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专利名称：使用二次离子质谱(sims)和相关技术高灵敏地检测和定量生物分子的方法
技术领域：
本发明涉及使用同位素标记和二次离子质谱检测和定量生物分子例如DNA、RNA 或蛋白质的方法，还涉及设计用于实施所述方法的阵列。
背景技术：
在六十年代早期，Castaing和Slodzian开发了使用二次离子的滤质发射离子显 微技术(mass-filtered emission ion microscopy),该技术成为后来称作二次离子质谱 (SIMS)的技术的一部分。使用该技术，离子束(一次离子束)用作探针以将样品的表面原 子层溅射成原子或原子簇，其小部分离子化。在SIMS仪器中，这些二次离子根据质量分离， 然后用于测量二次离子流，从而产生例如所分析表面的定量原子质量图像。SIMS已经成为半导体和表面科学研究、地球化学、有机材料的鉴定以及宇宙化学 的主要研究工具。但是，离子显微术主要由于其横向分辨率差(1-0.5μπι)和质量分离能力 不足，长期以来被认为只是用于解决生命科学问题的边缘方法。技术和概念的进步，特别是精细聚焦的一次离子束的使用，使得横向分辨能力和 质量分辨率均有显著的提高。因此SIMS显微术已经成为了非常有用的成像工具。例如， Lechene等人能够使用SIMS技术对单个静纤毛(耳蜗的内细胞的机械感应细胞器)进行成 像(Lechene等，Journal of Biology，2006，5 :20)。在另一实验中，他们能够研究在1N气 氛中培养的细菌的固氮作用。使用SIMS技术还使得Lechene等人能够定位、定量和比较单 个细胞中和亚细胞结构中的固氮作用(Lechene等，Science，2007，317 :1563)。因此，SIMS 技术目前广泛地应用于细胞或组织的成像，并且其也是一种有力的诊断工具。SIMS技术也用于检测未标记的DNA对肽核酸(PNA)微阵列的杂交(Brandt等， 2003, Nucleic Acids Research, 31 19)。在这些实验中，通过SIMS检测作为核酸的组成部 分但在PNA中却完全不存在的磷酸酯而实现PNA/DNA或PNA/RNA双联体(duplex)的可视 化。本发明目的在于提供一种使用SIMS技术检测和定量样品中的多种生物分子的存 在或不存在的方法。Brandt等人所描述的方法具有以下缺点(i)其只能与PNA探针或不 含有磷酸酯的探针一起使用，以及(ii)其不能定量探针/靶之间的相互作用。因此，申请 人目的在于提供一种可应用于大量样品以使用SIMS技术检测和定量各样品中探针/靶的 大量相互作用的通用方法，所述相互作用的检测和定量通过计算探针/靶的同位素比确定 (见图1)。发明概述本发明涉及包括具有导电表面的基本为平面的基底和含有探针的多个离散区域 的阵列，所述探针以至少一种稀有的、稳定或不稳定的同位素或外源同位素标记。根据一种实施方案，所述具有导电表面的基本为平面的基底为硅片。根据一种实施方案，所述探针以至少一种选自2Hj3C^l17CK wo、33s、34s和％的稳定的重同位素标记，或者以至少一种选自3H和mC的不稳定的同位素标记，或者以至少一种 选自和81Br的外源同位素标记。根据一种实施方案，所述阵列是微阵列，其中各离散区域的长度、宽度或直径尺寸 之一为 Ιμ 至 1000 μ m。根据一种实施方案，各离散区域是包含探针的微米孔，所述探针以至少一种稀有 的、稳定或不稳定的同位素或外源同位素标记。根据一种实施方案，所述阵列是纳米阵列，其中各离散区域的长度、宽度或直径尺 寸之一为Inm至lOOOnm。根据一种实施方案，各离散区域是包含探针的纳米孔，探针以至少一种稀有的、稳 定或不稳定的同位素或外源同位素标记。根据一种实施方案，各微米孔包含多个纳米孔，并且所述纳米孔包含以至少一种 稀有的、稳定或不稳定的同位素或外源同位素标记的探针。本发明涉及用于检测和定量至少一种样品中的至少一种生物分子的存在或不存 在的方法，包括(a)使所述至少一种样品与上述阵列接触，(b)洗涤并干燥阵列，(c)通过SIMS检测并计数常见二次离子(common secondary ion)与相应的稀有 二次离子(rare secondary ion)。根据一种实施方案，将各待测样品与阵列的一个或多个离散区域接触。根据一种实施方案，所述待测样品是单个细胞。根据一种实施方案，所述方法用于测定测试样品的分子图谱(molecularatlas)， 其中所述分子图谱确定所述样品的转录组(transcriptome)、蛋白质组、脂质组 (Iipidome)、代谢组(metabolome)、糖组(glycome)和 / 或相互作用组(interactome)。根据一种实施方案，所述方法用于在需要的受试者中预测患疾病的倾向，或用于 诊断疾病。根据一种实施方案，所述方法用于监测施用于患者以治疗疾病的治疗剂的疗效。根据一种实施方案，所述方法用于筛选治疗剂。


