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专利名称：香精香料中香豆素和黄樟素含量的测定方法
技术领域：
本发明涉及一种香精香料中香豆素和黄樟素含量的測定方法，尤其涉及一种烟用香精香料中香豆素和黄樟素含量的测定方法。
背景技术：
有文献报道香豆素和黄樟素作用于人体会弓I起肿瘤，国际肿瘤中心已确认黄樟素有致癌作用，早在1954年美国食品药品管理局就禁止在食品中添加香豆素，世界各国均禁止使用黄樟素。香豆素、黄樟素在无水こ醇等有机溶剂中均有较好的溶解度。烟用香精香料溶剂多为有机溶剂，香豆素和黄樟素可能会随着提取的植物成分进入到烟用香精香料中，因此有必要开发ー种简便、稳定、准确的測定香豆素和黄樟素的方法来保障烟产品的安全。目前报道的香豆素和黄樟素检测方法主要有高效液相色谱法、液相色谱-质谱法、气相色谱法、气相色谱-质谱法、毛细管电色谱法、毛细管电泳法、微分脉冲伏安法等。这其中液相色谱-质谱法及气相色谱-质谱法更灵敏、快捷，不过随着不断研究总结，还可以在此基础 上发展更简便、准确、灵敏、适合企业实用的香豆素、黄樟素检测方法。

发明内容
本发明的目的就是提供ー种更快速、简便、灵敏、准确的香精香料中香豆素和黄樟素含量的測定方法。内标甲基丁香酚物理化学性质、色谱行为和相应特征与香豆素、黄樟素更相近。萃取液色谱纯级无水こ醇纯度高、污染少，能较完全萃取香精香料中香豆素和黄樟素。此方法溶液配制简便，最大限度减少带入色谱中除样品外的化学物质，延长衬管、色谱柱使用寿命。此方法简便易行，结果准确，溶液配制简单，对气质连用仪消耗少，图谱干净，可得到良好的分离效果和理想的色谱峰型，适合烟用香精香料企业及相关机构大批量检測。一种香精香料中香豆素和黄樟素含量的測定方法，包括以下步骤
I)萃取液无水こ醇。2)内标溶液的配制在无水こ醇中加入甲基丁香酚，配制浓度为10mg/ml的内标储备液，置于4°C下保存，有效期3个月，使用时再用内标储备液稀释1000倍，配制成浓度为10 μ g/ml的内标溶液。3)标准工作溶液的配制取香豆素O. Ig,黄樟素O. Olg,精确至O. OOOlg,以无水こ醇定容至IOOml,得到香豆素和黄樟素混合储备液,浓度分别为lmg/ml,0. lmg/ml,置于4°C下保存，有效期3个月，将混合储备液逐级稀释配制含香豆素和黄樟素的标准工作液。4)标准工作曲线绘制对配制的标准工作溶液进行气相色谱和质谱选择离子测定，进样量1μ 1，计算每个标准工作溶液中香豆素、黄樟素与内标的峰面积比。以峰面积比为纵坐标，以香豆素、黄樟素质量为横坐标，绘制过原点标准工作曲线，得出回归方程，相关系数R2きO. 999。5)样品的处理称取I. Og烟用香精香料于50ml三角瓶中，取5ml甲基丁香酚内标溶液溶解，振荡，静置，取上层清液，经过滤，得到待测样品溶液。6)样品的測定取O. 5ml I. Oml待测样于气质联用仪进样瓶中，选择甲基丁香酚、香豆素和黄樟素质荷比m/z分别为178、146、162的离子进行定量分析，使用内标法绘制标准工作曲线，试样与标准工作曲线拟合，得出试样香豆素和黄樟素含量。7)结果的计算与表述样品中的香豆素、黄樟素的含量(W)由下式计算得出 ff=M/m
