用电 极14、对电极15、参考电极16的电极部。作用电极、对电极、参考电极的相反侧的端部作为 连接用连接器18而发挥功能。电极部中的前述作用电极作为传感部发挥功能。1-2.相互作用反应部及不溶性反应部的制作接下来，在前述电极部的作用电极上，滴加2 μ L水溶液，所述水溶液含有相对于 B型肝炎表面抗原(HBs抗原)的抗体即抗HBs单克隆抗体(IgG:自社制备)的水溶液， 在37°C、饱和水蒸气压力下进行30分钟的固定。需要说明的是，上述抗体水溶液配制为在 含有0. 15mol/LNaCl的0. lmol/L磷酸缓冲液(pH7. 4)(以下称作缓冲液Α)中抗体浓度为 lmg/mL。此后，在25°C、湿度40%的条件下干燥1小时，在真空干燥器室内在室温下干燥2 小时后，在Tris缓冲液(pH8.0)中振荡条件下浸渍30分钟，以封闭未反应部，继而用去离 子水洗净基板，进行干燥，上述0. Imo 1/L Tris缓冲液含有含酪蛋白(和光纯药制)的 0. 15mol/L NaCl。这样，通过将抗HBs单克隆抗体作为特定物质而固定于作用电极(传感 部)上，而在作用电极上制作出相互作用反应部与不溶性反应部。1-3.碱性磷酸酶(ALP)标记兔抗HBs多克隆抗体(Fab，)溶液的制作使用兔抗HBs多克隆抗体(自社制)、ALP( 口〉Λ社制)、交联剂(4_[Ν_马来酰亚 胺基甲基]环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯=PIERCE社制)，基于“高感度酶免疫测定法(石 川荣治学会出版中心、1993)”中记载的马来酰亚胺·铰链法(t > 7法)而制作ALP标 记兔抗HBs多克隆抗体(Fab，)溶液。将所得到的酶标记抗体[ALP标记兔抗HBs多克隆抗 体(Fab’ )]通过缓冲液A调整为预定的浓度，而作为ALP标记抗HBs抗体溶液。1-4.含有银离子的底物溶液的制作制作含有2mmol/L 对氨基苯基磷酸酯(pAPP =LKT Laboratories社制)、 0. 125mmol/L AgNO3>0. 5mmol/L MgS04、0. 25mmol/L MgCl2、0. 075mol/L NaCl 的 0. 05mol/L 二乙醇胺溶液(pH9. 4)，以作为含有银离子的底物溶液。1-5.不含银离子的底物溶液(pAPP底物溶液)的制作(对照试验用)制作含有2mmol/L ρΑΡΡ、0· 5mmol/L MgS04、0. 25mmol/L MgCl2、0. 075mol/L NaCl 的0. 05mol/L 二乙醇胺溶液(pH9. 4)，以作为pAPP底物溶液。1-6.流路的制作以及流动条件控制装置的构建制作图4 图7中所示的生物传感器单元。如图4 图7所示，通过使用基板26， 对通过将双面胶带(厚度0. 64mm, 3M社制)剪切为纵长的流路形状而制作的垫层24，从上 下进行夹持以进行中空状态的流路25的制作，并使电极部保持于流路内，而制成生物传感 器单元31，其中，所述基板26具备在玻璃板的两处开孔(开口部)作为反应溶液的进液口22、出液口 23而得的窗(window) 21、以及固定有之前制作的抗HBs单克隆抗体28的电极部 27。接着，在生物传感器单元31的流路入口，如图8所示，通过导管连接溶液(试剂) 储器(server) 34 38、切换阀门(EV100-105 :GL 寸 ^ 工 > 义社制)32、泵(PERISTALTIC PUMP P-I 旧7 7 > * 7社制)33，将废液储器39连接于流路出口。由此，可以在流路内 使源自试剂储器的各溶液(检测体、试剂、缓冲液)以预定的流速从入口向出口方向流动。1-7.基于电化学分析仪的HBs抗原的测定使用所构建的生物传感器单元以及流动条件控制装置，进行HBs抗原的测定。首 先，向流路中供液缓冲液A(试剂储器1)2分钟后，通过切换阀门向流路中供液HBs抗原溶 液[将HBs抗原(重组品，adw亚型自社制造)以缓冲液A配制为预定浓度的溶液](试 剂储器2)30分钟。接着，通过切换阀门，向流路中供液ALP标记抗HBs抗体溶液(2 μ g/mL) (试剂储器3)30分钟后，进一步通过切换阀门向流路中供液含有银离子的底物溶液(试剂 储器4)或pAPP底物溶液(试剂储器5)，4分钟后在保持供液状态下进行电化学测定。电化学测定如图8所示，将作用电极、参考电极、对电极的各连接用连接器40分别 连接于电化学分析仪(型号832A，ALS社制造)41，通过循环伏安测量(CV)，在供液含有银 离子的底物溶液或PAPP底物溶液的状态下，相对于参考电极使电势在-0. 15V与0. 6V之间 变化，由此测定电化学响应。1-8.测定结果(1)基于HBs抗原(测定对象化合物)的存在的氧化电流的检测分别将HBs抗原浓度为OU/mL情况下的CV测定结果示于图9，HBs抗原浓度为48U/ mL的情况下的CV测定结果示于图10。需要说明的是，对流路的供液(即，流动条件)，在 整个操作步骤(从2分钟的缓冲液A的供液直至电化学测定)中，在流速360yL/min下进 行。