图1 探针与其靶蛋白结合的SIMS检测原理示意图。生物分子(探针和靶)被碎 裂成原子水平的碎片(动态SIMS条件)。因此，各个单个探针/靶的偶联物产生数百个1N 和14N原子(在实际的试验中为CN-分子二次离子的形式)，这些原子易于在SIMS分析器中 计数(扩增)。测得wNz^N同位素比例的增大可定量与抗体结合的那些靶蛋白。图2 =DIR的增大或减�。�取决于探针或靶是否标记。图3 :1 同位素分数。图4 =13C同位素分数。发明详细说明定义本文所用的术语“核酸”表示由核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)组成的聚合物，或可以以类似于两个天然存在的核酸的序列特异性的方式与天然存在的核酸 杂交(例如可参与Watson-Crick碱基对相互作用)的合成产生的化合物，例如PNA。本文所用的术语“核糖核酸”和“RNA”表示由核糖核苷酸组成的聚合物。本文所用的术语“脱氧核糖核酸”和“DNA”表示由脱氧核糖核苷酸组成的聚合物。本文所用的术语“寡核苷酸”表示约10至100个核苷酸，最高200个核苷酸长度 的单链核苷酸多聚体。本文所用的术语“样品”是指物质或物质的混合物，通常(但不是必须)为流体形 式，含有一种或多种感兴趣的组分。术语“核苷”和“核苷酸”意图包括不仅含有已知的嘌呤和嘧啶碱基，还含有其他 经修饰的杂环碱基的那些部分。所述修饰包括甲基化嘌呤或嘧啶、酰基化嘌呤或嘧啶、烷基 化核糖或其它杂环。另外，术语“核苷”和“核苷酸”包括不仅含有常规的核糖和脱氧核糖， 也含有其它糖的那些部分。修饰的核苷或核苷酸也包括在糖部分上的修饰，例如其中一个 或多个羟基被卤原子或脂肪族基团代替，或官能化为醚、胺等。本文所用的术语“蛋白质”是指通过肽键连接在一起的氨基酸残基的聚合物。本 文所用的术语涉及任何大小、结构或功能的蛋白质、多肽和肽。但是，蛋白质通常至少为六 个氨基酸的长度。优选地，如果蛋白质是短肽，则其至少为约10个氨基酸残基的长度。蛋 白质可以是天然存在的、重组的或合成的或它们的任何组合。蛋白质也可以仅是天然存在 的蛋白质或肽的片段。蛋白质可以是单个分子或是多分子的复合物。术语蛋白质也可应用 于其中一个或多个氨基酸残基是天然存在的氨基酸的相应的人造化学类似物的氨基酸聚 合物。其中一个或多个氨基酸残基是“非天然”的氨基酸(不对应于任何天然存在的氨基 酸)的氨基酸聚合物也包含在本文的术语“蛋白质”的使用之内。术语“与固体载体的表面结合的寡核苷酸”是指固定在固体基底表面的某个点上 的寡核苷酸或其模拟物，例如PNA，其中所述基底可以具有多种构造，例如片、小珠或其他结 构。在某些实施方案中，本文所用的寡核苷酸要素的集合列于相同平面载体的表面上，例如 以阵列形式。术语“阵列”包括术语“微阵列”和“纳米阵列”。如在下文中更详细地描述的，阵列 通常由多个与固体基底表面结合的独特的或不同的探针组成，也被称为基底固定化探针。 在一种实施方案中，本发明的阵列为同型阵列(homoarray)，其中本发明的阵列仅包括一种 化学类型的探针，即仅包括核酸探针或仅包括肽或蛋白质探针等。在另一种实施方案中，本 发明的阵列是异型阵列(heteroarray)，其中本发明的阵列包括多种类型的探针的混合，例 如核酸探针和蛋白质探针的混合。术语“纳米孔”适用于其中结合有探针的纳米大小的区域。术语“微米孔”适用于 其中结合有探针的微米大小的区域。术语“纳米阵列装置”或NAD适用于微米大小的特征(其可以在单片上以多个相 同副本或不同形式存在)。NAD可包含一组纳米孔或仅包含一组离散区域(没有孔但包含 探针)，它们自身可以在微米孔内或者不在微米孔内。术语“常见二次离子”是指在SIMS中产生并分析的那些离子，并且不包含其组成 元素的稀有的、稳定(或不稳定)的同位素。常见二次离子的实例包括12c14N_、12c_等。术语“稀有二次离子”是指在SIMS中产生并分析的那些离子，并且包含按照探针和/或靶分子的标记中所用的比例的其组成元素的至少一种稀有的、稳定(或不稳定)的
同位素。稀有二次离子的实例包括13CV3C14NV2C15N-和13C15N_。术语“背景常见二次离子”是指在SIMS中产生和分析，并且以天然存在的比例(与 探针和/或靶分子的标记中所用的比例不同)包含其组成元素的稀有的、稳定(或不稳定) 的同位素的那些离子。天然比例的天然二次离子的实例包括12C14NV3C14NV2C15Nm 13C15N_， 比例为 0. 98538 0. 01096 0. 00362 0. 00004。如用于离散区域或微米孔或纳米孔的术语“检测同位素比”或DIR是指通过 SIMS或相关技术获得的常见二次离子的数目与常见二次离子加上至少一种稀有二次
离子数目之和的比值，例如 12C14N-/(12C14NV2C15N-)或 12C14N-/(12C14NV3C14N-)或 12C14N./
(12(14^+12(15^+13(14^)或或fCW)等。图 2 显
示了 WR的增大或减�。�其取决于探针或靶是否标记。(如果探针和靶都以例如不同的同位 素标记，则必须针对各个具体的情况来确定DIR变化的方向。)术语“外源同位素”是指不是天然包含于生物分子(探针和靶)中，而是通过使用 者加入到这些分子中的那些同位素。外源同位素可以通过标准化学方法或生物化学方法与 生物分子共价连接。或者，外源同位素可共价连接至一分子，该分子本身与探针或靶强烈相 互作用且不会显著降低探针对靶的识别。外源同位素的实例包括79Br和inBh术语“对照离散区域”是指其中探针(标记的或未标记的)未与待测样品接触的 离散区域、微米孔或纳米孔，或者其中没有探针和靶之间特异性相互作用(即待分析的样 品中不存在靶)的离散区域、微米孔或纳米孔。本发明载体材料和表面的性质本发明目的之一是包括具有导电表面的基本为平面的基底和多个离散区域的阵 列，所述多个离散区域(可以是孔的形式或者不是孔的形式)含有以至少一种稀有同位素 (例如稳定的重或轻同位素或不稳定的同位素)或至少一种外源同位素(例如79Br、81Br)标 记的探针。