式中W—样品中香豆素、黄樟素的含量，单位为mg/kg。M—根据计算结果，从标准工作曲线上读取的样品溶液中香豆素、黄樟素的量，单位为mg。m—样品的质量，单位为kg。·无水こ醇为美国Fisher公司产HPLC Grade A995-4。在步骤3)中，将混合储备液中香 素溶度逐级稀释成O. 5 μ g/ml，I U g/ml, 2μ g/ml, 5 μ g/ml, 10 μ g/ml, 20 μ g/ml, 40 μ g/ml, 7个不同浓度水平,贝U这7级混合标准工作溶液中黄樟素浓度水平分别为O. 05 μ g/ml,O. I μ g/ml,O. 2 μ g/ml,0.5 μ g/ml, Iμ g/ml, 2 μ g/ml, 4 μ g/ml。从这7级混合标准工作溶液中分别移取lml,各加入甲基丁香酚内标溶液5ml，摇匀，用直径O. 45 μ m有机微孔滤膜过滤，制备7级加内标标准工作溶液，进样后制定标准工作曲线。在步骤5)中，难溶于こ醇的样品可在水浴超声波中超声lOmin，静置时可用离心机加速分层，过滤时用直径O. 45 μ m有机微孔滤膜。在步骤6)中，气质联用仪的色谱条件使用安捷伦公司型号为HP-INNOWAX的色谱柱(柱长30m，内径O. 25m，膜厚O. 25 μ m，固定相为聚こニ醇)，载气为高纯氦(き99. 999%)，柱流速为l.Oml/min恒流，进样量为I μ 1，分流进样，分流比为10:1，进样ロ温度为250°C，程序升温为柱初始温度100°C，保持5min，以5°C /min的速率升至140°C，保持5min，然后以IO0C /min的速率升至240°C，保持7min.。气质联用仪的质谱条件传输线温度为260°C，离子源温度为230°C，四极杆温度为150°C，电离能量为70eV，溶剂延迟lOmin，全扫描时间范围为10min_35min，定量使用选择离子模式，通过选择特征离子进行定量黄樟素的质荷比m/z 162，甲基丁香酚的质荷比m/z 178，香豆素的质荷比m/z 146。以标准样品的保留时间和检测离子丰度定性黄樟素m/zl31/162 约等于 40%,扫描时段 10. OOmin-19. OOmin ;甲基丁香酚 m/zl47/178 约等于30%，扫描时段 19. OO min—24. OO min ;香豆素 m/zll8/146 约等于 110%，扫描时段 24min—34. OOmin0
本发明以编号为17573(未检测出黄樟素)的样品为对象，加5mg/kg浓度的香豆素和5mg/kg浓度的黄樟素,做回收率和相对标准偏差实验,平行测定6次,结果如表
Io表I方法的回收率和相对标准偏差。
权利要求
1.一种香精香料中香豆素和黄樟素含量的測定方法，包括以下步骤 1)萃取液无水こ醇； 2)内标溶液的配制在无水こ醇中加入甲基丁香酚，配制浓度为10mg/ml的内标储备液，置于4°C下保存，有效期3个月，使用时再将内标储备液稀释1000倍，配制成浓度为10 μ g/ml的内标溶液； 3)标准工作溶液的配制取香豆素O.lg，黄樟素O. Olg,精确至O. OOOlg,以无水こ醇定容至100ml，得到香豆素和黄樟素混合储备液，浓度分别为lmg/ml，0. lmg/ml，置于4°C下保存，有效期3个月，将混合储备液逐级稀释配制含香豆素和黄樟素的标准工作液； 4)标准工作曲线绘制对配制的标准工作溶液进行气相色谱和质谱选择离子測定，进样量I μ 1，计算每个标准工作溶液中香豆素、黄樟素与内标的峰面积比，以峰面积比为纵坐标，以香豆素、黄樟素质量为横坐标，绘制过原点标准工作曲线，得出回归方程，相关系数R2 き O. 999 ； 5)样品的处理称取I.Og烟用香精香料于50ml三角瓶中，用5ml甲基丁香酚内标溶液溶解，振荡，静置，取上层清液，经过滤，得到待测样品溶液； 6)样品的測定取O.5ml I. Oml待测样品溶液于气质联用仪进样瓶中，选择甲基丁香酚、香豆素和黄樟素质荷比m/z分别为178、146、162的离子进行定量分析，使用内标法绘制标准工作曲线，试样与标准工作曲线拟合，得出试样香豆素和黄樟素含量； 7)结果的计算与表述样品中的香豆素、黄樟素的含量(W)由下式计算得出 W=M/m，式中W—样品中香豆素、黄樟素的含量，单位为mg/kg，M—根据计算结果，从标准工作曲线上读取的样品溶液中香豆素、黄樟素的量，单位为mg，m—祥品的质量，单位为kg ο