在HBs抗原浓度为48U/mL的情况下(图10)，以相对于参考电极为+0. 138V的电 势(氧化电势)，作为伴随着析出的银的氧化反应的氧化电流，检测出5. 44μΑ的氧化电流， 而相对于此，在HBs抗原浓度为OU/mL的情况下(图9)没能检测出相同的氧化电流。(2)银离子的有无与氧化电流的检测的关系接着，根据有无银离子研究银的析出效果。图11中给出了在除了代替含有银离子 的底物溶液而使用PAPP底物溶液(即不含银离子)之外以与图10相同的条件(HBs抗原 浓度48U/mL、流速360 μ L/min)下实施得到的CV测定结果。比较图10及图11的结果，使用含有银离子的底物溶液的情况下(图10)，以相对 于参考电极为+0. 138V的电势(氧化电势)，作为伴随析出的银的氧化反应的氧化电流，检 测出5. 44 μ A的氧化电流，而相对于此，在使用pAPP底物溶液的情况下(图11)，没有明显 检测出来自生成物即对氨基苯酚(PAP)的氧化电流。由此可知，在流动性条件下，通过进行 作为生成物的银等的析出，可以显著提高HBs抗原检测灵敏度。(3)流速对氧化电流的影响接着，为了研究流动条件(流速)的影响效果，将流速变为0、200、360、1260yL/ min时，研究在各流速条件下相对于参考电极在+0. 138V电势下的氧化电流。除了流速之 外，以与图8相同的条件(HBs抗原浓度48U/mL)实施测定。
结果示于表1。如表1所明确显示，可知与流速0μ L/min(非流动性条件)相比， 流动性条件下的反应性显著提高。表权利要求
分析方法，其特征在于，包括(a)至少使分析对象物质以及与前述分析对象物质显示选择性相互作用的特异性伴侣发生反应以相关于被检测样品中的分析对象物质的存在量、并通过实施不溶化反应，使可溶性物质变换为不溶性物质以沉淀于传感部的步骤；(b)对沉淀于前述传感部的不溶性物质进行电分析的步骤，且前述步骤(a)或步骤(b)中的至少一个步骤在流动性条件下实施。
2.根据权利要求1所述的分析方法，其中，前述特异性伴侣为酶。
3.根据权利要求1所述的分析方法，其中，前述步骤(a)包括(1)形成复合体的步骤，该复合体与被检测样品中的分析对象物质的存在量相关，且含 有分析对象物质、与前述分析对象物质显示选择性相互作用的特异性伴侣、以及标记物质； 和(2)通过由所形成的前述复合体中含有的标记物质直接或间接地引起的不溶化反应， 使可溶性物质变换为不溶性物质以沉淀于传感部的步骤，且前述步骤(2)或步骤(b)中的至少一个步骤在流动性条件下实施。
4.根据权利要求3所述的分析方法，其中，前述标记物质为水解酶。
5.根据权利要求4所述的分析方法，其中，前述水解酶为碱性磷酸酶。
6.根据权利要求1 5任一项所述的分析方法，其中，前述不溶化反应为氧化还原反应。
7.根据权利要求1 6任一项所述的分析方法，其中，前述可溶性物质选自无机离子、 有机离子、酶底物或其反应生成物、色素。
8.根据权利要求7所述的分析方法，其中，前述可溶性物质为金属离子。
9.根据权利要求8所述的分析方法，其中，前述金属离子为银离子。
10.根据权利要求1 9任一项所述的分析方法，其中，前述传感部由金属、高分子、碳、 纳米管状结构体、石墨、无机物质单独或组合构成。
11.根据权利要求1 10任一项所述的分析方法，其中，前述传感部具有至少一个以上 的锐角状的立体结构。
12.根据权利要求1 11任一项所述的分析方法，其中，前述特异性伴侣被固定于前述 传感部。
13.根据权利要求1 12任一项所述的分析方法，其中，前述流动条件为强制性流动或 自发性流动。
14.根据权利要求1 13任一项所述的分析方法，其中，含有前述电分析步骤的分析方 法为安培型分析法。
15.传感部，其是用于权利要求1 14任一项所述的分析方法的传感部，前述传感部具 有至少一个以上的锐角状的立体结构。
16.试剂以及试剂盒，其是以用于前述分析方法为特征的、用于测定分析对象物的试剂 以及试剂盒，所述试剂以及试剂盒含有与前述分析对象物显示选择性相互作用的特异性伴 侶、由不溶化反应变换为不溶性物质的可溶性物质以及至少一个前述传感部。
17.根据权利要求16所述的试剂以及试剂盒，其中，作为具有传感部的分析用筒体而 含有前述传感部。
全文摘要
本发明公开了一种分析方法，该方法包括(a)至少使分析对象物质以及与前述分析对象物质显示选择性相互作用的特异性伴侣发生反应以相关于被检测样品中的分析对象物质的存在量、并通过实施不溶化反应，使可溶性物质变换为不溶性物质以沉淀于传感部的步骤；(b)对沉淀于前述传感部的不溶性物质进行电分析的步骤，且前述步骤(a)或步骤(b)中的至少一个步骤在流动性条件下实施。
文档编号G01N27/327GK101978260SQ20098010945
公开日2011年2月16日 申请日期2009年3月17日 优先权日2008年3月17日
发明者井福康夫, 村井长元 申请人:三菱化学美迪恩斯株式会社