根据本发明，具有导电表面的基本为平面的基底是硅片，或任何其他的由金、银、 铝、铜、钼、钯或其他金属或者半导体(例如GaAs、InP)或者经处理以使得表面导电的其他 材料(例如聚合物材料、聚合物涂覆材料、超导材料、陶瓷、金属氧化物、氧化硅等)制成的 固体或半固体表面。在本发明一种实施方案中，所述具有导电表面的基本为平面的基底与SIMS相容。在本发明优选的实施方案中，所述SIMS相容的具有导电表面的基本为平面的基 底为硅片。微米孔形式的离散区域本发明另一目的是作为上述的微阵列的微米孔阵列，其中离散区域是含有以至少 一种稀有的、稳定或不稳定同位素标记的探针的微米孔。该微米孔可以是任何形状，例如 点、线、圆形、方形或三角形，并且可以以任何较大的式样(pattern)排列，例如行和列、点 阵、栅格等。这些微米孔含有以至少一种稀有的、稳定或不稳定的同位素标记的探针。在本发明一种实施方案中，本发明的微米孔阵列包含10-100000个微米孔，在另 一种实施方案中包含10-25000个微米孔，在又一种实施方案中含有100-10000个微米孔，在再一种实施方案中含有1000-5000个微米孔。在本发明的一种实施方案中，适当地确定微米孔的形状和大小以在各个微米孔中 贮存单个细胞。在一种实施方案中，各个微米孔的长、宽或直径尺寸之一在Iym-IOOOym范围 内，在另一种实施方案中在1 μ m-500 μ m的范围内，在又一种实施方案中在1 μ m-200 μ m的 范围内，在再一种实施方案中在1 μ m-100 μ m的范围内。在一种实施方案中，各微米孔的深度为1 μ m-100 μ m，在另一种实施方案中为 1μ -50μπ ，在又一种实施方案中为5μ -20μπ 。各微米孔之间的距离可以是25-5000μπι，在另一种实施方案中为100-1000 μ m， 在又一种实施方案中为50 μ m-150 μ m。微米孔可以是任何形状例如其可以是圆柱形、非圆柱形(例如具有多个面的多 面体(平行六面体、六角柱体、八角柱体))、倒锥形、倒金字塔形，或者其是两种或更多种这 些形状的组合。对于圆锥形和平行六面体形状，微米孔的底部通常为平的，但是曲面(凸形 或凹形)也是可能的。在本发明一种实施方案中，带有该系列微米孔的基本为平面的导电表面可以被成 型为长方型固体或盘片(尽管也可成型为其他形状)，其长度为1cm、宽度为Icm和厚度为 约邪0 μ m。纳米孔形式的离散区域本发明另一目的是作为上述的纳米阵列的纳米孔阵列，其中离散区域是含有以至 少一种稀有的、稳定或不稳定同位素标记的探针的纳米孔。该纳米孔可以是任何形状，例如 点、线、圆形、方形或三角形，并且可以以任何较大的式样排列，例如行和列、点阵、栅格等。 这些纳米孔含有以至少一种稀有的、稳定或不稳定的同位素标记的探针。在本发明的一种实施方案中，本发明的纳米孔阵列包含10-100000个纳米孔，在 另一种实施方案中包含10-25000个纳米孔，在又一种实施方案中含有100-10000个纳米 孔，在再一种实施方案中含有1000-5000个纳米孔。在一种实施方案中，各个纳米孔的长、宽或直径尺寸之一为Inm-lOOOnm，在另一 种实施方案中为5nm-500nm，在又一种实施方案中为10nm_200nm，在再一种实施方案中为 50nm-100nmo在一种实施方案中，各纳米孔的深度为Inm-lOOnm，在另一种实施方案中为 lnm-50nm，在又一种实施方案中为5nm_20nm。各纳米孔之间的距离可以是lO-lOOOnm，在另一种实施方案中为50-500nm，在又 一种实施方案中为100nm-200nm。纳米孔可以是任何形状，例如其可以是圆柱形、非圆柱形(例如具有多个面的多 面体(平行六面体、六角柱体、八角柱体))、倒锥形、倒金字塔形，或者其可以是两种或更多 种这些形状组合的形状。对于圆锥形和平行六面体形状，纳米孔的底部通常为平的，但是曲 面(凸形或凹形)也是可能的。在本发明的一种实施方案中，带有该系列纳米孔的基本为平面的导电表面可以被 成型为长方形固体或盘片(尽管也可成型为其他形状)，其长度为1cm、宽度为Icm和厚度 为约250 μ m。
非孔形式的离散区域本发明另一目的是作为在基底上形成较大式样的一系列离散区域或式样单元的 排列的阵列。所述离散区域或式样单元可以是任何形状，例如点、线、圆形、方形或三角形， 并且可以以任何较大的式样排列，例如行和列、点阵、栅格等。这些离散区域含有以至少一 种稀有的、稳定(或不稳定)的同位素标记的探针。在本发明的一种实施方案中，本发明的阵列包含10-100000个离散区域，在另一 种实施方案中包含10-25000个离散区域，在又一种实施方案中含有100-10000个离散区 域，在再一种实施方案中含有1000-5000个离散区域。在本发明的一种实施方案中，本发明的阵列是微阵列。在该实施方案中，各个离散 区域的长、宽或直径尺寸之一为ι μ m-1000 μ m,在另一种实施方案中为5 μ m-500 μ m,在又 一种实施方案中为10μπι-200μπι，在再一种实施方案中为50μπι-100μπι。各离散区域之 间的距离可以是10-1000 μ m,在另一种实施方案中为50-500 μ m,在又一种实施方案中为 100 μ m-200 μ m0在本发明的一种实施方案中，本发明的阵列是纳米阵列。