2.根据权利要求I所述的香精香料中香豆素和黄樟素含量的测定方法，其特征在于无水こ醇为美国Fisher公司产HPLC Grade A995-4。
3.根据权利要求I所述的香精香料中香豆素和黄樟素含量的测定方法，其特征在于在步骤3)中,将混合储备液中香豆素溶度逐级稀释成O. 5 μ g/ml, I μ g/ml ,2 μ g/ml, 5μ g/ml, 10 μ g/ml, 20 μ g/ml, 40 μ g/ml, 7个不同浓度水平,贝U这7级混合标准工作溶液中黄樟素浓度水平分别为 O. 05 μ g/ml, O. I μ g/ml, O. 2 μ g/ml, 0. 5 μ g/ml, I μ g/ml, 2μ g/ml,4 μ g/ml，从这7级浓度的标准工作溶液中分别移取1ml，各加入甲基丁香酚内标溶液5ml，摇匀，用直径O. 45 μ m有机微孔滤膜过滤，制备7级加内标标准工作溶液，进样后制定标准工作曲线。
4.根据权利要求I所述的香精香料中香豆素和黄樟素含量的测定方法，其特征在于在步骤5)中，难溶于こ醇的样品可在水浴超声波中超声lOmin，静置时可用离心机加速分层，过滤时用直径O. 45 μ m有机微孔滤膜。
5.根据权利要求I所述的香精香料中香豆素和黄樟素含量的测定方法，其特征在于在步骤6)中，气质联用仪的色谱条件使用安捷伦公司型号为HP-INNOWAX的色谱柱，载气为高纯氦，柱流速为l.Oml/min恒流，进样量为I μ 1，分流进样，分流比为10:1，进样ロ温度为250°C，程序升温为柱初始温度100°C，保持5min，以5°C /min的速率升至140°C，保持5min,然后以10°C /min的速率升至240°C,保持7min.,气质联用仪的质谱条件传输线温度为260°C，离子源温度为230°C，四极杆温度为150°C，电离能量为70eV，溶剂延迟lOmin，全扫描时间范围为10min-35min，定量使用选择离子模式，通过选择特征离子进行定量黄樟素的质荷比m/z 162，甲基丁香酚的质荷比m/z 178，香豆素的质荷比m/z 146，以标准样 品的保留时间和检测离子丰度定性黄樟素m/zl31/162约等于40%，扫描时段10. OOmin—19. OOmin ;甲基丁香酚m/zl47/178约等于30%，扫描时段19. 00 min—24. 00 min ;香豆素 m/zll8/146 约等于 110%，扫描时段 24min — 34. OOmin0
全文摘要
本发明提供一种香精香料中香豆素和黄樟素含量的测定方法。用加有甲基丁香酚内标的无水乙醇溶液稀释样品，样品过滤后使用气相色谱/质谱选择离子法测定稀释后样品中香豆素和黄樟素的含量。以保留时间和监测离子丰度定性，通过选择特征离子进行定量，甲基丁香酚、香豆素、黄樟素的定量离子在质谱图中的m/z分别为178、146、162。以内标法绘制标准曲线，测定样品溶液，由标准曲线计算得出稀释样品中香豆素、黄樟素的量，进而可得出原样品中香豆素、黄樟素的含量。实践证明，此方法不仅简便易行，且能最大程度萃取烟用添加剂中的香豆素和黄樟素，图谱干净，可得到良好的分离效果和理想的色谱峰型，对气相色谱和质谱污染小。
文档编号G01N30/88GK102854278SQ201210332468
公开日2013年1月2日 申请日期2012年9月11日 优先权日2012年9月11日
发明者黎小云, 邵雪莲, 奚景梁, 黄瑞标, 张露, 孙斌 申请人:鹰潭华宝香精香料有限公司