在该实施方案中，各个 离散区域的长、宽或直径尺寸之一为Inm-lOOOnm，在另一种实施方案中为在5nm-500nm， 在又一种实施方案中为10nm-200nm，在再一种实施方案中为50nm_100nm。各离散区域之 间的距离可以是lO-lOOOnm，在另一种实施方案中为50nm-500nm，在又一种实施方案中为 100nm-200nm。在本发明的一种实施方案中，带有该一或多个系列离散区域的膜或硅片可以被成 型为长方形固体或盘片(尽管也可成型为其他形状)，例如其长度为1cm、宽度为Icm和厚 度为约250 μ m。探针探针的化学性质和同位素组成在此实施方案中，与靶(通常是构成细胞的生物分子，但甚至是病毒、细胞器或细 胞本身)结合的探针可由任何分子(生物的或非生物的)制成，例如核酸(寡核苷酸、DNA、 RNA、PNA)、肽或蛋白质(抗体、酶)、配体(抗原、酶底物、受体或受体的配体)、葡聚糖、脂 质、多胺、噬菌体、病毒或这些分子的组合。根据本发明，探针含有至少一种稀有的、稳定或不稳定的同位素在一种实施方案 中，探针含有至少一种稳定的重同位素，例如M、13c、15N、17o、18o、33s 4s和^5Stj在另一种实施 方案中，探针含有至少一种不稳定的同位素，例如M和WC，在又一种实施方案中，探针含有 至少一种外源同位素，例如79Br和81Br。探针的结合或接枝将探针结合或接枝到阵列上是通过本领域熟知的技术实现的。探针可吸附、物理 吸附、化学吸附或共价结合到阵列上。平版印刷(Lithography printing)也可用于使探针 以形成图案的形式(patterned fashion)转印和直接或间接吸附到表面上。例如，可通过在表面上引入官能团以在表面和待接枝的探针之间发生化学反应， 从而实现探针的结合。羧基(C00H)是人所共知的一种接枝官能团。蛋白质的氨基与羧基官能团之间形 成了化学键。丙烯酸或共聚的乙烯基硅烷与马来酸酐酸(maleicanhydride acid)也可用于生成硅-COOH底物，该底物可用作间隔物以使用例如1-乙基-3-(3- 二甲基氨基丙基) 碳二亚胺盐酸盐将蛋白质接枝到表面上。探针的识别在其中将多种不同的探针结合到阵列上的一种实施方案中，通过含有探针的离散 区域的位置或坐标来识别探针。样品的性质和来源根据本发明的方法，待测样品可从细胞、组织、器官、体液(如，例如血清、血浆、精 液、滑膜液、脑脊液、血液或尿液)、细胞培养物、水(例如污水、淡水、海岸水、地下水)等中 分离。根据本发明的方法，待测样品可以包含核酸(寡核苷酸、DNA、RNA、PNA)、肽或蛋白 质(抗体、酶)、配体(抗原、酶底物、受体或受体的配体)、葡聚糖、脂质、多胺、噬菌体、病毒 或其组合。因此待检测的生物分子可以是核酸(寡核苷酸、0嫩丄織1嫩)、肽或蛋白质(抗 体、酶、朊蛋白)、配体(抗原、酶底物、受体或受体的配体)、葡聚糖、脂质、多胺、噬菌体、病 毒或其组合。探针的标记根据本发明的方法，探针或靶(即待测样品中的生物分子)以稀有的、稳定或不稳 定同位素或外源同位素标记。在一种实施方案中，探针或靶可以以至少一种稀有稳定的同位素标记，例如2H、 13C、15N、17O、18O、33S、34S 和 36S0在另一种实施方案中，探针或靶可以以至少一种不稳定的同位素标记，例如3H和吨。在另一种实施方案中，探针或靶可以以至少一种外源同位素标记，例如79Br和 81Br0标记的探针可通过体内和体外的两种技术获得在体外标记的情况下，1)聚合酶链反应用于产生标记的寡核苷酸，幻肽合成用于 产生标记的肽，幻体外转录/翻译用于产生标记的RNA和标记的蛋白质，4)逆转录用于产 生标记的cDNA，5)化学合成用于产生标记的PNA。在体内标记的情况下，将原核细胞或真核细胞在含有以咕、13(、151170、180、335、％ 和siS的组合或咕、wC的组合或半衰期较长的其他不稳定同位素标记的营养素(例如NH4Cl、 葡萄糖和氨基酸)的培养基上生长。因此这些细胞产生了标记的探针(例如抗体、噬菌体、 核酸、蛋白质、糖或其他细胞成分)。当要对靶(即待测样品中的生物分子)进行标记时，通常将细胞在含有以2H、13C、 15N、17O、18O、33S、34S和 的组合或3H、14C的组合标记的营养素(例如NH4C1、葡萄糖和氨基 酸)的培养基上生长。从而这些细胞产生了标记的生物分子。样品和阵列的接触在本发明方法的一种实施方案中，将待测样品与含有多个不同探针的阵列(微阵 列或纳米阵列)接触。在其中对多个样品进行测试的另一种实施方案中，各个样品与微米孔阵列的一个 或多个微米孔接触。
在其中待测样品的数目和多样性与单个细胞的数目和多样性一致的另一种实施 方案中，将经合适方法获得的各单个细胞的内容物与微米孔阵列的一个微米孔接触。探针与靶之间相互作用的条件然后将一个或多个样品与阵列在使得存在于阵列上的探针与靶生物分子相互作 用的条件下接触。然后在通常不含有常见的工化和14N同位素的各种缓冲液(例如磷酸盐缓冲生理盐 水)中使探针与其靶结合。以纯水小心地洗涤(优选在低温下洗涤以限制探针与其靶的解 离)以除去盐(盐在干燥步骤中可形成晶体)、未结合的分子和大的细胞碎片后，将阵列在 无尘气氛中在烘箱中真空干燥或者通过冷冻干燥进行干燥。通过SIMS和其它相关技术检测根据本发明的方法，计数稀有和常见二次离子的数目以获得检测同位素比，从而 能够检测探针/靶双联体。在一个实施方案中，探针/靶双联体通过动态二次离子质谱(D-SIMQ检测。在另 一种实施方案中，探针/靶双联体通过飞行时间二次离子质谱(TOF-SIMQ检测。二次离子质谱(SIMQ使得能够基于二次离子质谱分析对无机和有机物质的表 面组成进行分析，这些二次离子在一次离子能量束的撞击下从固体样品的表面(深度 Inm-I μ m)弓丨出。分子在D-SIMS中被一次离子束打成碎片，或通过动态的D-SIMS完全破碎 成其组成原子，或通过ToF-SIMS部分破碎成分子碎片例如氨基酸。SIMS相关的技术，例如 LaserS匪S，也可用于检测探针/靶的相互作用。在本发明方法的一种实施方案中，连接在阵列上的探针以稀有的、稳定或不稳定 的同位素或外源同位素标记。在该实施方案中，待检测样品具有仅以其天然比例(或甚至 低于这些比例)包含这些稀有同位素的生物分子(靶)。探针/靶之间相互作用的存在通过比较从各离散区域、微米孔或纳米孔获得的检 测同位素比和从对照离散区域、微米孔或纳米孔或者与从其中没有标记的探针和靶之间的 特异性相互作用(即待分析样品中不含有靶)或其中具有未标记的探针和未标记的靶之间 的特异性相互作用的离散区域获得的背景检测同位素比而测定。因此，在探针标记而靶未标记的情况下，如果从一个离散区域、微米孔或纳米孔 获得的检测同位素比明显高于从对照离散区域、微米孔或纳米孔获得的检测同位素比，则 表明存在探针/靶相互作用。例如，在探针以1V标记的情况下，如果在相同仪器设置下 从一个离散区域、微米孔或纳米孔获得的检测同位素比12C/(12C+13C)(或可选择地12C14N/ (12C14N+12C15N))高于从对照离散区域、微米孔或纳米孔获得的检测同位素比，则表明存在探 针/靶相互作用。因此，在探针未标记而靶标记的情况下，如果从一个离散区域、微米孔或纳米孔获 得的检测同位素比明显低于从对照离散区域、微米孔或纳米孔获得的检测同位素比，则表 明存在探针/靶相互作用。例如，在探针以1V标记的情况下，如果在相同仪器设置下从一离 散区域、微米孔或纳米孔获得的12C/(12C+13C) 二次离子(或可选择地12C14N/(12C14N+12C15N)) 的比低于从对照离散区域、微米孔或纳米孔获得的这种二次离子的比，则表明存在探针/ 靶相互作用。因此，在探针和靶都以相同的一种或多种同位素标记的情况下，如果从一个离散区域、微米孔或纳米孔获得的检测同位素比明显不同于从对照离散区域、微米孔或纳米孔 获得的检测同位素比，则表明存在探针/靶相互作用。根据本发明，探针或靶也可以以多于一种其组成元素的稀有的、稳定或不稳定的 同位素或外源同位素标记。例如，探针或靶可以以1义和1N标记。探针的多重标记(例如 13C15N)特别适用于使背景最小化。根据本发明，当靶以稀有的、稳定(或不稳定的)同位素标记时，可根据各种条件 的差别标记来区分各种实验条件(例如，以药物处理或未以药物处理)。检测和定量的方法本发明一个目的是用于检测和定量至少一种样品中的至少一种生物分子的存在 或不存在的方法，包括(a)使至少一种所述样品与阵列在使得阵列上存在的探针能够与靶生物分子相互 作用的条件下接触，其中阵列上存在的探针或样品中存在的生物分子以至少一种稀有的、 稳定(或不稳定)的同位素标记，(b)洗涤并干燥阵列，(c)通过SIMS检测并计数常见二次离子与相应的稀有二次离子。这样可测定DIR。然后比较从各离散区域、微米孔或纳米孔获得的WR和从对照离散区域、微米孔 或纳米孔获得的DIR ；DIR的明显变化(见图2、证明了探针/靶相互作用的存在(检测)。 而且，对DIR的精确测定可定量探针和靶之间的相互作用的数量。WR的精确测定是在溅 射最大量的物质从而获得常见和稀有二次离子的良好的计数统计后获得的。为计算每离散 区域(微米孔或纳米孔或实际上该离散区域中的样品单位面积)的与探针相互作用的靶数 量，需要知道a)探针在离散区域表面上的密度，和b)在单个探针和单个靶中各目标同位 素的原子数目。获知这些信息后可绘制随每离散区域的靶的数量变化的DIR图。本发明的应用根据另一种实施方案，用于检测和定量至少一种样品中至少一种生物分子的存在 或不存在的所述方法可确定所述样品的分子图谱(即确定所述样品的转录组、蛋白质组、 脂质组、代谢组、糖组和/或相互作用组)，或可确定单个细胞中的生物分子及其相互作用。分子图谱应用根据本发明的一种实施方案，用于检测和定量样品中至少一种生物分子的存在或 不存在的方法旨在提供所述样品的分子图谱。在一种实施方案中，待检测和定量的生物分子的多样性是基因组序列，这使得可 确定所述样品中的基因组变异。在另一种实施方案中，待检测和定量的生物分子的多样性是RNA，这使得可确定所 述样品中的转录组。在另一种实施方案中，待检测和定量的生物分子的多样性是蛋白质，这使得可确 定所述样品中的蛋白组。在另一种实施方案中，待检测和定量的生物分子的多样性是脂质，这使得可确定 所述样品中的脂质组。在另一种实施方案中，待检测和定量的生物分子的多样性是代谢物，这使得可确定所述样品中的代谢组。在另一种实施方案中，待检测和定量的生物分子的多样性是糖基化蛋白质，这使 得可确定所述样品中的糖组。在另一种实施方案中，待检测和定量的生物分子的多样性是与至少一种特异性探 针相互作用的蛋白质，这使得可确定所述样品中的相互作用组。单个细胞的应用根据本发明另一种实施方案，在单个细胞水平上检测和定量至少一种生物分子的 存在或不存在的方法旨在用于提供单细胞水平的分子图谱。在一种实施方案中，待检测和定量的生物分子的多样性是基因组序列，这使得可 确定单个细胞水平上的基因组变异。在另一种实施方案中，待检测和定量的生物分子的多样性是RNA，这使得可确定在 单个细胞水平上的转录组。在另一种实施方案中，待检测和定量的生物分子的多样性是蛋白质，这使得可确 定在单个细胞水平上的蛋白质组。在另一种实施方案中，待检测和定量的生物分子的多样性是脂质，这使得可确定 在单个细胞水平上的脂质组。在另一种实施方案中，待检测和定量的生物分子的多样性是代谢物，这使得可确 定在单个细胞水平上的代谢组。在另一种实施方案中，待检测和定量的生物分子的多样性是糖基化蛋白质，这使 得可确定在单个细胞水平上的糖组。在另一种实施方案中，待检测和定量的生物分子的多样性是与至少一种特异性探 针相互作用的蛋白质，这使得可确定在单个细胞水平上的相互作用组。疾病应用本发明另一目的是所述方法用于检测和定量样品中或单个细胞水平上的至少一 种生物分子的用途-预测受试者的患疾病的倾向，或诊断受试者的疾病，-筛选治疗剂，-监测施用于受试者以治疗疾病的治疗剂的疗效。本发明另一目的在于预测受试者患疾病的倾向或诊断疾病的方法。其包括(a)使从所述受试者分离的至少一种样品与阵列在使得阵列上存在的探针与已知 与所述疾病相关或在所述疾病中差异表达的靶生物分子相互作用的条件下接触，阵列上存 在的探针以至少一种稀有的、稳定(或不稳定的)同位素标记，(b)洗涤并干燥阵列，(c)通过SIMS检测并计数常见二次离子以及相应的稀有二次离子，其中探针和靶 之间的相互作用数量通过比较从各离散区域、微米孔或纳米孔获得的WR和从对照离散区 域、微米孔或纳米孔或者从其中没有探针和靶之间的特异性相互作用(即待分析样品中不 含有靶)的离散区域或其中具有未标记的探针和未标记的靶之间的特异性相互作用的离 散区域获得的WR而定量，(d)比较所述表达谱与标准谱，其中已知与所述疾病相关或在所述疾病中差异表达的所述至少一种生物分子的存在/不存在或增多/减少是患上疾病的可能性或疾病存在 的指标。在一种实施方案中，受试者是哺乳动物。在优选的实施方案中，受试者是人。根据本发明的方法，待测样品可分离自受试者的细胞、组织、器官或体液(如，例 如血清、血浆、精液、滑膜液、脑脊液、血液或尿液)。样品可得自病变细胞或组织。例如，该细胞或组织可以被病原体(例如HIV、流感、 疟疾、肝炎、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒)感染。在一种实施方案中，细胞或组织被病毒性或 细菌性病原体感染。在另一种实施方案中，所述疾病是癌症。在另一种实施方案中，所述疾 病是神经变性疾�。�例如帕金森症、阿尔兹海默症或多发性硬化症。在本发明的一种实施方案中，所述方法用于预测受试者患癌症的倾向或诊断受试 者的癌症。在本发明的另一种实施方案中，所述方法用于预测患细菌性疾病的倾向或诊断细 菌性疾病。在本发明的另一种实施方案中，所述方法用于预测患病毒性疾病的倾向或诊断病 毒性疾病。本发明另一目的是用于筛选治疗剂的方法，包括(a)与至少一种感兴趣的治疗剂一起培养细胞，(b)使从所述培养物中分离的至少一种样品与阵列在一定条件下接触，所述条件 使得在阵列上存在的探针与靶生物分子相互作用，在阵列上存在的探针以至少一种重同位 素或不稳定同位素标记，(c)洗涤并干燥阵列，(d)通过SIMS检测并计数常见二次离子以及相应的稀有二次离子，其中探针和靶 之间的相互作用数量通过比较从各离散区域、微米孔或纳米孔获得的WR和从对照离散区 域、微米孔或纳米孔或者从其中没有探针和靶之间的特异性相互作用(即待分析样品中不 含有靶)或其中具有未标记的探针和未标记的靶之间的特异性相互作用的离散区域获得 的DIR而定量，(e)比较所述表达谱与标准谱，其中某些生物分子的增多或减少指示了所述治疗 剂的疗效。本发明另一目的是用于监测施用于受试者以治疗疾病的治疗剂的疗效的方法，所 述方法包括(a)使从所述受试者分离的至少一种样品与阵列在使得在阵列上存在的探针与靶 生物分子相互作用的条件下接触，在阵列上存在的探针以至少一种重同位素或不稳定同位 素标记，(b)洗涤并干燥阵列，(c)通过SIMS检测并计数常见二次离子以及相应的稀有二次离子，其中探针和靶 之间的相互作用数量通过比较从各离散区域、微米孔或纳米孔获得的WR和从对照离散区 域、微米孔或纳米孔或者从其中没有探针和靶之间的特异性相互作用(即待分析样品中不 含有靶)或其中具有未标记的探针和未标记的靶之间的特异性相互作用的离散区域获得 的DIR而定量，
(d)从所述样品获得在受试者治疗期间的不同时间至少一种生物分子的表达谱，(e)比较所述表达谱和标准谱，其中已知与所述疾病相关的或在所述疾病中差异 表达的所述生物分子的增多或减少指示了所述用于治疗受试者的治疗剂的疗效。
实施例在下列说明中，根据标准试验方案进行所有试验(未详细说明其试验方案)。下列实施例用于说明本发明的优选的实施方案。本领域技术人员应该理解的是， 在下列实施例中所披露的技术代表了发明人发现在本发明的实施中运作良好的技术，因此 可以被认为构成了其实施的优选模式。但是，在本公开的启示下，本领域技术人员应该理解 的是在不脱离本发明精神和范围的情况下，可对所公开的具体实施方案作出许多改变并得 到相同或相似的结果。试验1此试验显示了 SIMS技术能够定量检测含有同位素标记的蛋白质和不同量的未标 记分子的混合物中13C同位素的比例。同位素标记和稀释同位素标记的分子通常在含有保护剂和防腐剂例如甘油(1 源)和叠氮化钠(14N 源)的缓冲液中提供。这些试剂用于保护透析膜(由Millipore提供)。下列试验的目的 在于确定除去它们所需的透析条件。蛋白质提取自在最低培养基(其中％是唯一可获得的氮)中生长的大肠杆菌。 使用SIMS发现这些蛋白质的同位素分数为97. 8% 士0.02%。将20 μ g的这些标记蛋白在 MiIlipore透析膜上在水中透析6小时，所述MiIlipore透析膜未洗涤或预先洗涤。图3显 示了在透析溶液中15N的同位素分数。洗涤的膜的同位素分数水平与对照的同位素分数水平相似(97.9% 士0.02% )， 但是未洗涤的膜(含有污染物氮)的同位素分数水平较低(92.1% 士 1.4%)。因此，预洗 涤透析膜恢复了初始同位素分数。蛋白质也可提取自在培养基中生长的细菌，在该培养基中1V是唯一可获得的碳。 经SIMS测量，这些蛋白质的同位素分数为86% 士0.5%。然后将这些蛋白质溶于水中，和 将这些蛋白质制成最终浓度为10%甘油的第二溶液。图4显示了这些溶液中1义的同位素 分数。加入甘油将同位素分数降低至78% 士2%，但是通过随后的透析(其除去甘油) 而恢复到初始分数(86% 士2% )。试验2此试验显示同位素标记的寡核苷酸(探针)可使用PCR技术和不含氮化合物(其 作为污染物会干扰在“定义”部分所描述的WR测量)的非常规缓冲液制备。使用硼砂缓冲液减少氮污染引言在生物学中许多方法使用基于三羟甲基氨基甲烷(Tris)的缓冲液。该有机分子 是优秀的缓冲剂，不会导致钙盐或镁盐的沉淀。但是对于本发明方法，Tris具有含14N以及 对DNA(及其它大分子)有强亲和力的缺点。此缺点的发生是因为在依赖于精确测量由1N探针与14N靶的杂交所产生的15N/(14N+15N)比的本发明方法中，14N是重要的污染物。制备不含有污染物氮的DNA有两种方法，i)缓冲液中使用Tris，一旦制得DNA后 便将其除去，或ii)使用不含Tris的缓冲液。由于第一种方法需要使用耗时、费力并且昂 贵的纯化方法，因此申请人采用第二种溶液来提供用于PCR(聚合酶链反应)的合适的pH 和浓度条件。虽然据申请人所知，还没有文献描述将硼砂缓冲液用于PCR，但是申请人使用 了硼砂缓冲液，即不含有氮并且保持了与Tris缓冲液相同的PH值的无机缓冲液。材料和方法PCR 方法
化学物质初始浓度体积最终浓度硼砂缓冲剂0. 08M12. 520mMKClIM2. 550mMMgCl225mM42mMdNTPIOmM20. 8mMTaq聚合酶IU/μ L2. 50. 05U/ μ L引物S100 μ M0. 5ΙμΜ引物AS100 μ M0. 5ΙμΜDNA样品1水24. 5总^^50将来自PML基因的200bp的DNA序列扩增。模板本身仅使用一轮扩增制备(以避 免产生错误)。进行20次PCR循环以定量确定硼砂缓冲液的效果(以及限制产生错误)， 或进行60次循环以消耗限制底物并获得最大的扩增。在的琼脂糖凝胶上通过电泳分析 扩增子。以下显示了 Tris缓冲液和硼砂缓冲液的结果。结果在20次扩增循环的情况下，硼砂缓冲液的产率为Tris缓冲液的一半，并且硼砂缓 冲液明显没有产生不同大小的扩增子。这表示聚合酶继续复制直至模板的末端。在60次 扩增循环的情况下，Tris缓冲液和硼砂缓冲液结果相似。结论硼砂缓冲液非常适合例如PCR扩增的反应，因此适用于寡核苷酸探针的合成。因此该缓冲液可用于避免污染物氮，如本文所提出的SIMS分析所需要的。试验3发明人目前制备了用于SIMS检测的DNA和蛋白质阵列。使用PCR制备了同位 素标记的和未标记的核苷酸探针，以与含有PML基因(其编码早幼粒细胞白血病蛋白) 的部分的DNA杂交。探针序列(298个碱基长)为TGTCTCCAAT ACAACGACAG CCCAGAAGAG GAAGTGCAGCCAGACCCAGT GCCCCAGGAA GGTCATCAAG ATGGAGTCTGAGGAGGGGAA GGAGGCAAGG TTGGCTCGGA GCTCCCCGGAGCAGCCCAGG CCCAGCACCT CCAAGGCAGT CTCACCACCCCACCTGGATG GACCGCCTAG CCCCAGGAGC CCCGTCATAGGAAGTGAGGT CTTCCTGCCC AACAGCAACC ACGTGGCCAGTGGCGCCGGG GAGGCAGAGG AACGCGTTGT GGTGATCAGCAGCTCGGAAG ACTCAGAT(SEQ ID NO :1)。引物为(正向)5 ‘ -TGTCTCCAATACAACGACAGC-3 ‘ (SEQ ID NO :2)，(反向)5 ‘-ATCTGAGTCTTCCGAGCTGCT-3‘ (SEQ ID NO :3)。使用合适化学技术将这些核苷酸探针共价连接到硅片上。其包括如下步骤1)以“piranha”混合物(H2O2 H2SO4 1 3)清洗硅片，以得到含有高浓度表面 羟基的氧化的Si表面。2)将表面羟基与官能化(例如醛封端)的三氯硅烷或三烷氧基硅烷偶联。3)通过将核苷酸探针与此官能化的表面接触而连接核苷酸探针。已经制备了同位素标记的和未标记的抗体探针。它们包括抗-⑶34和抗-网格蛋 白抗体。这些抗体探针通过合适的技术连接到硅片上。例如，首先以蛋白A(已经同位素标 记，参见下文)覆盖硅片的表面，然后加入抗体(蛋白A与其结合)。编码来自金黄色葡萄球菌的蛋白A的氨基酸32-327的基因克隆到质粒中，以产生 组氨酸标签(见下文序列)的N末端融合。以该质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，并在最低 培养基NG-5052 (组成如下)中生长。将25ml细菌培养物在250ml烧瓶中生长，并在18°C 下振摇O20rpm)过夜。将培养物离心(6000g，10分钟，4°C )，细胞团再悬浮于5ml缓冲液 A(50mM Na*P04，300mM NaCl，pH 7.5)中。加入溶菌酶(最终浓度为lmg/ml)，在室温下振 摇该悬浮液30分钟，随后以20%全功率和0. 5秒的脉冲声处理(HD 2200/超声波发生器 MS72)30秒，处理两次。然后通过离心Q0000g，20分钟，4°C )分离细胞溶解产物的可溶和 不可溶的部分。然后将上清液加到预先以10倍体积的缓冲液A平衡的以镍作为平衡离子 的离子交换柱(Chelating HP lml,GE Healthcare)中。然后以20倍体积的缓冲液A洗涤 该柱，再以10倍体积的缓冲液B(与缓冲液A相同，除了其pH为6. 5)洗涤。然后以10倍 体积的缓冲液C(与缓冲液A相同，除了其pH为3)洗脱与离子交换柱结合的融合蛋白。使 用SDS-PAGE以丙烯酰胺梯度(7. 5-16%)分析洗脱液，并使用考马斯蓝(Coomassie Blue)、 硝酸银和抗-His抗体的免疫印迹使蛋白质可视化。在洗脱液中融合蛋白的浓度经测量为 0. 344mg/ml (Bradford法)，经考马斯蓝染色凝胶的光密度分析测定蛋白质纯度为92%。现在使用上述方法使在N-5052 (但使用1N标记的氯化铵代替未标记的氯化铵) 中生长的融合蛋白以1N标记。
NG一5052培养基的组成
一Na，HPO。
50mM
一KH，P。。
50mM
一NH。CI50mM
一Na，SO。
5mM
一MgSO。2mM
一痕量金属lX
] 一甘油0．5％(w／v)
一葡萄糖0．05％(w／v)
NG一5052培养基
“痕量金属”溶液5000x的组成
FeCl。50lnM
CaCl．20lnM
MnC]，10mM
ZnSO。lOmM
蛋白A融合蛋白的序列
MGSSHHHHHHSSGPAANAAQHDEAQQNAFYQVLNMPNLNADQRNGF
NMPNLNEAQRNGF工QSLKDDPSQSTNVLGEAKKLNESQAPKADNNFNK
EQQNAFYEILNMPNLNEEQRNGF工QSLKDDPSQSANLLSEAKKLNESQA
AKKLNDAQAPKADNKFNKEQQNAFYE工LHLPNLTEEQRNGF工QSLKDD
PSVSKE工LAEAKKLNDAQAPK(SEQ工D NO4)[02403 通过SIMS分析探针一靶的缔合，并比较SIMS技术和标准的荧光技术。
权利要求
1.一种阵列，包含具有导电表面的基本为平面的基底和多个离散区域，所述多个离散 区域含有以至少一种稀有的、稳定或不稳定的同位素或外源同位素标记的探针。
2.根据权利要求1所述的阵列，其中所述具有导电表面的基本为平面的基底为硅片。
3.根据权利要求1或2所述的阵列，其中所述探针以至少一种选自咕、1^、1^、1^、18… 33S、34S和 的稳定的重同位素标记，或者以至少一种选自咕和14C的不稳定的同位素标记， 或者以至少一种选自79Br和inBr的外源同位素标记。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的阵列，其中所述阵列是微阵列，其中各离散区域 长度、宽度或直径尺寸之一为1 μ m至1000 μ m。
5.根据权利要求4所述的阵列，其中各离散区域是包含探针的微米孔，所述探针以至 少一种稀有的、稳定或不稳定的同位素或外源同位素标记。
6.根据权利要求1-3中任一项所述的阵列，其中所述阵列是纳米阵列，其中各离散区 域长度、宽度或直径尺寸之一为Inm至lOOOnm。
7.根据权利要求6所述的阵列，其中各离散区域是包含探针的纳米孔，所述探针以至 少一种稀有的、稳定或不稳定的同位素或外源同位素标记。
8.根据权利要求5所述的阵列，其中各微米孔包含多个纳米孔，且所述纳米孔包含以 至少一种稀有的、稳定或不稳定的同位素或外源同位素标记的探针。
9.一种检测和定量至少一种样品中至少一种生物分子存在或不存在的方法，包括(a)使所述至少一种样品与根据权利要求1-8中任一项所述的阵列接触，(b)洗涤并干燥所述阵列，(c)通过SIMS检测和计数常见二次离子以及相应的稀有二次离子。
10.根据权利要求9所述的方法，其中将各待测样品与所述阵列的一个或多个离散区 域接触。
11.根据权利要求9或10所述的方法，其中所述待测样品是单个细胞。
12.根据权利要求9-11中任一项所述的方法，所述方法用于测定测试样品的分子图 谱，其中所述分子图谱确定所述样品的转录组、蛋白质组、脂质组、代谢组、糖组和/或相互 作用组。
13.根据权利要求9-11任一项所述的方法，所述方法用于在需要的受试者中预测疾病 的倾向，或用于诊断疾病。
14.根据权利要求9-11中任一项所述的方法，所述方法用于监测施用于受试者以治疗 疾病的治疗剂的疗效。
15.根据权利要求9-11中任一项所述的方法，所述方法用于筛选治疗剂。
全文摘要
本发明涉及使用SIMS技术检测和定量样品中多种生物分子的存在或不存在的方法，以及所述方法中所使用的阵列。
文档编号G01N33/68GK102066942SQ200980115791
公开日2011年5月18日 申请日期2009年3月12日 优先权日2008年3月12日
发明者卡米耶·里波尔, 安东尼·德洛纳, 格拉迪米尔·米舍维奇, 纪尧姆·勒让, 维克托·诺里斯 申请人:鲁昂大学